Содержание

Введение. 3

1. Генная инженерия растений: общие понятия. 4

2. Методы генной инженерии. 5

3. Генетическая  рекомбинация in vitro. 11

4. Методы введения ДНК в бактериальные клетки. 13

5. Достижения генной инженерии. 17

6. Трансгенные растения. 23

Заключение. 25

Список литературы.. 26

Введение

Возможности, открываемые генетической инженерией перед че­ловечеством как в области фундаментальной науки, так и  во мно­гих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое произ­водство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации — энзимов и  аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека. Таким образом, генная инженерия, будучи  одним из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сель­скохозяйственная, энергетическая, экологическая.

Но особенно большие возможности генная инженерия открывает перед медици­ной и фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии и гибридомных методов может привести к коренным преобразо­ваниям медицины.

В связи с актуальностью тема исследования  генной инженерии на  сегодня очень актуальна.

Целью работы является исследование  генной инженерии.

Поставленная цель конкретизируется рядом задач:

1. рассмотреть общие понятия генной инженерии

2. рассмотреть методы генной инженерии

3. рассмотреть достижения генной инженерии

4. рассмотреть понятие трансгенные растения

1. Генная инженерия растений: общие понятия

За последние 10—15 лет были созданы принципиально новые методы манипулирования с нуклеиновыми кисло­тами in vitro, на основе которых зародился и бурно разви­вается новый раздел молекулярной биологии и генетики — генная инженерия. Принципиальное отличие генной инже­нерии от использовавшихся ранее традиционных приемов изменения состоит в том, что она дает возможность конструировать функционально активные генетические структуры in vitro в форме рекомбинантных ДНК. Понятия «генная» и «генетическая» инженерия ча­сто употребляют как синонимы, хотя последнее является более широким и включает манипулирование не только с отдельными генами, но и с более крупными частями генома. Работа по переделке генотипа животных или ра­стений с помощью скрещиваний ограничены пределами вида либо близких в видовом отношении форм. Напротив, генная инженерия, как будет показано ниже, стирает межвидовые барьеры, обеспечивая возможность создания организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Генная инженерия представляет собой совокупность методов, позволяющих не только получать реконбинантные ДНК из фрагментов геномов разных организмов, но и вводить такие рекомбинантные молекулы в клетку, создавая условия для экспрессии в ней введенных, часто совершенно  чужеродных генов. Таким образом, в этом случае исследователь оперирует непосредственно с генами, причем их перенос может не зависеть от таксономического родства используемых организмов. Эта особенность генной инже­нерии представляет ее главное отличие от ранее исполь­зовавшихся приемов изменения генотипа[4,с .199].

Первенствующую роль в формировании генной инженерии сыграла генетика микроорганизмов, идеи и методы, разработанные молекулярной генетикой и химией нуклеи­новых кислот. Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда группа П. Берга в США соз­дала первую рекомбинантиую ДНК in vitro, объединившую в своем составе генетический материал из трех источни­ков: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага К и гены галактозного оперона Е. coli. Сконструированная рекомбинантная моле­кула не была исследована на функциональную активность, поскольку у авторов этой работы возникли опасения, что методы генной инженерии могут привести к появлению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, напри­мер бактерий Е. coil, способных перенести онкогенные вирусы животных в кишечник человека. Разработанные позднее правила работы с рекомбинантными молекулами позволили практически устранить возможность вредных последствий создания рекомбинантных ДНК, объединяю­щих в своем составе гены разного происхождения.

2. Методы генной инженерии

Возможность выделения отдельных генов в составе относительно небольших фрагментов ДНК была продемон­стрирована незадолго до возникновения генной инжене­рии в экспериментах in vitro . В 1969 г. Дж. Беквит, Дж. Ша­пиро и другие опубликовали работу по выделению генов лактозного оперона Е.coli, основанную на сочетании тра­диционных методов генетики микроорганизмов и физиче­ских методов выделения и гибридизации молекул ДНК.

Отдельные гены с целью их последующего молеку­лярного клонирования в составе рекомбинантных ДНК методами генной инженерии могут быть получены сле­дующими способами[3, с. 188]:

1. непосредственным выделением из природных источников;

2. путем химического синтеза;

3. копированием соответствующей гену и РНК для получе­ния комплиментарной ДНК-вой реплики (к ДНК).

Первый метод широко использовался на раннем этапе развития генной инженерии. Тотальную ДНК из разных источников подвергали деградации различными рестриктазами, сшивали с векторными молекулами, вводили в реципиентные клетки и отбирали клоны с гибридными молекулами, включавшими требуемый ген, по появлению соответствующих маркеров донора (например, устойчи­вости к определенному антибиотику) либо с помощью специальных иммунологических и гибридизационных ме­тодов. Этот метод не утратил своего значения и успешно применяется, например для создания банка генов.

