Химические методы определения сахаров

г; 2 — двойное разведение вытяжки при проведении гидролиза сахарозы.

Физико-химические методы определения сахаров

В настоящее время находят широкое применение физико-химические методы определения сахаров. При этом сахара, путем химических реакций, превращают в какое-то вещество, замеряя затем физические характеристики (цвет, адсорбируемость и пр.) Эти методы быстрые, менее трудоемкие, а в некоторых случаях точнее химических.

Количественное определение сахаров в продуктах растительного происхождения с помощью хроматографии на бумаге (по О. А. Павлюшиной)

Количественное определение сахаров с применением хроматографии на бумаге включает в себя следующие основные операции:

фиксацию растительного материала > экстракцию сахаров и очистку вытяжки от белков и других примесей > распределительную хроматографию сахаров на бумаге > элюацию сахаров с бумаги > определение их содержания в элюатах

Реактивы и материалы: а) Хроматографическая бумага Ленинградская «быстрая» № 1; *Filtrak* FN-4; ватман М 1 и 2; б) этанол, 96%-ный и 80%-ный; в) уксуснокислый свинец (СН3СОО)2РЬ ∙ 3Н2О, 10%-ный раствор; г) сернокислый натрий, насыщенный раствор; д) смесь н-бутанола, пиридина и воды в соотношении 6:4:3 (по объему), или смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (по объему). [Если смеси растворителей разделяются на два слоя, то берут верхний;] е) проявители на кетозы: 1 — резорцинфосфат.

0,2 г резорцина растворяют в 100 мл 96%-ноге этанола. Перед проявлением хроматограммы смешивают 10 объемзв спиртового раствора резорцина с одним объемом ортофосфорной кислоты Н3РО4 (плотность 1,75—1,82);

2— N-хлормочевина.

5 г мочевины растворяют в 100 мл 96%-ного спирта и добавляют 20 мл 2 н раствора соляной кислоты;

ж) проявители на альдозы: 1 — анилинфталат

1,66 г фталевой кислоты и 0,93 г перегнанного анилина растворяют в 100 мл этилового спирта, насыщенного водой;

2 — анилиноксалат:

0,93 г перегнанного анилина растворяют в 50 мл 96%-ного этанола, после чего смешивают с равным объемом 0,2 М раствора щавелевой кислоты в этаноле (можно также брать водный 0,2 М раствор щавелевой кислоты);

и) глюкоза, фруктоза, сахароза и другие сахара, 2%~ные растворы; к) другие реактивы для количественного определения сахаров по антроновому методу.

