Учебное пособие: Методические указания му 2…

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей

и благополучия человека

3.1.2 ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов

Методические указания

МУ 3.1.2…

Москва 2009

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование

Российской Федерации

__________________________________________________________________

3.1.2 ИНФЕКЦИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов

Методические указания

МУ 3.1.2…

Издание официальное

Москва 2009

Термины и сокращения

СП – санитарно-эпидемиологические правила

ТИФА – твердофазный иммуноферментный анализ

МУ – методические указания

МФА – метод флуоресцирующих антител

РНГА – реакция непрямой гемагглютинации

РИД – реакция иммунодифузии

РЛА - реакция латекс-агглютинации

РСК – реакция связывания комплемента

ИФА – иммуноферментный анализ

ПЦР – полимеразная цепная реакция

МПК – минимальная подавляющая концентрация

ГЗТ – реакция гиперчувствительности замедленного типа

КОЕ – колониеобразующие единицы

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 2009. - 66 с.

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю. В. Демина, Н.Д. Пакскина), ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (В.В. Алексеев, А.В. Липницкий, М.А. Гришина, В.А. Антонов, Г.А. Ткаченко, Н.В. Вьючнова, Е.Н. Кочубеева, В.С. Лесовой, И.В. Новицкая, Т.А. Гришкина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от _______ № __).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко _________ 200__ г.

4. Введены в действие с «__» ______ 200__ г.

5. Введены впервые

Исполнители от Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека:

Демина Ю. В.

Пакскина Н.Д.

Исполнители от ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора:

Алексеев В.В.

Липницкий А.В.

Гришина М.А.

Антонов В.А.

Ткаченко Г.А.

Вьючнова Н.В.

Кочубеева Е.Н.

Лесовой В.С.

Новицкая И.В.

Гришкина Т.А.

Лабораторная диагностика, лечение и профилактика особо опасных микозов. Методические указания. 2009. - 66 с.

1. Разработаны: Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю. В. Демина, Н.Д. Пакскина), ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (В.В. Алексеев, А.В. Липницкий, М.А. Гришина, В.А. Антонов, Г.А. Ткаченко, Н.В. Вьючнова, Е.Н. Кочубеева, В.С. Лесовой, И.В. Новицкая, Т.А. Гришкина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от _______ № __).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко _________ 200__ г.

4. Введены в действие с «__» ______ 200__ г.

5. Введены впервые

Содержание

1 Область применения

1.1 Настоящие методические указания предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, имеющих разрешение на работу с микроорганизмами II группы патогенности, независимо от организационно-правовой формы.

1.2 В методических указаниях определены порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на инфицированность возбудителями особо опасных микозов, а также материала из объектов окружающей среды, подозрительного на контаминацию микромицетами II группы патогенности.

2 Нормативные ссылки

2.1 Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». – М., 2003.

2.2 Санитарные правила СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». – М., 1996

2.3 Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. Методические указания МУ 1.3.1794-03 . – М., 2004.

2.4 Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-IV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР. Методические указания МУ 3.5.5.1034-01. - М., 2001.

2.5 Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики. Методические рекомендации. - МЗ РФ, ЦНИИЭ. – М., 2004.

2.6 Взаимодействие органов управления, учреждений и специализированных формирований при ликвидации последствий террористических актов с применением патогенных биологических агентов и опасных химических веществ. Методические рекомендации МР 0100/0556-04-34, Москва.-2005 г.

3 Общие положения

3.1 Краткие сведения о возбудителях особо опасных микозов

Возбудители особо опасных микозов – это первичные грибные патогены. К ним относят грибы рода Coccidioides (C.immitis, C.posadasii), Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis и Paracoccidioides brasiliensis . Общим для всех особо опасных микозов является то, что они принадлежат к категории «респираторных», т.е. основной путь инфицирования – аэрогенный.

В соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами возбудители кокцидиоидомикоза (C.immitis и C.posadasii ), гистоплазмоза (H.capsulatum ), бластомикоза (B.dermatitidis ) и паракокцидиоидомикоза – (P.brasiliensis ) относятся ко второй группе патогенности (опасности).

Существующее таксономическое положение этих возбудителей представлено в таблице 1.

Таблица 1

Таксономическая систематика возбудителей особо опасных микозов

Примечание: * - бесполое состояние гриба;

** - половая или совершенная форма гриба

Возбудители особо опасных микозов диморфны: во внешней среде они существуют в виде мицелиальной (сапробной) формы, а в организме человека и животных из мицелиальных элементов образуются тканевые (паразитические) формы гриба.

Первичные грибные патогены занимают дискретные экологические ниши. Наиболее вирулентные из них - возбудители кокцидиоидомикоза C . immitis и C . posadasii обитают в почвах юго-запада США, в Мексике и в других странах Центральной и Южной Америки. H . capsulatum var. capsulatum регистрируется во многих странах мира, но его высокоэндемичные очаги расположены в США вдоль реки Миссисипи. Вариант гриба - H . capsulatum var. duboisii встречается, в основном, в Африке. Возбудитель бластомикоза B . dermatitidis выявляется в почвенных микроочагах многих стран мира, но обитает преимущественно в юго-восточных, центральных и средне-западных штатах США, а также в Канаде, Мексике, странах Центральной и Южной Америки. Почвенные очаги P . brasiliensis ограничены Центральной и Южной Америкой, причем наибольшее распространение возбудитель паракокцидиоидомикоза имеет в бассейне реки Амазонки.

Пыльные бури, интен­сивное земледелие, археологические раскопки, проведение полевых военных учений способствуют повышению числа инфицированных и, соответственно, клинически выраженных случаев. Пребывание в эндемичной зоне туристов обусловливает вынос инфекции на другие территории, в том числе за пределы эндемичных очагов. Однако, передача особо опасных микозов от человека человеку не происходит, образование новых почвенных очагов не зафиксировано, по­этому вне эндемичных зон болезнь не укореняется.