Искусственный синтез гена впервые осуществлен хи­мическим путем в 1969 г. группой  Кораны с сотрудниками. Химическому синтезу генов существенно способство­вало совершенствование методов изучения первичной структуры белков или других продуктов, кодируемых син­тезируемым геном, а также методов определения первич­ной структуры (секвенирования) нуклеиновых кислот. Секвенирование ДНК игра­ет большую роль не только в работах по химическому синтезу генов, но и при изучении их функции, их регуля­торных последовательностей, а также целых генетических систем, например мобильных диспергированных генов у эукариот.

Анализ первичной структуры ДНК, т. е. установление последовательности нуклеотидных остатков в ее молекуле, в настоящее время основан на двух методах — методе химической деградации (А. Максам и В. Гилберт, 1977) и методе полимеразного копирования с использованием терминирующих аналогов нуклеотидов (Ф. Сэнгер, 1977).

В практике генной инженерии широко распространен и третий метод искусственного получения генов, основан­ный на их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции. Этот механизм связан с актив­ностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы — фермента, впервые обнаруженного при исследовании репликации  РНК  онкогенных вирусов. Фермент способен строить ДНК-копии на разных РНК, включая синтетические полирибонуклеотиды. С по­мощью обратной транскриптазы, называемой иногда ревертазой, можно синтезировать практически любой ин­дивидуальный ген в присутствии соответствующих иРНК, методы выделении которых достаточно разработаны. В 70-е годы появились методы выделения в чистом виде фрагментов ДНК с помощью электрофореза. В руки ученых попали "молекуляр­ные ножницы". Транспортным средством переноса генетической ин­формации в клетку стал вирус. Явление трансдукции — переноса ге­нов из одной клетки в другую с помощью вирусов изучали еще с 50-х годов. Но вирус не должен был сразу уничтожать всю клетку, поэтому не все вирусы подходили для этой роли. Известно, что бак­териальные клетки могут обмениваться генетическим материалом при помощи плазмид (небольших частиц с фрагментами ДНК). Поэтому введение нужного гена в плазмиду позволяет в дальнейшем перенес­ти этот ген в бактерию (это еще один из механизмов транспорта в генной инженерии). Появилась возможность изучать распределение нуклеотидов в оп­ределенном гене или получать нужный белок. Для этого создается рекомбинантная ДНК, которая возникает, когда ДНК одного орга­низма внедряется в клетки другого. В качестве последнего использу­ются клетки организма, который размножается много быстрее пер­вого, например, бактерии. Так, в 80-е годы были разработаны интерфероны ~ белки, способные подавлять размножение вирусов. Были выбраны наиболее подходящие для переноса гены и мобиль­ные участки ДНК. Например, культурным растениям вводят гены, повышающие их иммунитет и устойчивость.

В 1983г. Барбара Мак-клинток при изучении генетики кукурузы обнаружила в ее геноме один "подвижный" ген, отвечающий за цвет початка. Независимо от нес подвижные гены были открыты методами молекулярной генетики советским ученым Г. П. Георгисвым. В 1981 г. процесс выделения генов и получения из них различных цепей был автоматизирован.

При всем разнообразии методов основная схема любой генно-инженерной работы остается неизменной. Она включает[5,с .111]:

1.     обработку кольцевой векторной моле­кулы рестриктазой с образованием линейной формы ДНК;

2.     сплавление ее с фрагментом чужеродной ДНК, веду­щее к формированию гибридной структуры;

3.     введение гибрида в клетку реципиента;

4.     отбор клонов транс­формированных клеток на селективных средах;

5.     до­казательство присутствия рекомбинантной ДНК в этих клонах путем ее выделения из клеток, обработки соот­ветствующими рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза в агарозном геле.

Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить кло­нируемую донорную ДНК в состав вектора. Один из них основан на соединении фраг­ментов, каждый из которых несет идентичные «хлипкие» концы, полученные под действием одной и той же рестриктазы. При другом методе, ферментативном, используется возможность соединения двухцепочных концов фраг­ментов ДНК с помощью ДНК-лигазы. Для повышения эффективности лигазы к концам сшиваемых фрагментов ДНК химически присоединяют комплиментарные однонитивые олигонуклеотиды, например поли-А и поли-Т, создавая тем самым искусственные «липкие» концы.

Методы введения рекомбинантных молекул в клетки зависят от особенностей самих клеток и используемых векторов. В тех случаях, когда векторами служат плазмиды, рекомбинантные ДНК вводят в реципиентные бак­терии путем трансформации. Разработаны и методы транс­формации клеток животных, а также протопластов расте­ний. Для защиты экзогенного клеточного материала, вво­димого в клетки млекопитающих или в протопласты растений, используют липосомы — сферические тельца, обо­лочка которых состоит из фосфолипидов. В составе липосом в клетки высших эукариот введены крупные вирусные РНК. Во всех случаях липосомы надежно защищали молекулы нуклеиновых кислот от разрушения нуклеазами.