Ход работы: Навеску свежего растительного материала (10—-30 г) заливают (для фиксации) десятикратным объемом кипящего 96%-ного этанола, нагревают 2—3 мин., добавляя небольшое количество углекислого кальция или натрия в порошке для нейтрализации кислот (под контролем лакмуса или универсального индикатора). Зафиксированная навеска (в колбе или склянке с притертой пробкой) может храниться в течение нескольких месяцев (в темном и прохладном месте). Фиксация спиртом является и началом экстракции сахаров, которые частично переходят в раствор. Сахара экстрагируют горячим (70—80 єС) 80%-ным этанолом 3 раза по 30 мин. Перед началом экстракции рекомендуется дополнительно растереть материал в ступке. Спирт, который служил для фиксации навески, объединяют со спиртовыми вытяжками. После каждой экстракции охлажденную спиртовую вытяжку центрифугируют. Объединенные спиртовые вытяжки сгущают в вакууме до объема 3 мл. Если материал богат хлорофиллом и каротиноидами, то сгущенную вытяжку несколько раз взбалтывают с петролейным эфиром. Эфирный раствор пигментов сливают, а остатки растворителя удаляют на водяной бане при 50—60°. Сгущенную вытяжку количественно переводят в мерную колбу на 5 или 10 мл. Для осаждения белков и других примесей прибавляют по каплям раствор уксуснокислого свинца. Проверив полноту осаждения, раствор в колбе доводят до метки, затем фильтруют или, еще лучше, центрифугируют. Для осаждения избытки свинца, не пошедшего в реакцию, добавляют одну каплю насыщенного раствора сернокислого натрия и снова центрифугируют или фильтруют. Нарезают полосы хроматографической бумаги длиной 50—55 см и шириной 13—19 см или другого размера (в зависимости от диаметра хроматографической камеры). Бумагу разлиновывают графитовым карандашом, оставляя с одной стороны листа одну, а с другой — две контрольные полосы шириной 2— 2,5 см. Низ хроматограммы вырезают зубцами, что способствует равномерному скапыванию растворителя и предотвращает наблюдающийся иногда перекос пятен. Затем на линию старта отдельными пятнами по одному на основной части хроматограммы и на каждой из контрольных полос наносят с помощью микропипетки или капилляра определенный точный объем испытуемого раствора (например, по 0,01; 0,02 или 0,03 мл в пятно). Количество экстракта, наносимого в пятно, должно соответствовать примерно 30—50 мг сырого веса исследуемого материала в том случае, если в нем содержится 5—7 мг глюкозы, фруктозы и сахарозы на 1 г сырого веса ткани. Для установления оптимальной концентрации сахаров, вносимых в пятно, ставят отдельно две контрольные хроматограммы с нанесением различных объемов опытного экстракта (0,01—0,04 мл в пятно). На те же полосы наносят также и метчики — растворы сахаров (по 0,004 мл 2%-ных растворов). После нанесения растворов на бумагу приступают к разделению сахаров в соответствующей смеси растворителей (н-бутанол — пиридин — вода, 6:4:3; н-бутанол — уксусная кислота — вода, 4:1:5). Хроматография нисходящая. Продолжительность разделения 2—3 суток. После разделения хроматограммы высушивают в токе воздуха (в вытяжном шкафу) до полного удаления следов растворителя. Следующей задачей является определение положения пятен на основной части хроматограммы, так как сахара элюируют из непроявленной части бумаги. Для этого от основной хроматограммы отрезают контрольные полосы (а), (б) и (в) и опрыскивают две из них, например (а) и (б), проявителями на кетозы — резорцинфосфатом (реакцией Ф.Ф. Селиванова):

или раствором N-хлормочевины:

а (в) — проявителем на альдозы — анилинфталатом (анилиноксалатом):

Полосу, опрыснутую резорцинфосфатом, прогревают 3—4 мин. в сушильном шкафу при температуре 85—95єС. Пятна фруктозы, сахарозы, раффинозы и олигосахаридов, содержащих фруктозу, окрашиваются в интенсивно розовый цвет. При нагревании хроматограммы, опрыснутой раствором хлормочевины, в течение 5 мин. при 105 єС пятна альдоз принимают синее окрашивание. Полосу, обработанную раствором анилинфталата или анилиноксалата, нагревают при 105—110 єС. При обработке хроматограммы анилинфталатом глюкоза и галактоза проявляются в течение 5 мин. при 105°С в виде желтовато-коричневых пятен; пятна пентоз вишнево-красного цвета. Мальтоза и лактоза дают желто-коричневые пятна при нагревании в течение 20 мин. при 105 єС. При проявлении анилиноксалатом (110°С, 5—6 мин.) пятна альдоз имеют коричневое окрашивание. Проявленные контрольные полосы (а), (б) и (в) прикладывают к основной части хроматограммы (в) и таким образом определяют положение пятен отдельных сахаров на полосе (в), не проявляя ее. Участки бумаги, содержащие не проявленные пятна глюкозы, фруктозы, сахарозы и олигосахаридов, вырезают, разрезают на маленькие кусочки («лапшу») и элюируют сахара водой три раза по 30 мин. при 60—70°. Элюаты фильтруют через маленькие бумажные фильтры, выпаривают на водяной бане до небольшого объема, снова фильтруют и доводят до определенного объема. В растворе определяют содержание сахара с помощью антронового реактива.

Определение восстанавливающих сахаров колориметрическим методом (по И. С. Лурье)

Метод основан на взаимодействии восстанавливающих сахаров при нагревании со стандартным щелочным раствором красной кровяной соли. При этом ее часть восстанавливается в желтую кровяную соль.