Истинную встречаемость в мире особо опасных микозов сложно опре­делить в связи с трудностью их диагностики, однако предполагается, что ежегодная инфицированность этими возбудителями людей в эндемичных районах составляет сотни тысяч человек.

Необходимо подчеркнуть, что аэрогенный способ заражения особо опасными микромицетами является естественным, поэтому использование аэрозоля спор этих грибов обеспечивает заражение большого количества людей. Инфекциозность спор очень высокая, однако развитие первичной легочной инфекции напрямую зависит от инфицирующей дозы возбудителя.

Входными воротами инфекции являются легкие. Внедрение возбудите­лей особо опасных микозов приводит к формированию очага воспаления. Первичный процесс в легких у большинства инфицированных заканчивается самопроизвольным выздоровлением с рубцеванием гранулёмы. У большинства больных выздоровление не сопровождается какими-либо оста­точными явлениями в легких, но у 2-5 % регистрируются узелки или полос­ти.

При гематогенной диссеминации Coccidioides spp . чаще пора­жаются кожа, кости, суставы, оболочки головного мозга, а также селезенка, печень, почки, надпочечники.

Диссеминированный гистоплазмоз встречается очень редко и развива­ется у больных с иммунодефицитом, детей и ослабленных пожилых лиц. Для диссеминированной формы африканского гистоплазмоза характерно дли­тельное течение с преобладанием поражений костей и ко­жи.

При бластомикозе наиболее характерна диссеминация в кожу. Часто отмечается поражение костей, реже — органов мочевыводящей и половой систем, центральной нервной системы.

При паракокцидиоидомикозе вторичная диссеминация с поражением различных органов отмечается у 79 % взрослых больных. Наиболее харак­терны поражения слизистых оболочек и кожи, а также шейная лимфоаденопатия.

Человек не обладает естественным иммунитетом к данным грибам, поэтому восприимчивость населения считается всеобщей. Эффективность иммунного ответа на инфицирование грибами зависит от защитых факторов макроорганизма, важная роль в которых принадлежит факторам Т-клеточного иммунитета.

Гуморальные (комплементсвязывающие, преципитирующие) антитела не являются показателями защиты, а лишь характеризуют ответную реакцию иммунной системы на попадание в организм антигенов грибов. Более того, выраженный гуморальный ответ в виде специфических иммуноглобулинов (особенно IgG) свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания.

Продолжительность болезни широко варьирует от нескольких недель до одного года. Описаны формы продолжительностью 4-8 и даже 16 лет. Длительность и интенсивность лечения зависят от формы заболевания, в особо тяжелых случаях прием антифунгальных препаратов – пожизненный.

Установление лабораторного диагноза микозов связано с длительным процессом культивирования грибов и их идентификации путем доказательст­ва диморфизма (получение мицелиальной и тканевой фаз).

3.1.1 Морфологические и культурально-биохимические свойства Coccidioides spp .

Грибы рода Coccidioides характеризуются продукцией нитчатых (мицелиальных) форм в период развития сапробной фазы во внешней среде (преимущественно, в почве) или при выращивании в условиях пониженной температуры (ниже 30 ⁰ С) на питательных средах. Конверсия в дрожжеподобную форму (сферулы) происходит во время паразитической фазы, т.е. после внедрения в организм животного (человека) или при инкубации на обогащенных питательных средах в условиях повышенной температуры (34-41 ⁰ С) и наличия углекислого газа.

Мицелиальная форма Coccidioides характеризуется образованием септированных гиф и толстостенных артроконидий (артроспор) диаметром 2-4 мкм, которые образуются по длине гиф внутри самого мицелия. Артроконидии обычно разделены «пустыми» тонкостенными, хрупкими клетками-разобщителями, образуемыми путем аутолиза чередующихся конидий внутри гифы. Таким способом артроконидии легко высвобождаются в воздух при нарушении верхних слоев почвы и ветре. При ингаляции в легкие или в редких случаях после чрезкожной имплантации в ткани каждая артроконидия трансформируется в новую многоядерную, округлую структуру, называемую сферулой. Сферулы увеличиваются в размерах и формируют толстую наружную стенку. По мере роста сферула начинает разделяться внутри путем инвагинации и образования разделяющих бороздок, что приводит к продукции многочисленных одноядерных эндоспор. Сферулы варьируют в размерах от 60 до 100 мкм и более в диаметре, тогда как размеры эндоспор остаются в пределах 2-5 мкм. Зрелые сферулы могут содержать от 800 до 1000 эндоспор, которые высвобождаются в ткани при разрыве сферулы. В своей паразитической фазе каждая эндоспора вырастает в новую сферулу.

Сферулы могут быть получены in vitro на специальных питательных средах (например, среда Конверса) в атмосфере повышенного содержания углекислого газа. Добавление к специальным питательным средам поверхностно-активных веществ, а также биотина, тирозина, фенилаланина, триптофана и пирокатехина ускоряет созревание сферул. Тем не менее, культуральные сферулы, как правило, гораздо меньше тканевых (до 30 мкм, реже 50 мкм) и содержат небольшое количество эндоспор.

Спороносный аппарат состоит из прямоугольных или бочонкообразных, длиной 3-6 мкм, диаметром 2-3 мкм артроспор (артроконидий), образующихся из концевых ветвей мицелия в процессе уплотнения отдельных клеток. Иногда по ходу мицелия или на его концах встречаются крупные (диаметром 8-24 мкм) хламидоспоры. Однако, этот тип спороношения не характерен для рода Coccidioides . Скорость образования артроспор на плотных средах варьирует от 4-5 до 15 дней и больше; встречаются слабо спорулирующие штаммы. В подходящих условиях из артроспоры в течение 1 сут развивается ветвящийся, септированный мицелий с характерным спорообразованием в дальнейшем.