Один из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений — гибридизация соматических клеток, разработанная Б. Эфрусси и Г. Барски (1960). Эффективность этого метода значительно повысилась после того, как было обнаружено, что частицы инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту слияния клеток из самых разных источников. Показана возможность передачи генов из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, из которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной. Для введения ДНК в различные культуры клеток млеко­питающих или развивающиеся эмбрионы используют метод микро инъекций ДНК в ядро с помощью микро­манипулятора. Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать абсолютно идентичные организмы. Создание гибридов высших растений в обход полового скрещивания возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток, в результате чего в ряде случаев появляются целые гибридные растения. Все эти методы могут быть использованы для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введе­ния и стабильного наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих, гены, детерминирующие желаемые признаки.[4, с. 188]

Следует, однако, отметить, что, несмотря на очевидные успехи подобных работ по созданию микроорганизмов, синтезирующих ряд важных продуктов эукариотического происхождения, проблема экспрессии чужеродных генов у прокариот имеет ряд ограничений. Некоторые из них связаны с тем, что при сверхпродукции полезных для человека и не нужных клетке соединений, кодируемых гибридной плазмидой, усиливается неустойчивость самих гибридов и вероятность элиминации из них встроенных генов. Стабильность гибридных ДНК снижается и с уве­личением размеров вставки в вектор. Поэтому разраба­тываются методы, направленные на сохранение целостнос­ти гибридной структуры. Использование регулируемых промоторов предохраняет клетку от чрезмерной для нее метаболической активности, связанной с избыточной про­дукцией чужеродного белка. Вместе с тем проблема ста­бильности гибридных молекул окончательно не решена. Ограничения возможностей конструирования микроорга­низмов — гиперпродуцентов ценных препаратов — рас­пространяются на случаи клонирования и экспрессии лю­бых генов как про -, так и эукариотического происхожде­ния.

Наряду с этим существуют и ограничения, специфи­чески связанные с выражением эукариотических генов в прокариотах.

Первое из них определяется тем, что эукариотические промоторы могут не распознаваться бакте­риальной РНК - полимеразой.

Второе заключается в том, что и РНК транскрибирующаяся с эукариотических генов, не содержит последовательности Шайн—Далгарно, необ­ходимой для ее связывания с рибосомами.

В-третьих, такая иРНК может содержать интроны, которые следует вырезать.

Наконец, эукариотические белки часто стано­вятся субстратами для бактериальных протеаз, опознаю­щих такие белки как чужеродные.[4].

Первые два ограничения преодолеваются за счет создания векторов, несущих соб­ственные промоторы и последовательность Шайн—Дал­гарно, третье можно обойти путем использо­вания кДНК либо химически синтезированных генов. Протеазная активность реципиентных бактерий подавляется мутациями.

Преодоление всех этих ограничений открывает даль­нейшие перспективы использования методов генной инже­нерии при создании микроорганизмов — продуцентов гор­монов, вакцин, антисывороток и ферментов, представляю­щих интерес для медицины, ветеринарии, сельского хо­зяйства и микробиологической промышленности.

3. Генетическая  рекомбинация in vitro

Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. По определению, данному Понтекорво в 1958 г., рекомбинация—это любой процесс, способный привести к возникновению клеток или организмов с двумя или более наследственными детерми­нантами, по которым их родители различались между собой и которые соединены новым способом. Такая рекомбинация обязательно происходит у млекопитающих при образовании половых клеток. В ходе мейоза гомологичные хромосомы обмениваются генами; именно эти обмены позволяют объяснить перетасовку наследственных признаков в ряду поколений. У вирусов и бактерий генетическая рекомбинация проис­ходит реже, чем у животных. Обмен генетическим матери­алом, за которым следует рекомбинация, происходит между организмами одного и того же или близких видов. Все живые организмы обладают рестрикционными эндонуклеазами, которые узнают чужеродную ДНК, проник­шую в организм, и расщепляют ее, таким образом сводя на нет генетическую рекомбинацию между эволюционно удаленными геномами.

Обмен генами, равно как и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно осуществить по­средством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на кишечной палочке, в клетки которой вводили гены животных и человека и добивались их репликации.

Метод рекомбинации in vitro заключается в выделении ДНК из разных видов, получении гибридных молекул ДНК и введении рекомбинантных молекул в живые клетки с тем, чтобы добиться проявления нового признака, например синтеза специфического белка.