С6Н12О6 + 2K3[Fe(CN)6] + 2KOH = СН2ОН(СНОН)4СООН + 2K4[Fe(CN)6] + Н2О

Избыток феррицианида определяют на фотоэлектроколориметре по характерному поглощению в области 420...440 нм (синий светофильтр). Расчет восстанавливающих сахаров ведут по калибровочной кривой. Метод удобен для серийных анализов и применим в тех случаях, когда испытуемый раствор не содержит других веществ, взаимодействующих с феррицианидом, а также веществ, имеющих поглощение в данной области спектра. При работе с биологическим материалом, исследуемые вытяжки бывают очень сложны по своему составу, часто опалесцируют, поэтому требуется определенная подготовка образца. Метод очень удобен для изучения накопления восстанавливающих сахаров под действием ферментов, гидролизующих углеводы, в экспериментах, моделирующих технологический процесс. В этом случае исследователя интересует не абсолютное содержание восстанавливающих сахаров, а их увеличение за счет ферментативной реакции. При этом факторы, влияющие на величину оптической плотности, нивелируются контрольными или нулевыми замерами.

Реактивы и материалы: а) 1 %-ный раствор феррицианида (10 г в 1 дм3). б) 1,25 н. раствор КОН (70 г в 1 дм3). в) 1 %-ный исходный раствор глюкозы. г) 0,1 %-ный и 0,2 %-ный рабочие растворы глюкозы.

Ход работы.

1.Выполнение анализа: В коническую колбу на 100 см3 вносят 10 см3 раствора феррицианида, 5 см3 раствора щелочи и от 1 до 5 см3 испытуемого раствора. Если объем пробы меньше 5 см3, то недостающее количество компенсируют водой. Колбочку прикрывают часовым стеклом и на слабом огне доводят до кипения. Кипятят ровно 1 минуту. Затем содержимое колбочки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность на ФЭКе при синем светофильтре (420 нм). Количество сахара в испытуемом растворе определяют по калибровочной кривой.

2.Построение калибровочной кривой: Концентрацию исходного раствора глюкозы устанавливают по методу Бертрана. Для этого берут три пробы по 5 см3 1 %-ного раствора глюкозы, добавляют к каждой пробе по 15 см3 воды и 40 см3 реактива Феллинга. Концентрацию исходного раствора глюкозы рассчитывают как среднее значение из трех параллельных определений. Точную концентрацию рабочих растворов глюкозы рассчитывают по данным анализа исходного раствора. Сухие конические колбочки на 100 см3 заполняют согласно табл. 2.

В заполненных колбочках проводят определение содержания глюкозы колориметрическим методом и строят калибровочную кривую в координатах «оптическая плотность — количество глюкозы, мг».

Определение восстанавливающих сахаров методом Шомадьи — Нельсона (предшественник метода Фолина-Ву)

Колориметрический метод Шомадьи — Нельсона основан на реакции восстанавливающих сахаров с реактивом Шомадьи — Нельсона, в результате которой образуется окрашенное соединение «молибденова синь» общего состава MonO3n-x голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию восстанавливающих углеводов, которые определяют по величинам оптических плотностей при 508 нм, по калибровочной кривой, составленной с применением модельных растворов. Метод неспецифичен, трудоемок.

Реактивы и материалы: а) Реактив Шомадьи.

a 24 г карбоната натрия и 12 г тартрата калия — натрия (калий натрий виннокислый средний) помещают в коническую колбу вместимостью 500 см3 и добавляют 250 см3 дистиллированной воды. Затем приливают 40 см310 % раствора сульфата меди, перемешивают и добавляют 16 г гидрокарбоната натрия.

b.18 г Na2SO4 растворяют в 500 см3 горячей дистиллированной воды. Раствор кипятят в течение 40 минут для удаления СО2, затем охлаждают.

Cмешивают (a+b) в мерной колбе на 1 дм3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. В течение первых двух-трех суток хранения реактива Шомадьи оседает небольшое количество меди с примесями. Этот осадок отфильтровывают, готовый раствор хранят в темной склянке.

б) Реактив Нельсона.

a 25 г модибдата аммония помещают в мерную колбу на 500 см3 и растворяют в 150 см3 Н2О. Раствор перемешивают, к нему осторожно небольшими порциями добавляют 21 см3 концентрированной H2SO4 (х. ч.) при непрерывном перемешивании.

b 3 г гептагидрата гидроортоарсената натрия (Na2HAsO4 • 7Н2О) растворяют отдельно в химическом стаканчике в 50 см3 Н2О

(a+b). Получается прозрачный раствор светло-желтого цвета, его доводят до метки водой и выдерживают в термостате при 37 "С в течение 2 суток. После выдержки раствор готов к употреблению.