Культуры рода Coccidioides хорошо растут на плотных и жидких средах с углеводами, на овощных и синтетических средах. При температуре 37 ⁰ С на щелочных (рН 7,2-7,4), богатых белками субстратах вырастают кожистые, почти лишенные воздушного мицелия мягкие, желтовато-коричневого цвета колонии. На более кислых средах (рН 6,5-6,8) при 28-30 ⁰ С хорошо развивается воздушный мицелий; колонии выглядят пушистыми, беловатыми, а на высоте спорообразования – мучнистыми. В некоторых колониях наблюдают концентрические зоны пушистого мицелия. Вариации колоний гриба были описаны как внутри одного штамма на разных средах, так и между разными штаммами на одной и той же среде.

В качестве источников питания возбудитель кокцидиоидомикоза использует моно-, ди- и полисахариды, окисляя, но не сбраживая их. Растет на средах с солями молочной и уксусной кислот, но при этом рост сильно угнетен; лимонную, щавелевую и виннокаменную кислоты практически не усваивает; клетчатку не разлагает. Хорошо развивается на средах, содержащих олеиновые кислоты, свиной жир, оливковое масло; использует этиловый спирт. Растет на белковых субстратах, свернутой сыворотке, на кровяном агаре, нередко с гемолизом; усваивает пептон и многие аминокислоты: аспарагин, цистин, аланин; глицерин и др.; растет на средах с мочевиной, сульфатом или хлоридом аммония. Протеолитическая активность гриба довольно яркая: он интенсивно разжижает желатин и казеин, свернутую лошадиную сыворотку; пептонизирует и коагулирует молоко. Не восстанавливает нитраты в нитриты; не образует индола и сероводорода. Гриб растет на минеральных питательных средах с различными источниками азотистых веществ и углерода; развивается на водных вытяжках из различных образцов почвы, растет на овощах и увлажненных кусочках дерева. Дрожжевой экстракт как единственный источник питания в агаровых средах стимулирует рост и более раннее образование артроспор.

Гриб устойчив к воздействию практически всех антибактериальных антибиотиков. Это свойство используют в практической микологии для освобождения от микробной флоры подлежащих исследованию объектов внешней среды и материала от больных.

Оптимальным рН для гриба является 6,8, но диапазон, при котором он растет, варьирует от 6,5 до 7,4. Температура инкубации также может колебаться от комнатной до 41 ⁰ С, оптимум – 25-30 ⁰ С, однако, даже при 4 ⁰ С отмечается медленный рост гриба и созревание артроспор.

В мицелиальной фазе роста гриб является аэробом, но может расти и в условиях недостатка кислорода (факультативный анаэроб). В тканях организма хозяина при отсутствии атмосферного кислорода тканевая форма гриба проявляет свойства микроаэрофила, для которого достаточно того количества кислорода, которое доставляется в ткани гемоглобином крови. При культивировании тканевой формы гриба in vitro предпочтительной является инкубация в атмосфере, содержащей от 20 до 40 % углекислого газа.

Грибы рода Coccidioides включены в число потенциальных агентов биотерроризма. В то же время, значимость возбудителей кокцидиоидомикоза как агентов биотерроризма снижается в связи с тем, что большинство случаев инфицирования заканчивается выздоровлением, инкубационный период (обычно 10-16 дней) слишком продолжительный, не существует вакцин для защиты тех, кто может использовать эти микромицеты в качестве объектов биотеррора. Тем не менее, существует мнение о возможности использования артроконидий Coccidioides как векторов доставки опасных биотоксинов.

Факторы патогенности гриба до сих пор изучены недостаточно. Физические и химические свойства самой клетки гриба (артроспоры) обеспечивают возможность ее проникновения глубоко в альвеолы, а наличие «усиков, орнамента» у спор способствует их фиксации на клетках альвеолярного эпителия.

Наличие в клеточной стенке мицелия и артроспор большого количества хитина и липидов при сравнительно большой величине клеток обеспечивает гидрофобность клеточной стенки гриба, что затрудняет захват и переваривание (в связи с отсутствием в организме млекопитающих фермента хитиназы) фагоцитированных клеток. Эти же факторы обусловливают длительную персистенцию гриба в тканях. Вследствие незавершенности фагоцитоза скорость репродукции гриба в организме (конверсия в сферулы) превышает скорость его переваривания. Кроме того, в составе клеточной стенки тканевой фазы возбудителя кокцидиоидомикоза обнаружены адгезины, которые являются одним из факторов вирулентности этого гриба. Клеточная стенка содержит белки, обладающие иммуносупрессивным действием, что приводит к подавлению синтеза гуморальных антител.

Протеолитические ферменты Coccidioides , в частности протеиназы, использующие в качестве субстратов коллаген, эластин и лецитин, способствуют внедрению и распространению возбудителя, вызывая локальные разрушения тканей, подавляя иммунные реакции макроорганизма, а также лизируя оболочки зрелых сферул и окружающую ткань во время высвобождения эндоспор. Кроме того, в экстрактах клеток гриба обнаружена активность изоцитратлиазы и малатсинтетазы – основных ферментов глиоксилатного цикла, которые способствуют прорастанию артроспор при вегетативном цикле размножения гриба. Клеточная стенка Coccidioides содержит ряд гидролаз, которые обеспечивают конверсию артроспор в сферулы в организме млекопитающих.

Грибы рода Coccidioides , как и другие диморфные микромицеты, способны выделять белки, которые связывают половые гормоны, прежде всего эстроген.

