?
На проходившем в 1975 г. в Ленинграде XII Международном ботаническом конгрессе у американских ученых возник вопрос: “почему секция, посвященная устойчивости растений к болезням, названа “Иммунитет”? Разве русские нашли у растений антитела?” Известный японский фитохимик И.Уритани ответил, что название секции отражает традиции в русской фитопатологической литературе, пришедшие от Н.И.Вавилова, который в 1919 г. написал книгу “Иммунитет растений к инфекционным болезням”. Действительно, в англоязычной фитопатологической литературе термин “иммунитет” встречается редко, чаще пишут “устойчивость” (“resistance”).
Различия в понимании устойчивости к инфекционным болезням у растений и животных зависят от двух причин. Первая связана с факторами иммунитета у тех и других организмов. Известно, что основные успехи медицинской и ветеринарной иммунологии обусловлены использованием антител. Для функционирования этих факторов защиты от инфекции необходимы специализированные клетки и ткани, ответственные за иммунитет, в том числе гуморальная система, способная быстро доставить антитела в любое место. У растений и беспозвоночных животных дифференцировка не столь высока. Каждая клетка растения несет все функции, необходимые для создания целостного организма, в том числе и иммунные. Многочисленные попытки обнаружить антитела у растений были неудачными.
Вторая причина заключается в подходе медика и фитопатолога к защите от болезней. Как писал еще в 1933 г. американский фитопатолог К.Честер, “медик преимущественно занят терапией, фитопатолог - профилактикой”.
У медика и даже ветеринара неизмеримо меньше подходов для использования наследственного иммунитета, чем у фитопатолога, поэтому в медицине основные успехи в защите от инфекций лежат на пути иммунизации, т.е. создания приобретенного иммунитета. Фитопатолог же имеет почти неограниченные возможности для искусственного заражения и отбора устойчивых экземпляров среди огромных популяций, а также для гибридизации, инбридинга, мутагенных обработок и проч. Эти преимущества и позволили создать путем селекции устойчивые к болезням сорта многих растений.
Таким образом, болезнеустойчивость позвоночных животных и растений отличается и по биохимическим механизмам, и по методологическим подходам. Это дало основание для шутливого высказывания известного иммунохимика о равновеликом расстоянии между тремя видами иммунитета - животных, растений и дипломатического (сейчас на слуху четвертый - иммунитет депутатский).
Однако по мере углубления знаний о природе болезнеустойчивости, особенно с появлением методов работы с рекомбинантными ДНК, различия в механизмах иммунитета растений и животных перестали казаться столь разительными. Сейчас накапливается все больше данных о сходстве между ними. Об этом и пойдет речь.
Иммуномодуляторы патогенных микроорганизмов
Микроорганизмы, патогенные для животных и растений, выделяют в зараженные ткани и клетки метаболиты (иммуномодуляторы), влияющие на иммунные реакции. Одни из них, индукторы, или элиситоры, хозяин использует для распознавания чужого и индукции в организме защитных реакций. Эти вещества повышают устойчивость как к самим микробам, продуцентам элиситоров, так и к последующему заражению иными патогенными организмами, т.е. представляют собой один из факторов индуцированного приобретенного иммунитета. Другие иммуномодуляторы – иммуносупрессоры, или импедины, – наоборот, подавляют защитные реакции и снижают иммунные свойства. И те, и другие иммуномодуляторы фито- и зоопатогенов сходны по своему строению и механизму воздействия на своих хозяев.
Так, близкие по структуре углеводы (b-глюканы, хитин и др.) служат иммуномодуляторами и растений, и животных. Углеводы фитопатогенов в зависимости от длины цепи, ее конфигурации и генотипа растения могут быть или индукторами, или супрессорами. У животных действие липополисахаридов и пептидоглюканов зависит от их концентрации: малые дозы стимулируют образование антител, большие - подавляют его.
Среди иммуносупрессоров или патотоксинов фитопатогенных грибов много циклических пептидов. Например, пентапептид паразита овса Cochliobolus victoriae
(HV-токсин) подавляет активность фермента глициндекарбоксилазы, что приводит к супрессии иммунных ответов, нарушению барьерных свойств мембран, гибели растительных клеток. У человека мутации этого фермента вызывают летальную болезнь - гиперглицинемию. Циклический пептид паразита кукурузы Cochliobolus carbonae
(НС-токсин) представляет собой структурный гомолог трапоксина - ингибитора гистонов в клетках животных. Циклоспорин - циклический ундекапептид грибов из рода Tolypoocladium
- обладает мощным супрессорным действием на позвоночных животных: подавляет синтез важного межклеточного медиатора (цитокина) интерлейкина-2 в Т-хелперных клетках и активизацию цитотоксических Т-киллеров интерлейкином-2. В связи с этим циклоспорины широко применяют при пересадке органов, ибо они предотвращают иммунное отторжение чужеродной ткани.