Ход работы.

1.Проведение анализа: К 1 см3 испытуемого раствора добавляют 1 см3 реактива Шомадьи, перемешивают и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 15 минут:

СuSO4 + 2NaOH [гидролитический] ѕѕ® Cu(OH)2 + Na2SO4

Затем к охлажденной смеси добавляют 1 см3 реактива Нельсона и доводят объем до 10 см3 дистиллированной водой:

Na2HAsO4 + 15H2SO4 + 12(NH4)2MoO4 [в реактиве Нельсона]ѕѕ® (NH4)3H4[As(Mo2O7)6] + 21(NH4)2SO4 + Na2SO4 + 10H2O

2(NH4)3H4[As(Mo2O7)6] + Cu2O ѕѕ® 4Mo6O17 + 2CuO +(NH4)2SO4 + 2(NH4)2HAsO4 + 3H2O

Оптическую плотность полученного раствора измеряют при 590 нм с использованием кюветы с шириной грани 5 мм.

2.Построение калибровочной кривой. Калибровочную кривую строят после проведения колориметрической реакции модельных растворов глюкозы с концентрацией от 0,02 до 0,14 мг/см3. Изучаемая зависимость выражается прямой линией, выходящей из начала координат.

Определение фруктозы и других кетосахаров (по Мак-Рери и Слаттери)

Определение основано на способности кетосахаров давать вишневую окраску с резорцином в кислой среде:

Реактивы и материалы: а) Спиртовой раствор резорцина

1 г резорцина растворить в 1 дм3 95%-ного этанола.

б) 30 %-ный раствор НС1 (не должен давать окраску с резорцином).

в) Стандартный раствор фруктозы

100 мг фруктозы растворяют в 100 см3 насыщенного водяного раствора бензойной кислоты.

г) Рабочий раствор фруктозы

1 см3 стандартного раствора фруктозы разводят в мерной колбе на 100 см3

Ход работы. В пробирку вносят 5 см3 испытуемого раствора (содержащего от 1 до 8 мг фруктозы в 100 см3 раствора), 5 см3 спиртового раствора резорцина и 15 см3 30 %-ного раствора НСI. Содержимое пробирки перемешивают и помещают на 20 минут в водяную баню при температуре 80 °С. Затем содержимое пробирки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность на ФЭКе при 540 нм (зеленый светофильтр). В качестве контроля используют раствор, в котором вместо 5 см3 испытуемого раствора берется 5 см3 Н2О. Количество фруктозы определяют по калибровочной кривой. Для этого готовят серию разведений рабочего раствора фруктозы, в каждом из которых проводят определение фруктозы по описанной выше методике. Калибровочную кривую строят в координатах: «оптическая плотность — количество фруктозы, мг».

Газохроматографическое определение отдельных сахаров

Метод основан на переводе углеводов типа глюкозы, фруктозы, арабинозы, ксилозы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, раффинозы, а также полиолов — сорбита и инозита в пищевых продуктах в триметилсилильные производные с последующей их идентификацией на газовом хроматографе.

Аппаратура, реактивы и материалы: а) Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и устройством для программирования температуры. б) Стеклянная насадочная колонка длиной 2...3 м и диаметром З...4 мм или капиллярная колонка длиной 25...30 м с нанесенной фазой. в) Микрошприц емкостью 1,0...10мкл. г) Роторный испаритель. д)Гексан, х.ч. е)Гексаметилдисилазан. ж) Трифторуксусная кислота или триметилхлорсилан. з) Пиридин, х.ч., безводный. и) Ксилит, х.ч. или инозит. й) Свинец уксуснокислый, х.ч. к) Неподвижные фазы для ГЖХ SE-30, OV-17, ХЕ-60, СКТФТ-50. л) Инертный носитель для ГЖХ: хромосорб-W DMCS, хроматон-N DMCS.

Ход работы.

