Биотехнология в медицине

В медицине биотехнологические приемы и методы играют ведущую роль при создании новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, предназначенных для ранней диагностики и лечения различных заболеваний. Антибиотики - самый большой класс фармацевтических соединений, получение которых осуществляется с помощью микробиологического синтеза. Созданы генноинженерные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток млекопитающих и насекомых, используемые для получения ростового гормона, инсулина и интерферона человека, различных ферментов и противовирусных вакцин. Изменяя нуклеотидную последовательность в генах, кодирующих соответствующие белки, оптимизируют структуру ферментов, гормонов и антигенов (так наз. белковая инженерия). Важнейшим открытием явилась разработанная в 1975 Г. Келером и С. Мильштейном техника использования гибридом для получения моноклональных антител желаемой специфичности. Моноклональные антитела используют как уникальные реагенты, для диагностики и лечения различных заболеваний.

Биотехнология в сельском хозяйстве

Вклад биотехнологии в сельскохозяйственное производство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений и животных и разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Во многих странах методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые к вредителям, болезням, гербицидам сорта сельскохозяйственных растений. Разработана техника оздоровления растений от накопленных инфекций, что особенно важно для вегетативно размножаемых культур (картофель и др.). Как одна из важнейших проблем биотехнологии во всем мире широко исследуется возможность управления процессом азотфиксации, в том числе возможность введения генов азотфиксации в геном полезных растений, а также процессом фотосинтеза. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков. Разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты растений от болезней и вредителей, бактериальные удобрения. Генноинженерные вакцины, сыворотки, моноклональные антитела используют для профилактики, диагностики и терапии основных болезней сельскохозяйственных животных. В создании более эффективных технологий племенного дела применяют генноинженерный гормон роста, а также технику трансплантации и микроманипуляций на эмбрионах домашних животных. Для повышения продуктивности животных используют кормовой белок, полученный микробиологическим синтезом.

Биотехнология в производстве

Биотехнологические процессы с использованием микроорганизмов и ферментов уже на современном техническом уровне широко применяют в пищевой промышленности. Промышленное выращивание микроорганизмов, растительных и животных клеток используют для получения многих ценных соединений - ферментов, гормонов, аминокислот, витаминов, антибиотиков, метанола, органических кислот (уксусной, лимонной, молочной) и т. д. С помощью микроорганизмов проводят биотрансформацию одних органических соединений в другие (например, сорбита во фруктозу). Широкое применение в различных производствах получили иммобилизованные ферменты. Для выделения биологически активных веществ из сложных смесей используют моноклональные антитела. А. С. Спириным в 1985-88 разработаны принципы бесклеточного синтеза белка, когда вместо клеток применяются специальные биореакторы, содержащие необходимый набор очищенных клеточных компонентов. Этот метод позволяет получать разные типы белков и может быть эффективным в производстве. Многие промышленные технологии заменяются технологиями, использующими ферменты и микроорганизмы. Таковы биотехнологические методы переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, очистки и использования сточных вод для получения биогаза и удобрений. В ряде стран с помощью микроорганизмов получают этиловый спирт, который используют как горючее для автомобилей (в Бразилии, где топливный спирт широко применяется, его получают из сахарного тростника и других растений). На способности различных бактерий переводить металлы в растворимые соединения или накапливать их в себе основано извлечение многих металлов из бедных руд или сточных вод.

Биотехнологический процесс

В начале 70-х годов традиционная биотехнология как научная дисциплина была не слишком известна; исследования в этой области в основном проводились и отделах инженерной химии и иногда в рамках социальных микробиологических программ. В широком смысле биотехнология занимается производством коммерческих продуктов, образуемых микроорганизмами в результате их жизнедеятельности. Более формально биотехнологию можно определить как "применение научных и инженерных принципов к переработке материалов живыми организмами с целью создания товаров и услуг". В историческом смысле биотехнология возникла тогда, когда дрожжи были оперные использованы при производстве пива, а бактерии - для получения йогурта.

Термин "биотехнология" был придуман в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки для описания процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология - это "все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты". Однако это совершенно точное определение не получило широкого распространения. Долгое время термин "биотехнология" относился к двум очень разным дисциплинам. С одной стороны, его употребляли, говоря о промышленной ферментации, с другой - применительно к той области, которая сейчас называется эргономикой. Такой двойственности пришел конец в 1961 г., когда шведский микробиолог Карл Гёрен Хеден порекомендовала изменить название научного журнала "Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology" ("Журнал микробиологической и химической инженерии и технологии"), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиологии и промышленной ферментации, на "Biotechnology and Bioengineering'' ("Биотехнология и биоинженерия"). С этого момента биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области "промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов".