Выделение генов, которые представляют собой сегмен­ты ДНК, осуществляется на основе биохимических мето­дов; сложность выделения зависит от величины генома. В то время как определенный ген вируса выделить относи­тельно просто, для гена человека это очень сложная задача. Поэтому исследователи прибегают к косвенному методу, основанному на выделении информационной РНК (мРНК). В клетках животных транскрипция мРНК на ДНК осуществляется в клеточном ядре; молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последова­тельностях нуклеотидов мРНК

(т. е. в конечном счете в ДНК). В клетках бактерий (прокариот), которые не имеют ядра, транскрипция и трансляция происходят одновремен­но и сопряжены; мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. Рибосомы играют ключевую роль в трансляции и в клетках животных.

Наряду с информацией о структуре белков (записанной с помощью генетического кода) молекула ДНК содержит ряд регуляторных сигналов, записанных в виде специфи­ческих нуклеотидных последовательностей. Эти сигналы служат точками начала транскрипции или трансляции, другие (в частности, между генами) указывают точки прекращения считывания генетической информации. Гене­тический код, по-видимому, универсален для всех живых организмов, иными словами, данная последовательность ДНК обязательно кодирует один и тот же белок в клетках разных организмов, тогда как регуляторные сигналы в клетках животных и в бактериальных клетках не одинако­вы. В клетках животных информация о структуре белка может кодироваться не одним непрерывным участком ДНК, а несколькими сегментами, разделенными участка­ми ДНК, носящими название нитронов. Информационная РНК, которая транскрибируется с ДНК, подвергается расщеплению, в ходе которого все интроны удаляются из ее последовательности, а остальные остающиеся фрагмен­ты, или экзоны, сшиваются вместе с образованием моле­кулы мРНК, которая обладает последовательностью, ко­дирующей последовательность аминокислот белка, а так­же содержит ругуляторные сигналы, необходимые для начала и прекращения процесса трансляции[2, с. 187].

Для экспрессии в бактериальной клетке гена из клетки животного необходимо, чтобы в клетку была введена молекула ДНК с последовательностью нуклеотидов, коди­рующей белок, из которой интроны уже удалены; иными словами, нужна молекула ДНК, синтезированная на соот­ветствующей мРНК обратной транскриптазой. Более того, регуляторные сигналы должны быть похожи на таковые бактериальной клетки. Наконец, для получения нужного белка в достаточных количествах бывают необходимы дополнительные изменения бактериальной клетки.[2]

4. Методы введения ДНК в бактериальные клетки

Для введения ДНК (генов) в клетки бактерий исполь­зуются два метода. Первый основан на применении плазмиды в качестве вектора.

В начале 1950-х гг., вскоре после открытия Ледербергом процесса конъюгации Escherichia coli, было установ­лено, что типы «спаривания» клеток бактерий обусловле­ны генетически и что генетическая информация перено­сится из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиентные клетки. Способность служить донорными клетками (или фактор плодовитости F) передавалась при конъюгации значительно чаще, чем любой другой генетический признак. F-фактор передавался также неза­висимо от любого другого известного гена донорной клетки. Ледерберг подметил, что F-фактор напоминает внехромосомные генетические элементы, имеющиеся в цитоплазме высших организмов. Это наблюдение позволи­ло ему в 1952 г. присвоить подобным внехромосомным генетическим системам общее название—плазмиды.

В 1953 г. Хэйс, который в то время работал в больнице Хаммерсмита в Лондоне, установил, что в определенных условиях F-фактор может оказаться сцепленным с генети­ческими маркерами и индуцировать последовательный их перенос в ходе конъюгации. F-фактор присоединяется к бактериальной хромосоме в специфическом участке (сайте); именно в этой точке хромосома разрывается при конъюгации и начинается ее перенос в реципиентную клетку. F-фактор способен также отделяться от хромосо­мы, захватывая подчас небольшие фрагменты хромосомы; поэтому его можно рассматривать как виехромосомный элемент, который иногда интегрирует в хромосому.

Жакоб и Вольман, сотрудники Института Пастера в Париже, отметили сходство в поведении F-фактора, уме­ренного бактериофага X, и другой плазмиды—Со1Е1 (которая кодирует колицин—белок, убивающий клетки Е. coli ). Для обозначения генетического элемента, который может реплицироваться либо в свободном состоянии, либо соединившись с бактериальной хромосомой, они предло­жили новый термин—«эписома».

В 1959 г. в Японии при исследовании больных бактери­альной дизентерией, которые не поддавались лечению обычно эффективными антибиотиками, было сделано за­мечательное открытие. В клетках патогенных бактерий (Shigella dysenteriae)  были найдены гены, придававшие им устойчивость одновременно к нескольким антибиотикам; такая устойчивость передавалась другим кишечным бакте­риям во многом подобно тому, как передается F-фактор. Эти факторы устойчивости (называемые R-факторами) обладали сходством с F-фактором; так, они были способ­ны индуцировать передачу самих себя от клетки к клетке при конъюгации. Позже удалось показать, что некоторые из них содержат последовательности нуклеотидов, близ­кие к таковым F-фактора[1,с . 198].