Истинных токсинов у гриба не найдено, однако токсические свойства мицелиальной и тканевой форм гриба выявлены при его введении внутрибрюшинно белым мышам в смеси с 5 % муцина. У возбудителя кокцидиоидомикоза обнаружено цитолитическое, цитотоксическое действие на клеточные элементы крови, лейкоциты периферической крови; токсическими для белых мышей при введении с муцином оказались культуральный фильтрат гриба и полисахарид, извлеченный из него, различные типы кокцидиоидинов (мицелиальный и сферульный). Установлены токсические свойства входящих в состав Coccidioides липидов, экстрагированных этанолом, которые вызывали гибель белых мышей. Токсичными оказались и липиды, извлеченные смесью этанол-хлороформ.

3.1.2 Морфологические и культурально-биохимические свойства Histoplasma capsulatum

В естественных условиях обитания, а также в лабораторных условиях при 25-27 °С гриб растет в виде септированного, многоклеточного мицелия диаметром от 1 до 5 мкм. Молодой мицелий гомогенный, по мере старения в нем становятся видны вакуоли и жировые включения. Через 5-10 дней после посева в зависимости от штамма, состава питательной среды и условий культивирования начинается споруляция. Образующиеся споры бывают двух типов: макро- и микроконидии. Макроконидии – крупные (до 15-25 мкм) шиповатые или бугристые, сферические или грушевидные споры. Они образуются в воздушной части мицелия обычно на конце его коротких отростков, но могут быть сидящими на конце длинной гифы. Бугорки или шипики макроконидий имеют длину от 1 до 5-8 мкм. В субстратной части мицелия преобладают макроконидии, не имеющие бугристости. В слое мицелия, вросшем в агар, иногда отмечается образование спор, тело которых окружено ободком субстанции. Это так называемые нимбоспоры.

Другим типом спор, образуемых H . capsulatum , являются микроконидии. Это обычно гладкостенные споры сферической, грушевидной или сигарообразной формы, 2-6 мкм в диаметре, расположенные на короткой боковой гифе терминально. Иногда в культуре можно наблюдать небольшое количество микроконидий, которые в точности воспроизводят по внешнему виду макроконидии, за исключением размера.

Споруляция H . capsulatum зависит от штамма, условий выращивания и состава питательной среды. Одни штаммы продуцируют преимущественно макроконидии, другие на этой же среде – микроконидии. У некоторых штаммов градация размера от микро- к макроконидии изменяется так постепенно, что четкого разграничения между ними сделать нельзя. Штамм, который продуцирует гладкие макрокониидии на одной среде, может образовывать бугристые – на другой. В общем, преобладают мелкие споры, диаметром менее 5 мкм. Они наиболее легко проникают в альвеолы и, конверсируя в дрожжевую фазу, вызывают заболевание. Все первичные изоляты H . capsulatum можно разделить на 2 типа: Albus – белый, с преобладанием гладких макроконидий и широким воздушным мицелием и Brown – коричневый, с массой типичных окрашенных бугорчатых макроконидий. Последние – характерный специфический признак H . capsulatum . Промежуточные типы (С и Д) встречаются реже.

Почти все штаммы гриба при первичном выделении из клинического материала образуют типичные бугристые макроконидии, что очень важно с точки зрения диагностики. При длительном культивировании музейных штаммов гриба на одной и той же питательной среде происходит потеря этого морфологического признака. Это затрудняет идентификацию выросших культур. Предложены разнообразные способы стимулирования продукции бугристых макроконидий. Среди них наиболее часто используют пересев культуры на картофельный агар с 2 % глюкозы, агар Сабуро с фосфорно-кислыми солями натрия или калия. Цельная кровь, температура инкубации выше 30 ⁰ С отрицательно влияют как на рост, так и споруляцию мицелиальной фазы. Оптимальным является рН 6,5-7,5. Споруляция может быть усилена добавлением к питательным средам углеводов и источников азота. На среде с углеводами в присутствии аспарагина наблюдается обильное макроконидиальное спороношение, в присутствии KNO₃ отмечается наличие спор обоих типов, в присутствии же сульфата аммония преобладают гладкостенные макроконидии и микроконидии. Восстановление формирования типичных бугристых макроконидий может быть достигнуто пересевом культуры на среды, содержащие экстракты из перьев птиц, в стерильную почву или пассажем культуры через организм восприимчивых животных (мыши, золотистые хомячки).

Дрожжеподобная фаза гриба in vitro может быть получена лишь выращиванием при 37 ⁰ С на специальных питательных средах, содержащих цистеин. Колонии гриба имеют беловатую, желтоватую или кремовую окраску. Они выпуклой формы, имеют пастообразную консистенцию. Поверхность колоний гладкая, морщинистая, церебриформная, в зависимости от возраста культуры. Зрелые колонии обычно формируются спустя 7-10 сут после посева из клинического материала. Под микроскопом – клетки молодой культуры дрожжеподобной фазы. Это овальные тельца овоидной формы 1,5-2,0 х 3,0-3,5 мкм. У активно растущих клеток один полюс заострен. Почки могут образовываться на одном из двух полюсов, реже аполярно. Из каждой материнской клетки могут образовываться до 3 почек, они повторяют ее форму, имеют ясно выраженную оболочку, но меньше размером.

Дрожжеподобная фаза гриба, полученная in vitro , не совсем идентична форме, паразитирующей в тканях хозяина. Клетки последней меньше, чем полученные в культуре. Величина клеток, в зависимости от способа окраски, варьирует от 1 до 4 мкм в диаметре.

Мицелиальная фаза гриба слабо активна в биохимическом отношении. Она очень медленно (и не всегда) разжижает желатин, не разлагает целлюлозу, не гидролизует альбумин, не изменяет молоко, не образует сероводорода, ацетона или индола, но восстанавливает нитраты в нитриты и гидролизует жиры.