Промышленный биотехнологический процесс, в котором для производства коммерческих продуктов используются микроорганизмы, обычно состоит из трех ключевых этапов

1. Исходная обработка: обработка сырья таким образом, чтобы его можно было использовать как источник питательных веществ для микроорганизма-мишени.

2. Ферментация и биотрансформация; рост микроорганизма-мишени в большом (обычно более 100 л) биореакторе (ферментация) с последующим образованием нужного метаболита, например антибиотика, аминокислоты или белка (биотрансформация).

3. Конечная обработка: очистка нужного вещества от компонентов культуральной среды или от клеточной массы.

Цели и задачи биотехнологии

Биотехнологические направления имеют своей целью создание и практическое внедрение (т. е. практическое использование):

новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов, используемых в здравоохранении для диагностики, профилактики и лечения различных заболеваний;

биологических средств защиты сельскохозяйственных растений от возбудителей заболеваний и вредителей, бактериальных удобрений и регуляторов роста растений и животных; новых сортов растений, устойчивых к разного рода неблагоприятным воздействиям (факторам внешней среды); новых пород животных с полезными свойствами (трансгенные животные);

ценных кормовых добавок для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных (кормового белка, аминокислот, витаминов, ферментов, способствующих повышению усвояемости кормов, и т. п.);

новых биоинженерных методов для получения высокоэффективных препаратов различного назначения, используемых в сельском хозяйстве и ветеринарии;

новых технологий создания и получения хозяйственно ценных продуктов для пищевой, химической и микробиологической промышленности;

эффективных технологий переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов для получения продуктов, которые могут использоваться в других отраслях хозяйственной деятельности человека (например, биогаза, удобрений, топлива для автомобилей и т. п.).

Само собой разумеется, что такие комплексные задачи требуют интеграции различных отраслей научных и технических знаний и характеризуют биотехнологию как ряд перспективных технологий, которые найдут применение в самых разнообразных индустриальных направлениях. Интеграция биологии, химии и инженерных приемов в биотехнологии осуществляется таким путем, чтобы обеспечить максимальное использование потенциальных возможностей всех входящих в нее областей знаний. И все же, несмотря на комплексность биотехнологии, ее нельзя рассматривать как нечто единое целое, наподобие микроэлектроники. Скорее она должна рассматриваться как ряд перспективных технологий, сочетания которых будут постоянно варьировать в зависимости от конкретных практических задач.

Биотехнология - междисциплинарная область научно-технического прогресса, возникшая на стыке биологических, химических и технических знаний и призванная к созданию новых биотехнологических процессов, которые в большинстве случаев будут осуществляться при низких температурах, требовать небольшого (меньшего) количества энергии и будут базироваться преимущественно на дешевых субстратах, используемых в качестве первичного сырья.

Молекулярная биотехнология использует достижения многих областей науки и позволяет создавать широкий ассортимент коммерческих продуктов и методов [2, 45].

Основные этапы развития биотехнологии

В настоящий момент вряд ли у кого-нибудь может возникнуть сомнение в том, что современная биология представляет собой наиболее разнообразную область естественных наук. Действительно, она включает на первый взгляд, совершенно не связанные между собой разделы научных знаний: микробиологию, анатомию растений и животных, биохимию, иммунологию, клеточную биологию, физиологию растений и животных, различные систематики, экологию, генетику, биофизику, математику и много других областей естествознания.

Постоянно увеличивающееся разнообразие современной биологии началось после окончания второй мировой войны, когда в биологию внедрились другие естественнонаучные дисциплины, такие как физика, химия и математика, которые сделали возможным описание жизненных процессов на новом качественном уровне - на уровне клетки и молекулярных взаимодействий.

Следует отдавать себе отчет в том, что биотехнология не является чем-то новым, ранее не известным, а представляет собой развитие и расширение набора технологических приемов, корни которых появились тысячи лет тому назад.

Биотехнология включает многие традиционные процессы, давно известные и давно используемые человеком. Это пивоварение, хлебопечение, изготовление вина, производство сыра, приготовление многих восточных пряных соусов, а также разнообразные способы утилизации отходов. Во всех перечисленных процессах использовались биологические объекты (пусть даже без достаточных знаний о них), и все эти процессы на протяжении многих лет совершенствовались, правда, эмпирически. Начало этого этапа биотехнологии теряется в глубине веков, и он продолжался примерно до конца XIX в [2, 57].