В начале 1960-х гг. Новик обнаружил подобные факто­ры устойчивости у стафилококков; они содержали ген, кодирующий фермент пенициллин-β-лактамазу, или пенициллиназу; последняя расщепляет пенициллин и таким образом обеспечивает устойчивость к этому антибиотику. R-факторы стафилококков, по-видимому, не способны обеспечивать передачу самих себя посредством конъюга­ции и переносятся лишь пассивно в процессе трансдукции, т. е. при их встраивании в ДНК бактериофага. Это открытие указывало на наличие нескольких R-факторов в клетках кишечных бактерий.

К середине 1960-х гг. стало очевидным, что большин­ство R-факторов кишечных бактерий и стафилококков (как и плазмида Со1Е1) отличаются от F-фактора и фага λ тем, что остаются внехромосомными элементами; их обратимого встраивания в хромосому клетки не происхо­дит. В строгом смысле они не соответствовали определе­нию эписомы. В 1963 г. Новик предложил пользоваться предпочтительно термином «плазмида», как более общим, а не «эписома». В настоящее время термин «плазмида» является общепринятым.

Плазмиды найдены почти у всех видов бактерий. Штамм, содержащий плазмиду, способен давать начало вариантам, у которых плазмида утрачена; в подобных случаях плазмида теряется окончательно, клетка не спо­собна ее регенерировать и может только получить ее из другой бактериальной клетки.

Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК, по размеру соответствующие 1—3% генома бакте­риальной клетки, однако даже столь малая часть наслед­ственного аппарата кодирует важные генетические призна­ки, которые обычно сама бактериальная хромосома не кодирует. Например, они содержат информацию, необхо­димую для конъюгации бактериальных клеток, ими обус­ловлен ряд заболеваний растений и животных. Они позво­ляют клеткам использовать многие сложные соединения в качестве источников питания и обеспечивают устойчи­вость к разнообразным токсичным агентам, особенно к антибиотикам. Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и ряду тяжелых металлов, вызывающих летальный эффект (со­лям сурьмы, висмута, кадмия и свинца, ионам арсената и арсенита). Гены устойчивости к тяжелым металлам обна­ружены также в составе R-плазмид Е. соli. Наличием плазмид  обусловлены также некоторые заболевания с выраженной диарреей, стафилококковый импедиго, створаживание молока и превращение его в сыр молочно­кислыми бактериями, а также разнообразные биохимиче­ские реакции, характерные для бактерий рода Pseudomonas..  Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis [2]. Использование плазмид в качестве векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужило толчком для интенсивных исследований их структуры и характера репликации.

Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более сотни; в целом чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке. Обычно репликация плазмиды регулируется независимо от репликации хромо­сомы. Поскольку плазмиды могут различаться по количеству копий водной и той же клетке, количество копий ; должно определяться регуляторной системой, присущей самой плазмиде. Такая система была описана в 1972 г. датчанином Нордстрёмом из Университета Оденсе для плазмиды R1 Е. со1i; сходные регуляторные системы были найдены у плазмид стафилококков. Количество копий плазмиды R1 зависит, по-видимому, от белка или белков, которые подавляют ее репликацию. Сегмент ДНК длиной не более двух тысяч пар нуклеотидов управляет реплика­цией плазмиды, которая более чем в 50 раз его крупнее.

Долгое время считалось, что генетическая конституция всех клеток данного вида одинакова и не изменяется в течение длительного времени, однако, как оказалось, значительная часть генетических признаков, причем не только у бактерий, но и у высших организмов, нестабильна (эти признаки имеются в одних клетках или штаммах и отсутствуют в других,, клетки могут терять их и приобре­тать вновь) и мобильна (способна переноситься между клетками или перемещаться в одной и той же клетке из одного локуса в другой). Такая нестабильность объясняетcя тем, что эти признаки определяются плазмидами и тугими атипичными генетическими системами.

При конъюгации бактериальных клеток может проис­ходить обмен плазмидами между бактериями, принадлежащими к разным видам и даже родам, которые не способны обмениваться генами, находящимися в хромосомах. Наконец, такой обмен может приводить к переносу генов, находящихся в плазмиде, из одного вида в другой при совместном росте и конкуренции, в результате чего реципиентные клетки приобретают способность выживать за счет донорных клеток. Эти свойства показывают, что плазмиды способны к выживанию независимо от судьбы содержащих их клеток, они не только не снижают общей приспособленности клетки, но, напротив, снабжают ее дополнительными адаптивными функциями. В самом деле, плазмиды обладают способностью включать в себя новые гены, а уже содержащиеся в них гены «перетасовывают» так, что это, с одной стороны, не влияет на эффектив­ность репликации самих плазмид, а с другой—наделяет клетку резервуаром генетической информации, которую она использует по мере надобности.