Дрожжеподобная фаза при росте на углеводах не образует ни кислоты, ни газа, но восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индола, не гидролизует крахмал, целлюлозу и не действует на молоко. В общем, дрожжевая фаза более требовательна к составу питательной среды, чем мицелиальная. Зависимость ее от содержания в среде серусодержащих аминокислот позволяет заключить, что она не способна к синтезу этих веществ, являющихся для нее факторами роста.

Ферментативная активность возбудителя гистоплазмоза вряд ли может быть использована в практических целях. Тем не менее, на основании изучения группы гидролитических ферментов показано, что возбудитель гистоплазмоза не обладает плазмокоагулирующей способностью, не проявляет фибриногенолитической активности, но медленно гидролизует азоколл – денатурированный коллаген, который широко используется для определения протеолитической активности таких ферментов, как трипсин, панкреатин и коллагеназа.

Патогенность H. capsulatum, в первую очередь, обусловлена химическим строением клеточной стенки. Наличие в клеточной стенке мицелия и спор гриба большого количества хитина и липидов обеспечивает гидрофобность клеточной стенки возбудителя, что затрудняет захват и переваривание (из-за отсутствия в организме млекопитающих фермента хитиназы) фагоцитированных клеток гриба, и обусловливает незавершенность самого фагоцитоза с вытекающими из этого последствиями (как и при кокцидиоидомикозе). Полисахариды, входящие в состав клеточной стенки H. capsulatum, в частности α-1,3-глюкан также играют важную роль в патогенезе гистоплазмоза.

Одним из главных факторов патогенности H. capsulatum , так же, как и у других диморфных грибов, является способность к образованию тканевой формы, которая более устойчива к действию антимикотиков. Наиболее значимыми стимулами конверсии H. capsulatum в дрожжевую фазу считаются сульфгидрильные группы, представленные цистеином или другими аминокислотами в составе различных белков.

Особенный интерес представляют механизмы защиты гриба от лизиса внутри макрофагов. Клетки H. capsulatum способствуют снижению кислотности среды внутри фаголизосомы до уровня, подавляющего активность кислых гидролаз, но при этом не влияющего на количество ионов железа, необходимых для роста возбудителя.

Кроме того, в составе клеточной стенки возбудителя гистоплазмоза обнаружены адгезины, которые являются одним из факторов патогенности этого гриба. Клеточная стенка также содержит белки, обладающие иммуносупрессивными свойствами, что приводит к подавлению ответных иммунологических реакций.

Истинных токсинов у возбудителя гистоплазмоза не найдено, однако вирулентность обеих фаз гриба повышается при его внутрибрюшинном введении белым мышам в смеси с 5 % муцина. У возбудителя гистоплазмоза обнаружено цитолитическое, цитотоксическое действие на клеточные элементы крови, лейкоциты периферической крови.

Размер спор возбудителя гистоплазмоза играет немаловажную роль в патогенезе заболевания. Микроконидии проникают глубоко в альвеолы, тогда как макроконидии чаще выводятся из дыхательных путей их мерцательным эпителием. Наличие у конидий шипов способствует их фиксации на клетках альвеолярного эпителия.

3.1.3 Морфологические и культурально-биохимические свойства Blastomyces dermatitidis

В природных условиях и при комнатной температуре (20-25 °С) на среде Сабуро с глюкозой вырастают колонии мицелиального типа. Они полиморфны, на­ряду с куполообразно приподнятыми складчатыми и кожистыми встре­чаются мучнистые, бархатистые и даже с выраженным воздушным мицелием на поверхности. Окраска их вначале белая, позднее корич­неватая. Основание колоний плотно спаяно с питательной средой. Пигмент в среду не диффундирует. При микроскопии в кожистых колониях обнаруживается широкий септированный мицелий, множе­ственные ветвления, обилие спор. Мучнистые варианты имеют кони­дии круглые, вытянутые, одиночные, сидящие на конидиеносцах.

При пересеве мицелиальной культуры на мясо-пептонные среды с глюкозой и инкубировании при 37 °С вырастают (сразу или в пересевах) гладкие культуры, иногда мозговидные, похо­жие на дрожжевые. Цвет их вначале беловато-желтый, позже — коричневатый. По мере старения поверхность колоний становится морщинистой, неровной, радиально исчерченной или петлистой. При микроскопии наряду с мицелиальными эле­ментами обнаруживаются дрожжеподобные клетки, аналогичные таковым в пораженных тканях.

Тканевая (паразитарная) фаза имеет вид дрожжеподобных клеток диаметром до 15 мкм и толщиной стенок от 0,5 до 0,75 мкм. Некоторые клетки почкуются, но имеют одну до­чернюю клетку и очень редко 2-3. Клетки дрожжевой фазы имеют четко видимую двухконтурную оболочку, в составе которой содержит­ся хитин.

Некоторые авторы выделяют американскую и африканскую разно­видность B . dermatitidis . Они не различаются в мицелиальной фазе, но в отличие от американских, африканские штаммы с трудом конверсируют в дрожжеподобную на искусственных питательных средах.

Биохимические свойства B . dermatitidis изучены слабо, так как они вариабельны и поэтому редко используются для его видовой идентификации.

Главными факторами патогенности, как и у других диморфных грибов, являются хитин и α-глюканы клеточной стенки. Кроме того, известен адгезин, который к тому же считается основным антигеном, вызывающим клеточные и гуморальные реакции. Это белок клеточной стенки WI-1, образующийся только в дрожжевой фазе.

3.1.4 Морфологические и культурально-биохимические свойства Paracoccidioides brasiliensis

Гриб неприхотлив в выборе питательных сред. В мицелиальной фазе он растет на обычных средах с углеводами, на кровяном и сывороточном агаре, на моркови с глицерином, а также на синтетических средах с углеводами и аминокислотами. При комнатной температуре гриб развивается медленнее, чем при 37 °С. В первоначальных посевах патологического материала рост несколько более замедлен, чем при пересеве лабораторных штаммов. При комнатной температуре одномесячные культуры представляются складчатыми, в центре покрыты беловато-сероватым пушком.