История биотехнологии до XX века

·                   8 тыс. лет до н. э. - первые опыты культивации растений.

·                   4 - 2 тыс. лет до н. э. - биотехнологические подходы впервые используются для изготовления хлеба и пива (Египет), ферментации сыра (Шумер, Китай и Египет) и т.д.

·                   500 лет до н. э. - в Китае впервые использован антибиотик (плесень на соевых бобах применялась для обезболивания), а примерно в 100 году н. э. также в Китае впервые использован инсектицид (высушенные и измельченные в мельчайший порошок лепестки хризантемы применялись, чтобы отпугивать мух и комаров).

·                   1322 год - на территории Аравии впервые использовано искусственное осеменение для селекции арабских скакунов.

·                   1761 год - немецкий ученый Йозеф Келретер проводит первые опыты по селекции растений.

·                   1797 год - британский врач Эдвард Дженнер проводит первую вакцинацию против оспы.

·                   1830 год - открыт белок, 1833 год - открыты ферменты.

·                   1857 год - французский биолог Луи Пастер предполагает, что ферментацию проводят микробы, 1859 год - Чарльз Дарвин публикует книгу "Происхождение видов и естественный отбор", в котором разработана теория эволюции.

·                   1865 год - чешский монах Иоганн Грегор Мендель разрабатывает основы науки, в будущем названной генетикой.

·                   Идеи Дарвина и Менделя дали толчок бурному развитию биотехнологий. В 1870-1890-х годах начинается массовое создание гибридов сельскохозяйственных растений, что позволило создать тысячи новых сортов.

Работы великого французского ученого Луи Пастера (1822-1895) заложили фундамент практического использования достижений микробиологии и биохимии в традиционных биотехнологиях (пивоварение, виноделие, производство уксуса) и ознаменовали начало нового, научного периода развития биотехнологии. Для этого периода характерно развитие промышленной биотехнологии, в особенности ферментационных процессов в промышленных масштабах. Были разработаны стерильные процессы производства путем ферментации ацетона, глицерина. Интенсивно изучаются основные группы микроорганизмов - возбудителей процессов брожения, исследуются биохимические особенности данных процессов.

Основные этапы развития биотехнологии связаны с достижениями в молекулярной биологии, представлеными ниже [3, 90].

Таблица История развития молекулярной биотехнологии в ХХ веке

Более подробно о нескольких событиях, заложивших основы развития биотехнологии

Именно существенные успехи в фундаментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной генетики и молекулярной биологии, достигнутые во второй половине текущего столетия, создали реальные предпосылки управления различными (пусть, возможно, и не самыми главными) механизмами жизнедеятельности клетки. Сложившаяся благоприятная ситуация в биологии явилась мощным толчком в развитии современной биотехнологии, весьма важной области практического приложения результатов фундаментальных наук. Можно с уверенностью утверждать, что биотехнология является наиболее разительным примером того, как результаты, казалось бы "чистой науки ", находят применение в практической деятельности человека. Основой, обеспечивающей благоприятную ситуацию для бурного развития биотехнологии, явились революционные открытия и разработки:

·                   Доказательства роли нуклеиновых кислот в хранении и передаче наследственной информации в биологических системах (имеются в виду индивидуальные клетки и отдельные организмы, а не их популяции);

·                   Расшифровка универсального для всех живых организмов генетического кода;

·                   Раскрытие механизмов регуляции функционирования генов в процессе жизни одного поколения организмов;

·                   Совершенствование существовавших и разработка новых технологий культивирования микроорганизмов, клеток растений и животных; как логическое следствие из вышесказанного, явилось создание (возникновение) и бурное развитие методов генетической и клеточной инженерии, с помощью которых искусственно создаются новые высокопродуктивные формы организмов, пригодные для использования в промышленных масштабах.

·                   Расшифровка генома человека.

·                   Абсолютно новым направлением является так называемая инженерная энзимология, возникшая вследствие развития современных методов изучения структуры и синтеза белков-ферментов и выяснения механизмов функционирования и регуляции активности этих соединений (важных элементов клетки). Достижения в этой области позволяют направленно модифицировать белки различной сложности и специфичности функционирования, разрабатывать создание мощных катализаторов промышленно ценных реакций с помощью высоко стабилизированных иммобилизованных ферментов.

Все эти достижения вывели биотехнологию на новый уровень ее развития, позволяющий сознательно и целенаправленно управлять сложными клеточными процессами. Данная новая область биологических знаний и ее последние достижения уже стали крайне важными для здоровья и благополучия человека [4, 70].