Подобные примеры сходства между иммуносупрессорами растений и животных можно найти и среди белков. Так, белок оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ, молекулярная масса 17.5 кДа) индуцирует сверхчувствительную реакцию (некроз зараженных клеток) табака; он активен только в виде кристаллических агрегатов. Некроз клеток у животных вызывает фактор некроза опухоли (ФНО, молекулярная масса 17 кДа), продуцируемый Т-лимфоцитами и макрофагами; он активен в виде агрегата из трех молекул и имеет гомологичные последовательности аминокислот со структурным белком сателлита вируса некроза табака. Продукт гена авирулентности avrRxv фитопатогенной бактерии Xanthomonas vesicatoria,
поражающей томаты и перцы, индуцирует защитные реакции у устойчивых сортов. Он гомологичен фактору вирулентности yaupj бактерии Yersinia pseudotuberculosum,
которая вызывает кишечные инфекции. Транспорт обоих белков через бактериальные мембраны осуществляют специальные белки, имеющие гомологичные области с продуктами hrp-генов у фитопатогенных бактерий и белками секреторной системы типа III у патогенных для человека Yersinia, Shigella и Salmonella.
Не оставляют исключения и липиды. Арахидоновая (эйкозотетраеновая) кислота, продуцируемая возбудителем фитофтороза картофеля Phytophthora infestans,
включается в состав фосфолипидов зараженных клеток, окисляется там ферментом липооксигеназой до эйкозаноидов. Эта кислота - активный индуктор окислительного взрыва, синтеза растительных антибиотиков (фенолов, фитоалексинов) и реакции сверхчувствительности. У животных она - предшественник эйкозаноидов, окисляется липо- и циклооксигеназами до лейкотриенов и простагландинов - медиаторов циклических нуклеотидов и агрегации тромбоцитов.
 |
Синтез церамида (регулятора клеточного цикла и апоптоза) из сфинганина и структура грибных антиметаболитов фумонизина и AAL-токсина.
У растений эти токсины подавляют защитные реакции и транспорт сахаров, приводят к неопластическому росту и некрозам.
У человека и сельскохозяйственных животных фумонизин вызывает гепатотоксикозы, разные формы неоплазмозов и гибель клеток.
|
Иммунные молекулы
Строение антител - иммуноглобулинов - хорошо известно: две полипептидные цепи - тяжелая (H, молекулярная масса ~50 кДa) и легкая (L, молекулярная масса ~25 кДa), соединенные дисульфидными связями. Каждая цепь содержит чередующиеся константные (С) и вариабельные (V) участки. Огромное разнообразие антител в организме, позволяющее узнавать множество чужеродных антигенов, обусловлено уникальным генетическим контролем их синтеза.
Продукты генов устойчивости растений названы R-белками (от англ. resistance - устойчивость). Структуру первых трех R-белков (из томатов, арабидопсиса и табака) установили сравнительно недавно - в 1993 г. С тех пор их описано несколько десятков.
В состав R-белков входит несколько структур, обеспечивающих, с одной стороны, взаимодействие с лигандом (элиситором) и с молекулами-мишенями (в частности, с ДНК), а с другой - передачу сигнала на другие молекулы - циклические нуклеотиды, протеинкиназы и др. Полипептидные цепи R-белков образованы комбинациями фрагментов, что и обеспечивает растениям из разных классов и порядков устойчивость к вирусам, бактериям, грибам и даже нематодам. Следовательно, эти структуры возникли очень давно, до расхождения предковых растений на современные классы и порядки, выполняли иные, более общие, функции, связанные с рецепцией и передачей сигнала от возбужденного рецептора к генам. Значит, их иммунная функция вторична.
Гены устойчивости растений, контролирующие синтез R-белков, расположены на хромосомах неслучайно. Широко распространены три типа локализации: одиночное диаллельное (один локус с двумя аллелями, контролирующими восприимчивость и устойчивость, которая, как правило, доминантна); одиночное мультиаллельное (один локус с множеством кодоминантных аллелей, контролирующих устойчивость к разным видам и расам патогена); сцепленное (большое число ди- или мультиаллельных локусов сцеплены и образуют блок фенотипически сходных генов, определяющих устойчивость к одной или нескольким болезням). Вот некоторые примеры.