Второй метод, которым исследователи пользуются для введения гена в бактериальные клетки, основан на приме­нении бактериофага в качестве вектора. Ген встраивают в геном вируса (который содержит 10—50 генов), и он реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке.[2, с. 123]

5. Достижения генной инженерии

Группа Кораны синтезировала ген аланиновой тРНК дрожжей, структура которого к тому времени была пол­ностью расшифрована. Этот ген длиной 77 п. н. не содер­жал регуляторных последовательностей и поэтому не обла­дал функциональной активностью. Позднее та же группа авторов синтезировала первый функционально активный ген — ген супрессорной тирозиновой тРНК Е. coli длиной около 200 п. н.

 Генная инженерия открыла путь для производства продуктов белковой природы путем введения в клетки микроорганизмов искусственно синтезированных коди­рующих их генов, где они могут экспрессироваться в составе гибридных молекул. Первой удачной попыткой такого рода стала работа К. Итакуры и Г. Бойера с соавторами (1977) по экспрессии в Е. coil химически синтезированного гена, кодирующего гормон млекопитаю­щих — соматостатин. Ген соматостатина был получен на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот. Исполь­зованный в этой работе подход оказался весьма перспек­тивным для получения и многих других пептидных гормонов.

В различных лабораториях в СССР и за рубежом были созданы штаммы Е. coli, синтезирующие в составе гибрид­ных белков гормон роста человека (соматотропин), пептидные гормоны — брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин и др.

Ген гормона роста человека длиной 584 п. н.— наиболее длинный из искусственно синтезированных в настоящее время. Он был встроен в плазмиду, реплицирующуюся в Е. coli под контролем промотора триптофанового оперона. Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки Е. coli продуци­ровали при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона роста человека в расчете на клетку. Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека.

В 1976 г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый метод химического анализа ДНК; появилась реальная возможность опреде­лять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя. В 1982—1985гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот (а значит, генов). Анализ ДНК позволяет дедуцировать, основываясь на генетическом коде, аминокислотные последовательности белков, синтез которых находится под контролем соответствующих ге­нов. С помощью созданного в результате совершенствова­ния   анализа   белков   микроанализатора   Худа— Ханкепиллера (Калифорнийский технологический инсти­тут, 1980) за день удается определять последовательность из 100—200 аминокислот, причем для этого требуется всего 10 нг белка (1 нг=10 -9 г)2 [2].

Еще один важнейший этап—это синтез биополимеров по установленной структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963 г. Они используются в исследовательских лаборато­риях и в фармацевтической промышленности.

Метод химического синтеза генов обеспечил также возможность получения штаммов бактерий продуцентов инсулина человека, важного лечебного препарата для больных диабетом. «Ген инсулина синтезировали в вида более 40 в основном шестичленных олигонуклеотидов, которые затем объединяли в единую структуру с помощью ДНК-лигаэы. Полученные двух цепочечные полинуклеотиды длиной 271 и 286 пар оснований были встроены в плазмидные векторы. Туда же были встроены и регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гиб­ридных молекул. Клонированные гены кодировали синтез проинсулина, который путем несложной химической обработки можно превратить в активный инсулин, вклю­чающий две полипептидные цепи А и В из 21 и 30 аминокислотных остатков, соединенных между собой сульфгидрильными связями» [4].

Таким способом получены и клонированы гены, коди­рующие глобины человека, животных и птиц, белок хруста­лика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка, проду­цируемый тутовым шелкопрядом, и др. Этот же принцип был применен для получения, клонирования и экспрессии генов интерферона человека в бактериях. Интерферон — ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения ряда других заболеваний, включая злокачественные опухоли. Интерферон вырабатывается в клетках животных и че­ловека, но обладает выраженной видоспецифичностью. Ю. А. Овчинников и В. Г. Дебабов с сотрудниками по­лучили микроорганизмы, эффективно синтезирующие интерфероны человека. Этим исследователям удалось сконструировать рекомбинантные плазмиды, обуславли­вающие синтез интерферона человека в Е. coli. Очищенный из клеток бактерий интерферон по своим физико-химическим и биологическим свойствам оказался близок интерферону, находящемуся в крови доноров. За счет введения в векторную плазмиду сигнальных после­довательностей, инициирующих синтез иРНК и белка, удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона а расчете на 1 л суспензии бактерий. Это в 5000 раз больше, чем содержится в 1 л крови доноров. Замена Е. coli на микробы некоторых других видов позво­ляет еще больше увеличить производительность такой «фабрики интерферона».