Определение роли ДНК

Первые данные о химических свойствах ДНК появились в 1868 г. К началу 40-х годов XX в. Было установлено, что молекула ДНК - это линейный полимер. Его мономерными единицами являются нуклеотиды, состоящие из азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и фосфатной группы.

Носитель генетической информации должен удовлетворять двум основным требованиям: воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точностью и детерминировать (кодировать) синтез белковых молекул. Модель ДНК Уотсона-Крика полностью отвечает этим требованиям. Во-первых, согласно принципу комплементарности, каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Следовательно, после одного раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из которых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК. Во-вторых, нуклеотидная последовательность структурного гена однозначно задает аминокислотную последовательность кодируемого ею белка.

Определение структуры  дезоксирибонуклеиновой кислоты

Выяснение молекулярной структуры генетического материала -ДНК - без сомнения стало одним из самых замечательных научных достижений XX в. Уотсон и Крик описали свое открытие так: "Мы хотим предложить структуру соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Эта структура обладает весьма необычными свойствами представляющими большой биологический интерес. Она образована двумя спиральными цепочками, закрученными вокруг общей оси. Обе спирали правые, но последовательности атомов в них взаимно противоположны. Весьма интересен способ, с помощью которого цепочки удерживаются вместе. Пуриновые и пиримидиновые основания образуют пары, при этом пуриновое основание одной цели соединяется водородными связями с пиримидиновым основанием другой. Если одно из оснований пары - это аденин, то вторым основанием должен быть тимин; то же самое относится к гуанину и цитозину. Последовательность оснований в полинуклеотидной цепи может быть любой. Очень важно, что из предложенного нами механизма специфического спаривания непосредственно вытекает возможность копирования генетического материала". В следующей статье, опубликованной несколькими месяцами позже (Nature 171: 964, 1953), Уотсон и Крик уточняют: "Сахарофосфатный остов в нашей модели абсолютно постоянен, но в эту структуру может вписаться любая последовательность пар нуклеотидов.

В длинной молекуле возможно безграничное число перестановок, и нам кажется вполне вероятным, что точная последовательность оснований содержит в закодированном виде генетическую информацию. Наша модель дает объяснение многим феноменам. Например, спонтанная мутация может возникнуть в результате случайного перехода одного из оснований в редкую таутомерную форму, а образование пар гомологичных хромосом при мейозе может обусловливаться специфическим спариванием оснований".

За десять лет, прошедших после обнародования теории двойной спирали ДНК и принципа комплементарности, раскрыты молекулярные механизмы репликации ДНК; установлены процессы, отвечаюшие за расшифровку генетической информации и регуляцию синтеза генных продуктов; выяснены многие причины, по которым эти продукты синтезируются в измененном виде. Со времени выхода в свет этой публикации и до наших дней открытие Уотсона и Крика нисколько не утратило своего значения, В частности, если бы не была установлена структура ДНК, сейчас не существовало бы технологии рекомбинантньгх ДНК [4, 81].

Первое трансгенное животное – мышь

Существует несколько способов получения трансгенных животных:

                  I. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов.

Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион ("суррогатные" матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышат, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний.

               II. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций.

Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской про нуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в "суррогатную" мать, которая производит на свет трансгенных мышат - основателей трансгенных линий.

            III. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых (ES) клеток.

ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, культивируют и идентифицируют транс-фицированные клетки методом позитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицирован-ных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку "суррогатных" матерей. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей [5, 92].

Генетические карты

Бурное развитие молекулярной генетики человека, начавшееся в 1980-х гг., стало возможным благодаря новаторским идеям Д. Ботштейна, Р. Уайта, М. Сколника и С. Дэвиса. Они обратили внимание, что полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) человека порождает полиморфные аллели (маркерные локусы), поддающиеся картированию.

Как писали авторы в своей статье, "мы хотим предложить новый способ построения генетической карты сиепления человека, В его основе лежит создание при помощи технологии рекомбинантных ДНК случайных однокопийных ДНК-зондов, способных выявлять полиморфные нуклеотидные последовательности при гибридизации с индивидуальными ДНК, обработанными рестриктазой". Более того, они осознали, что, используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хро- мосомную локализацию этого гена. Эта идея не была высказана ими прямо, но она непосредственно вытекала из их концепции, Ботштейн и др, пришли к абсолютно верному выводу: "Применение набора зондов, специфичных в отношении полиморфных участков ДНК, для анализа ДНК членов родословных с большим числом поколений откроет новые горизонты в генетике человека".