Мицелий септированный, конидии овальные на коротких конидиофорах. В старых культурах обнаруживаются крупные хламидоспоры. Вид гриба под микроскопом очень похож на
возбудителя бластомикоза. Некоторые культуры образуют на агаре Сабуро красный пигмент, исчезающий через несколько недель.

В инфицированных тканях гриб растет в виде дрожжевой фазы, представленной сферическими почкующимися клетками размером от нескольких до 30 (редко 60) мкм в диаметре. Стенка клеток плот­ная, толщиной от 0,2 до 1 мкм в диаметре в зависимости от возраста. Почка может появиться в любой точке поверхности клетки, не изменяя ее сферической формы. Она соединена с родительской клеткой с помощью тонкого перешейка. Это явное отличие от возбудителя бластомикоза, где почкующаяся клетка име­ет слегка овальную форму, с одной или несколькими почками, соединенными с родительской клеткой с помощью широкой соединительной поры. Стенки родительской клетки и почки тоньше, чем у В. dermatitidis . Почки легко отделяются от родительской клетки. Их может быть несколько, а иногда родительская клетка имеет как бы корону из почек, что является важным диагностическим признаком этого гриба.

Конвер­сия мицелиальной фазы в дрожжевую происходит как на средах, богатых белком, так и на простых пита­тельных средах. Обязатель­ным условием является лишь температура 37 °С.

Гриб в культуре биохимически мало активен, поэтому для его идентификации пробы на усвоение и фермен­тацию питательных веществ не рекомендуются.

К основным факторам патогенности P. brasiliensis относят глюканы клеточной стенки, в первую очередь, α-1,3- глюкан, а также β-глюканы, которые, предположительно, защищают возбудитель от распознавания иммунокомпетентными клетками макроорганизма и влияют на образование ряда цитокинов. Важным фактором патогенности является внеклеточный белок gp-43, обладающий протеиназной активностью и способностью связываться с ламинином, за счет которого происходит адгезия к базальной мембране в организме человека.

Немаловажная роль в патогенезе паракокцидиоидомикоза принадлежит эстроген-связывающему комплексу. Действие эстрогенов препятствует переходу гриба в инвазивную дрожжевую фазу, что связывают с устойчивостью взрослых женщин к паракокцидиоидомикозу.

4 Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования

Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб клинического и секционного материала от людей и из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».

4.1 Взятие материала от человека

Для исследования может быть взята практически любая ткань или биологическая жидкость из организма человека. Наиболее часто материалом для исследования служат мокрота, смывы с бронхов, плевральный выпот, соскобы и гной из кожных очагов и свищевых ходов, кровь, цереброспинальная жидкость, биопсийная ткань.

Мокроту собирают в стерильную баночку с завинчивающейся крышкой или чашку Петри после предварительной обработки полости рта или зева 2 % раствором бикарбоната натрия, буры, стерильным изотоническим раствором хлорида натрия или слабо розовым раствором марганцевокислого калия.

Промывные воды бронхов, придаточных пазух и полостей носа, плевральный экссудат, спинномозговую жидкость (не менее 3 мл) собирают в стерильные пробирки; кровь на гемокультуру (при подозрении на фунгемию) берут в количестве 5-10 мл из локтевой вены; фекалии (последнюю порцию) отбирают в стерильную посуду с завинчивающейся пробкой, также берут и мочу (10-15 мл) после туалета наружных половых органов. Отделяемое язв, свищей можно собирать в стерильные пробирки, а при малом количестве отделяемого материала используют стерильный тампон, пастеровскую пипетку или бактериологическую петлю. Также берут отделяемое наружного слухового прохода, конъюнктивы, отделяемое с других слизистых оболочек.

Кусочки органов, пунктаты костного мозга и биопсийную ткань помещают в 2 стерильные баночки, одну из которых заливают 10 % формалином (гистологическое исследование), а вторую используют для посева (микологическое исследование).

Если исследуемый материал нестерилен, то для подавления роста бактериальной флоры в него необходимо добавить антибактериальные антибиотики широкого спектра действия, а также антифунгальные антибиотики для подавления роста плесневых грибов. Материал с добавленными антибиотиками перед дальнейшим исследованием инкубируют при 37 °С в течение 1ч.

При исследовании мокроты, гноя, кала, в которых в большом количестве содержатся посторонние примеси (лейкоциты, гибнущие тучные клетки, пыльца растений, непереваренные остатки пищи и т.д.), необходимо так называемое «просветление» патологического материала. Для этого используются 10% раствор едкого калия или натрия в смеси с равным количеством патологического материала с последующей их экспозицией в течение 10-15 мин.

Однако следует иметь в виду, что такой обработке может подвергаться только та часть материала, которая не предназначена для посева или заражения животных.

4.2 Взятие материала из объектов окружающей среды и сырья растительного происхождения

Шерсть, хлопок . Для исследования шерсть отбирают из разных мест, не менее 5 образцов массой около 2 г каждый (лучше брать пучки загрязненной шерсти). Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

Почва. Пробы почвы с мест вероятного обсеменения клетками мицелиальной фазы возбудителей особо опасных микозов берут на глубине до 3 см. При этом при заборе проб с больших участков обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб. Каждую пробу весом около 100-200 г помещают в мешочек из плотной ткани с завязками или в лабораторную посуду (широкогорлый флакон, банку), закрытую пробкой из такой же ткани. Место отбора проб дезинфицируют раствором хлорной извести, содержащей 5 % активного хлора, инструменты - огнем паяльной лампы.

Вода. Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10-15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют как пробы почвы.

Смывы с объектов внешней среды. Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения грибами с помощью стерильного тампона, смоченного стерильной дистиллированной водой. Площадь смыва одним тампоном около 100 см² . Тампоны затем помещают в пробирки, заливают стерильной дистиллированной водой (15 мл) и закрывают пробкой.