В 1980 г. Итакура создал первый синтезатор генов. Вскоре после этого компания «Био-Лоджикалс» (Торонто) выпустила прибор, сконструированный Огилви в Универ­ситете МакГилла в Монреале; прибор был способен в течение 6 ч синтезировать 12-членный олигонуклеотид с заданной последовательностью. В 1981 г. Худ, изобрета­тель белкового микроанализатора, создал другой автомат, выпускаемый фирмой «Генетик инстраментс».

Компания «Био-Лоджикалс» намеревалась до конца 1982 г. выпустить две модели синтезаторов олигонуклео­тидов—одну полуавтоматическую, а вторую в комплексе с компьютером. В 1982 г. цена этих приборов на американ­ском рынке составляла 36000—39500 долл.[2].

К открытиям связанным с  достижениями генной инженерии нужно прибавить то, что огромный генетический «чертеж» многоклеточного существа просчитан полностью. Я думаю это можно назвать достижением века.

 После восьми лет работы многих исследовательских групп удалось точно определить 97 миллионов пар нуклеотидов и их местонахождение в спирали ДНК, хранящей полную наследственную информацию микроскопического червячка Сaenorhabditis elegans длиной около миллиметра Хотя это очень маленький червь, скорее червячок, с него без всякого преувеличения начинается новая эра в биологии. Геном этой нематоды состоит из 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК, округленно 0,1 миллиарда пар. Геном человека, согласно большинству оценок, - 3 миллиарда нуклеотидных пар. Разница в 30 раз. Однако именно эта работа, о которой идет речь, окончательно убедила даже самых закоренелых скептиков, что расшифровка строения всего генома человека не только возможна, но и достижима в ближайшие годы. 

В лабораториях мира полным ходом идет расшифровка генома человека. Эта международная программа была начата в 1989 году, тогда же благодаря инициативе и энергии выдающегося биолога, ныне покойного академика А. А. Баева, к программе подключилась и Россия. В феврале этого года в Черноголовке под Москвой прошла конференция "Геном человека-99", посвященная десятилетию начала этих работ и памяти их инициатора, руководившего российской частью программы первые пять лет. Сейчас в разных странах мира, в лабораториях, разделивших между собой "фронт работ" (всего надо прочитать около трех миллиардов пар нуклеотидов), ежедневно расшифровывается более миллиона нуклеотидных пар, причем темп работ все ускоряется.[6]

Расшифровка, или, как говорят биологи, секвенирование, генома C. elegans была осуществлена по совместному проекту двумя исследовательскими группами: из Центра геномного секвенирования Вашингтонского университета (США) и Сенгеровского центра (Кембридж, Англия). В журнале "Science" от 11 декабря 1998 года опубликована серия статей, подробно рассказывающая об этой поистине грандиозной работе.

Естественно, расшифровать геном таких гигантских размеров, как у названной нематоды (напомню: 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК), невозможно без огромной подготовительной работы. Ее в основном завершили к 1989 году. Прежде всего была построена физическая карта всего генома нематоды. Физическая карта представляет собой небольшие участки ДНК известной структуры (маркеры), расположенные на определенных расстояниях один от другого.

И вот с 1990 года началось само секвенирование. Его темп составлял в 1992 году 1 миллион пар нуклеотидов в год. Если бы такой темп сохранился, на расшифровку всего генома понадобилось бы почти 100 лет! Ускорить работы удалось простейшим способом - число исследователей в каждом центре возросло примерно до 100. По мере того, как раскрывалась нуклеотидная последовательность ДНК

C. elegans, пришлось расстаться с двумя заблуждениями. Во-первых, оказалось, что генов у нее не 15 тысяч, как предполагали вначале, а 19099. Во-вторых, надежда на то, что гены сосредоточены в середине хромосом, а к концам сильно редеют, оправдалась лишь отчасти, гены распределены вдоль хромосом относительно равномерно, хотя в центральной части их все-таки больше.

Если у дрожжей функция половины генов в геноме неизвестна (так называемые молчащие гены), то у червя эта доля еще больше: из 19 тысяч генов 12 тысяч остаются пока загадочными.

Значение секвенирования генома нематоды, конечно, выходит далеко за рамки того, что можно назвать полигоном для расшифровки генома человека. C. elegans - первый многоклеточный организм, геном которого раскрыт практически полностью. Можно напомнить: два года назад был расшифрован первый геном эукариотического организма - дрожжей, то есть организма, клетки которого содержат оформленные ядра. (К эукариотам относятся все высшие животные и растения, а также одноклеточные и многоклеточные водоросли, грибы и простейшие. Дрожжи, согласно биологической систематике, относятся к одноклеточным грибам.) Иначе говоря, за два года был пройден путь от генома одноклеточного до генома многоклеточного организма.