Ген устойчивости риса к бактерии Xanthomonas oryzae
Xa21 входит в мультигенное семейство, состоящее по крайней мере из восьми членов, которые картируются в одном локусе на хромосоме 11. На коротком плече
V-й хромосомы ячменя находится блок из пяти локусов, определяющих устойчивость к мучнистой росе; в одном из локусов - Mla - картировано около 20 кодоминантных аллелей. Устойчивость кукурузы к расам возбудителя северной ржавчины Puccinia sorgi
контролируют пять локусов. Два из них - Rpl и Rp5 - тесно сцеплены, причем в локусе Rpl картировано 14 аллельных и тесно сцепленных генов. Гены устойчивости томатов к кладоспориозу (возбудитель - гриб Cladosporium fulvum
) образуют несколько групп сцепления. Тесно сцеплены гены Cfl, Cf-4 и Сp, расположенные на коротком плече хромосомы 1, а также Cf-2 и С-5 на коротком плече хромосомы 6. Последние, вероятно, аллельны, так как не рекомбинируют у гибридного потомства.
Схема участка хромосомы, включающего семейства вариабельных, V, и константных, C, генов (вверху). Численность V-генов в отдельных семействах варьирует от 50 до 1000, а C-генов - от 1 до 9. Внизу - сборка V-гена: V-фрагмент - контролирующий первые 95 аминокислот, в - следующие за ним от 2 до 10, J - концевой фрагмент V-гена, контролирующий от 5 до 10 концевых аминокислот. Районы ДНК, разделяющие V-D и D-J фрагменты, вырезаются и утрачиваются при сборке гена.
Возникновение кластеров сцепленных генов, функционально и, вероятно, структурно сходных, обусловлено внутри- или межгенными обменами участков ДНК, имеющих прямые (аbсd - а’b’с’d’) или инвертированные (аbсd - d’с’b’a’) повторяющиеся последовательности. Нити ДНК двух родителей в мейозе могут спариваться по гомологичным последовательностям, которые находятся в негомологичных участках хромосом. Это приводит к неравному кроссинговеру. В результате у одного родителя участок хромосомы теряется (делетируется), а у второго - удваивается (дуплицируется), т.е. вместо одного гена появляется два сцепленных.
С этой точки зрения наибольший интерес представляет LRR-область R-белков с многочисленными повторяющимися последовательностями. Благодаря точковым мутациям, делециям, инверсиям такая структура обеспечивает генетическую реорганизацию. Экспериментально показано, что мутации, изменяющие реакцию на заражение авирулентными расами патогенов, картированы в LRR-области.
Большую роль в увеличении генетического разнообразия семейств генов устойчивости могут играть разрывы кодирующей части ДНК, вызванные внедрением мобильных генетических элементов. Так, у риса в локусе белка Ха21 обнаружены транспозоны Truncator и Retrofit, приводящие к разрывам и образованию самостоятельных рамок считывания. Этот белок сочетает свойства двух белков томата - мембранного рецептора и фермента протеинкиназы. Возможно, возникновение генов С/9 и Pto обусловлено разрывом предшественника, подобного гену Ха21.
Схема строения R-белков. Заштрихованы С-концевые домены, которые содержат повторяющиеся последовательности, богатые лейцином (LRR-области). Каждый повтор состоит из 23-24 аминокислот. Эта структура, встречающаяся во многих белках эвкариот, осуществляет белковые взаимодействия, т.е. служит рецептором, связывающимся с лигандом - элиситором патогена. NBS (Nucleotide Binding Sites) - сигнальная область, связывающаяся с АТФ и ГТФ, вследствие чего она может активировать киназы или сигнальные G-белки. LZ (Leucine Zipper Region) - область лейциновой “застежки”, которая участвует в формировании спирализованных структур, ответственных за димеризацию или специфическое взаимодействие с другими белками. TIR (Toll/Interleukin-1 Resistance) - область гомологии с цитоплазматическим доменом Toll-белка дрозофилы и рецептором интерлейкина-1 млекопитающих. Возможно, TIR-область растительных R-белков несет сходные функции. РК - серин-треониновая протеинкиназа - фактор активации транскрипции и других сигнальных путей. Слева обозначены гены растений, кодирующие R-белки: RPS и RPM - гены устойчивости арабидопсиса к бактериям из рода Pseudomonas;
L - ген устойчивости льна к ржавчине; N - ген устойчивости табака к вирусу табачной мозаики; RPP - ген устойчивости арабидопсиса к ложной мучнистой росе; Cf - гены устойчивости томатов к грибу Cladosporium fulvum;
Xa - ген устойчивости риса к бактерии Xanthomonas oryzae;
Pto и Prf - система генов, контролирующих устойчивость томатов к бактерии Psiulomonas tomato.