Сельскохозяйственные культуры . Пробы берут как из поверхностных, так и из глубоких слоев равномерно по всей площади. Отбор проб проводят сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и обжигают огнем паяльной лампы. В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных проб данной партии, емкости и т.п. Масса средней пробы должна быть не менее 500 г.

Воздух . Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов, снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого воздуха должен составлять не менее 3-5 м³ .

Для исследования методом ПЦР отбор проб осуществляют так же, как и для бактериологических исследований. Для анализа могут быть использованы пробы из объектов окружающей среды, шерсти, хлопка, зерна, почвы, воды, смывов с поверхностей.

4.3 Направление материала на исследование

Транспортирование и хранение биологического материала для исследования методом ПЦР должны осуществляться с соблюдением «холодовой цепи»: образцы цельной крови – при температуре 2-8 °С – в течение 1 сут; образцы плазмы и сыворотки крови – при температуре 2-8 °С – в течение 5 сут, при температуре минус 70 °С – длительно.

Образцы остальных видов биологических материалов – при температуре 2-8 °С – в течение 1 сут, при температуре минус 20 °С – в течение 1 недели, при температуре минус 70 °С – длительно. Допускается только однократное замораживание-оттаивание материала.

Патологический материал для исследования помещают в стерильную посуду (пробирки, банки или другую лабораторную посуду). Высушенные на воздухе мазки кладут в стерильные чашки Петри, которые обертывают плотной бумагой с надписью «мазок не фиксирован». В направлении к материалу от больного человека или трупа указывают фамилию, имя, отчество больного (умершего), место и время взятия материала, его наименование и предположительный диагноз. Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве, достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись «верх, осторожно». Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте.

В сопроводительной к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала. Для проб шерсти, зерновых и хлопка дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительной прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы.

5 Порядок проведения исследований

Все работы по проведению исследования материала, подозрительного на наличие возбудителей особо опасных микозов, проводят с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Лабораторная диагностика особо опасных микозов требует проведения следующих этапов:

- обнаружение элементов гриба в патологическом материале;

- выделение чистой культуры из патологического материала микологическим или биологическим методами;

- обнаружение антигенов иммунологическими методами;

- выявление и идентификация ДНК грибных патогенов молекулярно-генетическими методами;

- изучение ответных реакций организма с помощью иммуно-серологических и аллергических проб.

5.1 Микроскопия и гистологическое исследование патологического материала

5.1.1 Coccidioides spp.

Микроскопию исследуемого материала от больных проводят чаще в препаратах по типу «раздавленной капли». Для окраски микробиологических препаратов применяют калькофлуор белый, возможно использование 10% гидроксида калия для просветления патологического материала. Однако гриб, ввиду наличия толстой светопреломляющей оболочки, может быть виден и в нативных препаратах. Дополнительные методы окраски, как правило, применяются при гистологическом исследовании, при этом чаще всего используется гематоксилин-эозин. Иногда для четкой визуализации сферул требуются специфические виды окраски, такие как серебрение по Гомори-Грокотт и PAS-реакция.

В патологическом материале грибы рода Coccidioides обнаруживаются в виде сферул, которые представляют собой крупные, круглые образования, напоминающие спорангии фикомицетов. Стенка их толстая, двухконтурная. Размеры сферул варьируют от 10 до 200 мкм, в среднем, 60-80 мкм. В зависимости от стадии развития сферулы могут быть пустыми или содержащими эндоспоры (2-4 мкм в диаметре).

При микроскопировании материала, полученного из окружающей среды, гриб выглядит как тонкий, септированный, ветвящийся мицелий, боковые ответвления которого дают начало одноклеточным бочковидным артроконидиям (3-4 х 3-6 мкм), чередующимся с пустыми клетками-дизъюнкторами.

5.1.2 H . capsulatum

Микроскопическое исследование патологического материала в диагностике гистоплазмоза имеет вспомогательное значение ввиду отсутствия специфических признаков тканевой формы возбудителя. Гриб в патологическом материале имеет вид мелких (2-3 мкм в диаметре) почкующихся клеток овальной или яйцевидной формы. Почки (2-3) располагаются, как правило, по полюсам родительской клетки. После обработки патологического материала по общим правилам, с целью его просветления, готовят препарат по типу «раздавленной капли» и просматривают в микроскопе под иммерсией. Однако ввиду малых размеров тканевой фазы возбудителя и его внутриклеточного расположения, гриб в неокрашенных препаратах обнаруживают редко. Исключением является материал, взятый со стенок каверн, в которых гриб находится в мицелиальной фазе. В таких препаратах можно обнаружить тонкий септированный мицелий и типичные бугристые или шиповидные макроконидии размером до 10-20 мкм.

Более обнадеживающие результаты могут быть получены при исследовании материала (мазки крови, осадок спинномозговой жидкости, пунктаты печени, селезенки, лимфоузлов, костного мозга), окрашенного одним из гематологических красителей: краской Романовского-Гимза, Лейшмана, Райта, Май-Грюнвальда. При микроскопии гриб виден в цитоплазме фагоцитов в виде мелких базофильных телец, окруженных бесцветным ореолом, который раньше принимали за капсулу.

5.1.3 B . dermatitidis

При микроскопическом исследовании патологического материала следует обращать внимание на почкующиеся клетки, для которых характерна прочная связь между родительской и дочерней клетками с помощью широкого основания. Фактически может появляться вторая и третья почки до того как отделится первая, так что иногда можно видеть глыбки из 1-4 клеток. От грибов рода Candida возбудитель бластомикоза отличается большей величиной клеток и отсутствием псевдомицелия, от возбудителя паракокцидиоидомикоза – отсутствием почкообразования в виде "короны", от воз­будителя кокцидиоидомикоза – отсутствием сферул, от возбудителей актиномикоза - отсутствием друз.