Программа "Геном человека", как уже говорилось, - программа общечеловеческая. Каждая лаборатория, в какой бы стране она ни находилась, вносит в нее посильный вклад. И как только кому-то удается раскрыть структуру нового гена, эта информация немедленно поступает в Международный банк данных, доступный каждому исследователю. В России по этой программе работают около 100 исследовательских групп.

6. Трансгенные растения

Если о явно преувеличенных успехах клонирования животных известно всем и каждому, то достижения ученых в области генной инженерии не так ярко представлены в средствах массовой информации. Возможности современной биотехнологии, в отличие от традиционных методов генетики и селекции, позволяют комбинировать гены разных биологических видов и получать трансгенные растения.

Если взять ген устойчивости к заболеваниям из вирусов, морозоустойчивости – из рыбы, сопротивляемости вредителям из бактерий и внести этот коктейль в геном какого-нибудь растения, то такая комбинация придаст растению совершенно новые свойства, хотя его биологический вид не изменится. Картофель останется картофелем, просто теперь он станет неуязвимым для колорадского жука.

Лидером в производстве трансгенных растений сейчас является США. В этой стране около 50% посевов кукурузы и сои и 40% хлопчатника составляют генетически модифицированные растения. Получением и испытанием таких растений занимаются сотни коммерческих фирм с совокупным капиталом более 100 млрд долларов.

Уже получены морозоустойчивая свекла, светящаяся в сумерках газонная трава и даже банан, съев который, получаешь прививку от тропических болезней.

Трансгенные растения, обладая повышенной выживаемостью, могут передавать свои полезные свойства будущим поколениям растений, давая обильный урожай на малорентабельных землях.

Но, несмотря на все успехи биотехнологии и на проведение всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность, в обществе существует настороженное отношение к генетически модифицированным продуктам. Есть вполне реальные опасения по поводу того, что пыльца и семена трансгенных растений и сорняков могут скреститься и в конечном счете вырастет такой суперсорняк, который не сможет уничтожить ни один гербицид. Или улучшение питательных свойств картофеля, кукурузы, сои может стать причиной тяжелых аллергических реакций у человека.

Особо следует отметить, что в процессе генетических модификаций часто используются гены устойчивости к антибиотикам, что также требует тщательного контроля конечного продукта, получаемого из трансгенного растения.

При всех вышеперечисленных недостатках генетически модифицированные растения уже принесли заметную пользу. Например, в США значительно сокращено применение гербицидов и пестицидов, что не только безопаснее для окружающей среды, но и снижает цену продуктов. Правда, так утверждают в США сами производители генетически модифицированных продуктов. Однако население (то ли в силу привычки, то ли от недоверия) предпочитает покупать все же натуральные продукты.

Заключение

         В ходе выполнения работы была достигнута ее основная цель и решены все задачи, поставленные во введении. В заключении сделаем несколько общих выводов.

За последние 10—15 лет были созданы принципиально новые методы манипулирования с нуклеиновыми кисло­тами in vitro, на основе которых зародился и бурно разви­вается новый раздел молекулярной биологии и генетики — генная инженерия.

Возможность выделения отдельных генов в составе относительно небольших фрагментов ДНК была продемон­стрирована незадолго до возникновения генной инжене­рии в экспериментах in vitro . В 1969 г. Дж. Беквит, Дж. Ша­пиро и другие опубликовали работу по выделению генов лактозного оперона Е.coli, основанную на сочетании тра­диционных методов генетики микроорганизмов и физиче­ских методов выделения и гибридизации молекул ДНК.

Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. По определению, данному Понтекорво в 1958 г., рекомбинация—это любой процесс, способный привести к возникновению клеток или организмов с двумя или более наследственными детерми­нантами, по которым их родители различались между собой и которые соединены новым способом.

Программа "Геном человека", как уже говорилось, - программа общечеловеческая. Каждая лаборатория, в какой бы стране она ни находилась, вносит в нее посильный вклад. И как только кому-то удается раскрыть структуру нового гена, эта информация немедленно поступает в Международный банк данных, доступный каждому исследователю. В России по этой программе работают около 100 исследовательских групп.

Список литературы

1.     Варфаламеев С.Д., Колюжный С.В. Биотехнология: генетические основы, микробиологические процессы. – М., 2002. – 245 с.

2.     Кузьмина Н.А. Биотехнология. – М, 2003. – 456 с.

3.     Меливанов М.В. Введение в теория биотехнологии. – СПб, 2001. – 423 с.

4.     Простаков Н.С., Борисова Т.Н.  Основы биотехнологии: Учеб. Пособ. – М., 2002. – 456 с.

5.     Федорова Э.И. Биотехнология: Учеб. Пособ. – М.: Инфра- М, 2002. 367 с.