Справа - содержание аминокислот в белках. Внутренние цифры - проценты идентичных последовательностей в специфических областях. Стрелки указывают направления транскрипции, а треугольники - положение интронов.
Разные типы рекомбинаций (A, B, C) на хромосомном сегменте, содержащем локусы устойчивости растений к болезням (А – С). Внизу - гипотетические изменения устойчивости к расам патогенного микроорганизма, возникающие в результате рекомбинаций.
Таким образом, аналогично множественным генам иммуноглобулинов у млекопитающих, обеспечивающих синтез антител, у растений имеются белки, которые кодируются семейством сцепленных генов. Высокая вариабельность их генопродуктов позволяет быстро реагировать на заражение новыми вирулентными видами и расами паразитов.
Передача сигнала и иммунный ответ
Между возбуждением рецептора и активацией генов иммунного ответа происходит трансдукция - передача сигнала, в ходе которой он многократно умножается. Процесс осуществляется сигнальными системами (как правило, общими для всех клеток), участвующими в регуляции разных сторон жизнедеятельности организма. Некоторые сигнальные системы функционируют в зараженных и больных клетках и тканях.
Например, инфекция растений и животных часто сопровождается окислительным взрывом, вызванным появлением активных форм кислорода (перекиси водорода, гидроксид-радикала, анион-радикала). В этом процессе важную роль играет NADPH-оксидазная система цитоплазматической мембраны. У растений она аналогична таковой у макрофагов и нейтрофилов млекопитающих. Иммунные сыворотки к ключевым компонентам NADPH-оксидазного комплекса животных взаимодействуют с растительными белками соответствующего размера. Клонированы гены риса, гомологичные гену мембранного белкового компонента NADPH-оксидазной системы нейтрофилов животных. В клетках растений активные формы кислорода образуются также с участием пероксидазы клеточной стенки и оксалатоксидазы. Эти альтернативные пути появления активного кислорода не подавляются специфическими ингибиторами окислительного взрыва у животных.
Предполагают, что активные формы кислорода не только высокотоксичные соединения, способные локализовать инфекцию, но и участники сигнальной системы: супероксид-анион и перекись водорода активируют транскрипцию и, как следствие, экспрессию защитных генов.
Активным компонентом в сигнальной системе служит салициловая кислота, ее концентрация многократно повышается не только в местах инфицирования, но и в удаленных тканях. Поскольку салициловая кислота подавляет активность фермента каталазы, разлагающей перекись водорода, количество последней еще более возрастает. Не менее важна роль салициловой кислоты и ее ацетилированной формы (аспирина) в регуляции защитных реакций у позвоночных животных. В этом случае она блокирует синтез простагландинов и активность гена фактора некроза опухолей (ФНО), ограничивает продукцию интерлейкина 1, осуществляя тем самым противовоспалительное и жаропонижающее действие.
Одна из важных сторон присутствия в клетке активных форм кислорода - индукция клеточной гибели или апоптоза. Показано, например, что трансгенные растения табака, у которых подавлен синтез ферментов, разлагающих перекись водорода, гиперчувствительны к патогенам. У таких растений даже низкие дозы патогенов, не влияющих на контрольные растения, вызывают реакцию сверхчувствительности.
Работы последних лет выявили много общего между апоптозом у животных и растений при реакции сверхчувствительности. В клетках зараженных растений освобождаются свободные 3'-концы ДНК, активируется Са2+
-зависимая эндонуклеаза, появляются фрагменты ДНК размером около 50 тыс. оснований, а также олигонуклеосомные фрагменты. Для модельных систем показано, что такие фрагменты образуются только в несовместимых комбинациях растение-патоген. Кроме того, обнаружены остаточные апоптозные тельца, мигрирующие к периферии клетки. Токсин томатного патогена вызывает апоптоз и в клетках животных. В системе фасоль-ржавчина 3'-олигонуклеосомные фрагменты найдены только в клетках, содержащих выросты мицелия гриба (гаустории), что указывает на высокую специфичность процесса.