К 1992 г, на разных хромосомах человека были идентифицированы и картированы сотни ПДРФ- маркеров. С их помощью были изолированы гены таких наследственных заболеваний, как миодистрофия Дюшенна и муковисцидоз. К сожалению, выcокополиморфные локусы расположены на разных хромосомах человека неравномерно и не всегда на близком расстоянии друг от друга. Кроме того, ПДРФ-анализ, основанный на гибридизации зонда с рестрицированной ДНК, весьма трудоемок и часто дает ошибочные результаты. Все эти проблемы удалось решить, когда Вебер и Мэй обнаружили, что по всему геному человека разбросано множество высокополиморфных ди-, три- и тетрануклеотидных повторов (коротких тандемных повторов; STS, от англ, short tandem repeats), вариации которых легко различаются при помощи ПЦР, Как писали авторы, "...данный тип полиморфных последовательностей, вероятно, найдет широкое применение при изучении многих генов наследственных заболеваний и позволит значительно увеличить разрешение генетических карт человека", STR, особенно динуклеотидные тандемные повторы, эффективны как маркеры; в этом качестве они уже вытеснили ПДРФ-локусы и в настоящее время используются для построения подробных генетических карт всех хромосом человека [3, 124].

Овечка Долли

Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G0), и. возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.

Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, - это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных организмов станет почти рутинной процедурой.

Описание метода клонирования овцы методом переноса ядра: Ядро яйцеклетки удаляют с помощью микропипетки. Культивируют эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи и индуцируют их переход в фазу G0. Осуществляют слияние клеток в G0-фазе и яйцеклеток, лишенных ядра, и выращивают восстановленные яйцеклетки в культуре или в яйцеводе с наложенной лигатурой до ранних стадий эмбриогенеза, а затем имплантируют их в матку "суррогатной" матери, где и происходит дальнейшее развитие. В эксперименте, описанном Уилмутом и др. (Wilmut et al., 1997), было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе G0; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода.

Заключение

Главная причина успехов биотехнологии кроется в разительных успехах и быстром прогрессе молекулярной биологии, в частности, в разработке технологии рекомбинантных молекул ДНК. С помощью этой технологии оказалось возможным непосредственно манипулировать с наследственным материалом клеток, получая новые сочетания полезных признаков и способностей. Возможности этих технических приемов, которые впервые были разработаны в лабораториях, вскоре оказались вполне приемлемыми в промышленных условиях. Однако, несмотря на определенные, а порой и весьма значительные выгоды, которые несет технология рекомбинантных молекул, постоянно следует учитывать возможные опасности, связанные с вмешательством человека в природу.

Ни для кого уже не является секретом, что ископаемое топливо (хотя и добываемое в настоящее время с большим избытком), а также другие невосполняемые ресурсы, в один прекрасный день станут крайне ограниченными. И совершенно естественно, что данное обстоятельство уже сейчас заставляет искать новые, более дешевые и лучше сохраняемые источники энергии и питания, которые могли бы восполняться биотехнологическим путем. В этой ситуации страны с климатом, позволяющим ежегодно производить большие количества биомассы, будут находиться в более выгодных условиях по сравнению со странами с менее благоприятными климатическими условиями.

Следующим фактором, способствующим росту интереса к биотехнологии, является современный мировой спад в химических и инженерных направлениях, обусловленный частичным истощением источников энергии. И есть основания полагать, что 2000-е годы станут эрой биотехнологии. Во всяком случае, в мире отмечается существенный подъем исследований в области молекулярной биологии, возникновение новых биотехнологических компаний, увеличение инвестиций в биотехнологические отрасли промышленности (как национальными компаниями, так и отдельными лицами), а также рост фундаментальных знаний.

Литература

1.                Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир, 2002, 590стр.

2.                Евтушенков А.Н., Фомичев Ю.К. Введение в биотехнологию: Курс лекций. Мн.:БГУ, 2002. - 105 стр.

3.                D. Botstein, R. L. Whire, M. Skolnick, R. W. Davis Am. J.

Построение генетической карты сцепления человека с помощью метода, основанного на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов - Human Genetics. 32; 1980, 314-331 стр.

4.                J. L. Weber, Р. Е, May Am. J. Часто встречающиеся типы полиморфизма у человека, которые можно типировать с помощью полимеразной цепной реакции - Human Genetics.44; 1989, 388-396стр.

5.                Проблемы и перспективы биотехнологии Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Высшая школа; 1987; 159стр.