1. Подготовка образцов к анализу углеводов. Для получения достоверных результатов анализа необходимо учитывать содержание жира и лимонной кислоты в испытуемом образце. Предварительно содержание этих компонентов в пищевых продуктах можно оценить по «Таблицам химического состава пищевых продуктов» и на основании этого выбрать один из следующих способов подготовки образца к анализу.

1.1. Продукты с низким содержанием жира (менее 1,5%).

1.1.1. Продукты с низким содержанием лимонной кислоты (менее 1,5 %). Содержание лимонной кислоты устанавливается по «Таблицам химического состава». К ним относятся соки, вина, пиво, фруктово-ягодные кондитерские изделия, мед, сиропы и др. Навеску гомогенизированной пробы продукта с высоким содержанием сухих веществ (более 60 %) наносят на полиэтиленовую пластинку в количестве 50... 150 мг и взвешивают на аналитических весах с точностью 0,0001 г. На этой же пластинке взвешивают 5... 10 мг ксилита. Пластинку помещают в круглодонную колбу емкостью 10...25 см3 и силилируют без обезвоживания с использованием трифторуксусной кислоты. При использовании триметилхлорсилана содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе при 60 "С под вакуумом. В случае медленного упаривания в колбу добавляют 1 см3 бензола. После упаривания проводят силилирование. Жидкие продукты отмеряют пипеткой в количестве 0,5... 1,0 см3 и помещают в круглодонную колбу емкостью 10...25 см3, снабженную шлифом. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску 5... 10 мг ксилита, взвешенного с точностью 0,0001 г. Содержимое колбы упаривают досуха на роторном испарителе.

1.1.2. Продукты с содержанием лимонной кислоты более 1,5 %. Для исключения наложения пика ТМС-производного лимонной кислоты на ТМС-производное (3-глюкозы, лимонную кислоту осаждают уксуснокислым свинцом. Навеску средней гомогенизированной пробы продукта (свежие цитрусовые плоды, цитрусовые соки, продукты, содержащие лимонную кислоту как пищевую или консервирующую добавку) в количестве 1...1,5г взвешивают с точностью до 0,0001 г в конической колбе емкостью 100 см3, приливают 30 см3 75...80 %-ного раствора этанола и экстрагируют 30 минут при температуре 60...70°С. Используют водяную баню и обратный холодильник. Экстракцию повторяют трижды, экстракты объединяют. Содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой. В центрифужную пробирку на 10 см3 вносят пипеткой 5 см3 отфильтрованного экстракта, 0,5 см3 насыщенного раствора уксуснокислого свинца. Осадок центрифугируют. 1 см3 надосадочной жидкости переносят в круглодонную колбу со шлифом емкостью 10...25 см3. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят навеску ксилита 5... 10 мг. Содержимое колбы упаривают на роторном испарителе при 60 "С под вакуумом.

1.2. Продукты с высоким содержанием жира (более 1,5%).

1.2.1. Продукты с содержанием лимонной кислоты менее 1,5 % (детское молочное питание, сухие молочные смеси и др.). Навеску средней гомогенизированной пробы продукта с высоким содержанием сухих веществ (более 60%) в количестве 500...1000 мг помещают в центрифужную пробирку. Туда же на полиэтиленовой пластинке вносят с точностью до 0,0001 г навеску ксилита 2...5 мг. Проводят экстракцию с 2 см3 гексана с последующим центрифугированием. Экстракцию проводят трижды, декантируя гексановый слой. Остатки гексана высушиваются в токе азота, после чего проводят силилирование.

Пробу сгущенного молока взвешивают в центрифужной пробирке и проводят обезжиривание, как описано выше, затем добавляют 20 см3 50 %-ного водного раствора этанола, тщательно перемешивают, затем обрабатывают аналогично жидким молочным продуктам.

10 см3 жидких молочных продуктов помещают в центрифужную пробирку, смешивают с 10 см3 96 %-ного этанола, выдерживают 30...40 минут и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 минут. 1 см3 надосадочной жидкости помещают в круглодонную колбу, туда же на полиэтиленовой пластинке вносят 2...5 мг ксилита, содержимое упаривают насухо на роторном испарителе при 60 °С, после чего проводят силилирование.