Морфологические изменения растительных клеток в апоптозе также сходны с таковыми у животных: резко уменьшается размер клетки, цитоплазматическая мембрана приобретает складчатость, ядро конденсируется и дробится, митохондрии набухают, протопласт отделяется от клеточной стенки и распадается на отдельные везикулы, подобные апоптозным тельцам. У животных апоптозные везикулы поглощаются соседними или специализированными клетками, у растений же фагоцитозу препятствует клеточная стенка. При сверхчувствительной реакции вокруг очага поражения образуется перидерма, поскольку здоровые клетки приобретают меристематическую активность. Вероятно, в апоптозе растений участвуют хлоропласты, как и митохондрии у животных.
Индукторами апоптоза у животных и растений могут быть одни и те же иммуномодуляторы микроорганизмов. Внешний стимул в животных клетках активирует цистеиновую протеазу - каспазу, которая расщепляет многие внутриклеточные белки, вызывая конденсацию цитоплазмы и фрагментацию ДНК. Многие растительные R-белки имеют участки, гомологичные регуляторам апоптоза у животных. Возможно, и функционально участки R-белков сходны с регуляторами апоптоза у животных.
* * *
Благодаря молекулярным исследованиям стало ясно, что в процессах, обеспечивающих жизнедеятельность клетки и ее взаимодействие с окружающей средой, между простейшими эвкариотами, дрожжами, и венцом творения, человеком, гораздо больше общего, чем специфического. Поэтому не удивительно наличие общих механизмов в защите от инфекционных болезней. Переход от примитивных механизмов иммунитета у растений к совершенным, присущим позвоночным животным, заключается, видимо, в разделении функций.
Ведь у растений каждая клетка способна к синтезу молекул, узнающих чужое, к трансдукции сигнала в ядерный аппарат, токсическому действию на паразита и т.д. Сигнальные молекулы функционируют внутриклеточно, обеспечивая локальную иммунную реакцию. Хотя в ответ на заражение может возникнуть системная приобретенная устойчивость, она не абсолютна и проявляется лишь в снижении восприимчивости к повторному заражению неинфицированных участков.
У животных иммунные функции разделены между рядом клеток - Т- и В-лимфоцитами, макрофагами и др. Сигнальные молекулы передают информацию между клетками, что обеспечивает усиление сигнала и его системное распространение. Этот механизм обусловил возникновение семейства сигнальных молекул - цитокинов (интерлейкины, ФНО и др.) и их рецепторов на поверхности иммунных клеток.
У растений возникновение такого механизма маловероятно и по структурным соображениям - наличию клеточных оболочек, препятствующих межклеточным обменам. Вероятно, с появлением функционально различных, способных к автономному размножению и системному распространению, клеток связано и другое принципиальное различие между иммунными системами растений и животных.
У животных главные защитные молекулы, антитела, высоко специфичны к определенным видам и даже штаммам патогенных микроорганизмов. Такая специфичность требует, во-первых, огромного разнообразия в строении иммунных молекул, которое может быть обеспечено только белками, и, во-вторых, механизма преимущественного размножения только того клона, который продуцирует нужное антитело. Ясно, что каждая клетка растения, несущая все иммунные функции, не может обеспечить такую сложную систему защиты. Поэтому основные защитные молекулы растений низкомолекулярны (фенолы, терпеноиды) и неспецифичны, т.е. токсичны по отношению к большому числу видов патогенных грибов и бактерий. Специфичен, и то относительно, лишь их синтез в ответ на инфекцию. И хотя в зараженной клетке растения обычно образуется семейство близких по строению защитных молекул (например, фитоалексинов), все они неспецифичны и отличаются лишь степенью токсичности к разным патогенным микроорганизмам и чувствительностью к ферментам паразитов.
В последние годы меняется отношение фитопатологов и к практическому использованию приобретенного иммунитета. Только в отличие от животных и человека, иммунизация которых основана на заражении ослабленными штаммами паразитов, индуцирующими размножение необходимого клона лимфоцитов, иммунизацию растений проводят химическими соединениями, индуцирующими синтез неспецифических факторов защиты (абиотическими элиситорами). Сейчас многие зарубежные и отечественные фирмы производят такие соединения для практического использования: предпосевной обработки семян или клубней, летнему опрыскиванию вегетирующих растений и т.п.
Литература
Статья Юрия Таричановича Дьякова, доктор биологических наук,
заведующий кафедрой микологии и альгологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.
|