1.2.2. Продукты с содержанием лимонной кислоты более 1,5 % и хлебобулочные изделия. Навеску средней гомогенизированной пробы продукта в количестве 10...15 г, взвешенную с точностью до 0,0001 г, помещают в центрифужную пробирку и подвергают трижды экстракции 30 см3 гексана, объединяя гексановый слой декантированием. Осадок шпателем переносят в коническую колбу вместимостью 100 см3, тщательно смывая остатки со шпателя и пробирки 75 %-ным раствором этанола. Затем трижды экстрагируют содержимое колбы 75 %-ным раствором этанола, подогревая колбу на водяной бане при 60 °С. Отфильтрованные экстракты объединяют и доводят дистиллированной водой до метки в мерной колбе на 100 см3. В мерную пробирку на 10 см3 вносят 5 см3 экстракта и 0,5 см3 насыщенного раствора уксуснокислого свинца. После выпадения осадка надосадочную жидкость в количестве 1,0 см3 переносят в круглодонную колбу вместимостью 10...25 см3. Туда же вносят на полиэтиленовой пластинке 2...5 мг ксилита (с точностью до 0,0001 г) и содержимое колбы упаривают на роторном испарителе при 60 °С под вакуумом, после чего проводят силилирование.

2. Силилирование сахаров.

2.1. Способ с использованием трифторуксусной кислоты. В подготовленную навеску образца приливают 1,0 см3 пиридина (нуклеофильный катализатор), 0,9 см3 гексаметилдисилазана, 0,1 см3 трифторуксусной кислоты (облегчающий алкилирование), плотно закрывают и энергично встряхивают в течение 30 секунд. Вначале наблюдают расслоение жидкости на 2 фазы, при этом нижний слой незначителен. По мере стояния раствора в течение 20...30 минут это расслоение исчезает и начинает выделяться аммиак, что указывает на успешное протекание реакции силилирования:

После прекращения выделения аммиака раствор выдерживают 12 часов при комнатной температуре или 1 час при 60 "С. Длительно сохраняющееся расслоение, исчезающее только при нагревании, говорит о том, что реакция силилирования прошла не полностью из-за высокого содержания влаги (более 40%) или повышенного содержания углеводов. В этом случае подготовку пробы повторяют, уменьшив при этом навеску или увеличив время высушивания на роторном испарителе.

2.2. Способ с использованием триметилхлорсилана. В подготовленную навеску образца приливают точно 1,0 см3 пиридина, 0,2 см3 гексаметилдисилазана и 0,1 см3 триметилхлорсилана, встряхивают в течение 1 минуты и нагревают в термостате 45 минут при 60 °С:

Затем хроматографируют.

Для упрощения идентификации и количественных расчетов (если не требуется знания аномерного состава сахаров) определение сахаров производят в виде ТМС-производных сахаров. В подготовленную пробу образца добавляют 100 г гидроксиламина солянокислого, приливают 10 см3 пиридина и выдерживают в термостате при 80 °С в течение 2 часов:

Охлаждают и далее приливают силилирующие агенты.

3. Газохроматографический анализ.

Подготовка хроматографической колонки. Стеклянную колонку, заполненную готовым сорбентом (количество неподвижной фазы 3...5% от массы носителя) длиной 2 м и внутренним диаметром З мм устанавливают в термостате хроматографа и проводят термокондиционирование при продувании потоком газа-носителя (гелий, азот, водород) 2 ч при 100°С, 2 ч при 150°С, 4 ч при 200°С и 8 ч при 250"С. Затем устанавливают рабочий режим: температуру колонки профаммируют от 125 до 270°С со скоростью 4 °С в 1 мин, температуру испарителя 250 °С, расход газа-носителя 40см3/мин, температура пламенно-ионизационного детектора 250 °С, продолжают кондиционировать в течение рабочего дня.

Газохроматографическое определение. 1 мкл пиридинового раствора триметилсилильных производных углеводов вводят в испаритель и элюируют из колонки газом-носителем. Идентификацию индивидуальных триметилсилильных производных проводят по времени удерживания триметилсилильных производных сахаров-метчиков и методом добавок.

3.3. Приготовление стандартных растворов сахаров.

3.3.1. Сахара, имеющие аномеры . Навеску ксилита и навеску определяемого сахара, взятую с точностью 0,0001 г, помещают в коническую колбу и заливают дистиллированной водой до полного растворения углеводов. Раствор выдерживают в течение суток. Аликвотную часть раствора отбирают пипеткой, помещают в круглодонную колбу и упаривают досуха, после чего проводят силилирование.

3.3.2. Сахара, не имеющие аномеров. Силилируются без предварительного растворения.

Массовую долю отдельных сахаров (в %) в навеске продукта определяют по формуле:

где С, — содержание отдельного сахара в навеске, %; К1 — поправочный коэффициент данного сахара; С — масса навески стандарта, мг; m — масса навески образца; Ас — площадь пика стандарта в относительных единицах; Лс— площадь пика данного сахара в относительных единицах.

Ввиду того, что альфа-лактоза и сахароза выходят на хроматограмме одним пиком, площадь пика альфа-лактозы определяют, исходя из соотношения площадей альфа- и бета-лактозы в модельном соединении лактозы. За основу берется площадь пика бета-лактозы. Площадь пика сахарозы определяют вычитанием от суммарного пика сахарозы пика альфа-лактозы, из пика бета-лактозы. За окончательный результат принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений и округляют до трехзначной цифры.

Количественное определение сахаров по реакции с пикриновой кислотой (по Крезелиус – Зейферт)

При взаимодействии редуцирующих сахаров с пикриновой кислотой они окисляются до соответствующих кислот, а пикриновая кислота восстанавливается в пикраминовую, обладающую красной или буровато-красной окраской:

Метод пригоден для количественного определения глюкозы, галактозы, арабинозы, фруктозы, рамнозы, ксилозы, мальтозы, лактозы и крахмала. Метод быстр, но не очень точен. Ошибка может превышать 10-20%. В связи с этим указанный метод имеет ориентировочное значение;

Реактивы и приборы: а) пикриновая кислота, насыщенный раствор; б) углекислый натрий, 20%-ный раствор; в) спектрофотометр.

Ход работы: К 1 мл испытуемого раствора (в котором должно содержаться ее более 3 мг редуцирующих сахаров) прибавляют 2 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 мл раствора углекислого натрия, после чего пробирку переносят на 30 мин. в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема 10 мл. Оптическую плотность раствора определяют при 455 нм (синий светофильтр). Содержание редуцирующих сахаров рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартным растворам глюкозы как в работе «Количественное определение сахаров по антроновому методу».

Определение редуцирующего общего сахара по реакции с 3,5-дииитросалицнловой кислотой

При взаимодействии сахаров с 3,5-динитросалициловой кислотой она восстанавливается в З-амино-5-нитросалицнловую:

В остальном реакция протекает так же, как и с пикриновой кислотой.

Реактивы и приборы: а) динитросалициловый реактив:

В мерной колбе на 1 л растворяют в дистиллированной воде 10 г 3,5-динитросалициловой кислоты, 300 г сегнетовой соли, 16 г едкого натра и доводят водой до метки. Раствор выдерживают два дня в темном месте, затем фильтруют в склянку оранжевого стекла и хранят в темноте;

б) спектроколориметр «Спекол» (ГДР).

Ход работы: К 1 мл испытуемого раствора (где не более 2 мг редуцирующих сахаров) прибавляют 2 мл динитросалицилового реактива, нагревают 5 мин. в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, после чего доводят до объема 25 мл. Оптическую плотность раствора определяют при 530 нм (зеленый светофильтр).

Антроновый метод определения сахаров (по Моррису-Роэ)

Антроновый реактив образует зеленое окрашивание со всеми растворимыми углеводами, которые в одинаковой концентрации дают окрашенные растворы практически одной и той же оптической плотности.

Это позволяет при определении углеводов использовать калибровочную кривую, составленную по глюкозе, для определения других сахаров в небольших концентрациях (до 0,2 мг в пробе). Точные результаты могут быть получены при наличии высокоочищенных химических реактивов и соблюдении постоянной температуры.

Реактивы и материалы: а) Антроновый реактив

200 мг антрона растворяют в 100 см3 концентрированной серной кислоты (плотность 1,84).

б) 0,5%-ный раствор H2SO4

2,8