При кожной форме вскрывают милиарный абсцесс и острым скальпелем выдавливают каплю гноя. Смешивают его с равным коли­чеством 10-15% гидроксида натрия или калия на предметном стек­ле, накрывают покровным стеклом и исследуют под малым и большим увеличением микроскопа. Внешний вид гриба в дрожжевой фазе, в том числе и в патологическом материале, описан выше.

Для лабораторной диагностики легочной формы собирают мокроту утром натощак после туалета полости рта. Материал иссле­дуют сразу же. Клетки гриба настолько крупные и заметные, что их окраска не является обязательной. При невозможности немедленной микроскопии фиксированные мазки окрашивают обычными методами по Граму, Романовскому - Гимзе, Райту, Мак-Манусу и др.

5.1.4 P . brasiliensis

Образцы гноя и отделяемого, обработанные раствором КОН, подвергают микроскопическому исследованию для обнаружения дрожжеподобных клеток с тонкой оболочкой, окруженных множеством почкующихся клеток с суженным основанием, что напоминает корабельный штурвал или корону – признак патогномоничный для паракокцидиоидомикоза.

Тканевые формы видны при окраске гематоксилином и эозином, но более демонстративны при PAS-окраске и импрегнации по Гомори-Грокотт.

5.2 Культуральный (микологический) метод

5.2.1 Coccidioides spp .

Микологическое исследование является самым важным этапом лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза. Успех культурального исследования определяется наличием в исследуемом материале жизнеспособных элементов гриба, степенью его микробного загрязнения и качеством питательных сред. Для выращивания мицелиальной фазы гриба применяют агар Сабуро с 1-1,5 % дрожжевого экстракта (или аутолизата) и 4 % глюкозы. В среду добавляют антибактериальные антибиотики широкого спектра действия, чаще левомицетин (хлорамфеникол) – 0,05 мг на 1 мл среды, а также актидион (циклогексимид) – 0,1-1,0 мг на 1 мл среды, который подавляет рост посторонних грибов, но не влияет на рост Coccidioides spp .

Начало роста на плотных средах отмечается на 3-4 дни после посева, а формирование артроспор – на 5-7-10 сутки в зависимости от индивидуальных особенностей штаммов. На жидких питательных средах рост более интенсивный, но формирование типичных артроспор происходит позднее.

По характеру роста культуры Coccidioides spp . мало чем отличаются от ряда других нитчатых грибов: рыхлый, местами высокий или редкий пушистый мицелий серовато-белого цвета, иногда желтоватый или светло-коричневый с мучнистым налетом. Это ориентировочные признаки для отбора колоний подозрительных культур.

После выявления на средах зрелой грибницы посевы с плотной среды заливают стерильным 0,85 % раствором NaCl при помощи шприца с длинной иглой (для предупреждения распыления артроспор). Из взвеси готовят мазок по типу «раздавленной капли».

Наличие артроспор типичной бочонкообразной, квадратной или цилиндрической формы с клетками – разобщителями («усами») является важным признаком для идентификации культур Coccidioides spp . Однако следует помнить о наличии морфологически сходных сапрофитических грибов, которые, однако, не патогенны для млекопитающих и не образуют сферул.

Набор сред для выделения и идентификации культур Coccidioides spp . ограничен следующими: а) агар Сабуро (эта же среда может быть использована и для хранения музейных культур возбудителя при 4 ⁰ С в течение 3-6 мес), бульон Сабуро; б) среда Чапека-Докса. Эта среда рекомендуется для длительного хранения музейных штаммов Coccidioides spp . , так как на ней сохраняются типичные морфологические свойства, присущие всем штаммам этого гриба.

5.2.2 H . capsulatum

Патологический материал после обработки антибиотиками (если материал нестерилен) засевают на среды, используемые отдельно для выращивания мицелиальной (агар Сабуро, сусло-агар, мясо-пептонный) и дрожжеподобной (сердечно-мозговой агар, среда Френсиса) фаз. Посевы инкубируют при 28 ⁰ С и

37 ⁰ С в течение 30 и 10 сут соответственно. Выросшие культуры микроскопируют с целью обнаружения типичных морфологических элементов гриба. При одновременном выделении мицелиальной и тканевой форм возбудителя диагноз гистоплазмоза становится несомненным. Для его окончательного подтверждения пробирку с выросшей тканевой формой дополнительно инкубируют при пониженной температуре (26-28 ⁰ С). Гриб в течение 7-14 дней конверсирует из дрожжеподобной в мицелиальную фазу. При получении только мицелиальной фазы возбудителя ее пересевают на агар Френсиса и выращивают при 37 ⁰ С 7-10 сут с целью получения дрожжеподобной. При получении только дрожжеподобной фазы снижают температуру инкубации до 28 ⁰ С – для получения мицелиальной.

5.2.3 B . dermatitidis

Посевы материала производят как на углеводные среды — агар Сабуро, сусло-агар, так и на мясо-пептонные с добавлением глюкозы (1-2%) или крови. Для получения гриба в мицелиальной фазе посевы инкубиру­ют при температуре 20-30 °С, для дрожжевой — при 37 °С. Более надежно гриб высевается из материала, инкубированного при низких температурах. Загрязненный посторонней микрофлорой материал засевают на среды, содержащие антибиотики (пенициллин, стрепто­мицин, левомицетин, актидион). Однако антибиотики не добавляют, если посевы инкубируются при 37 °С, так как при этом рост гриба угнетается антибиотиками. B.dermatitidis растет довольно медленно и посевы должны инкубироваться до 30 сут.

5.2.4 P . brasiliensis

Гриб хорошо растет на самых разнообразных питательных средах и не требует каких-либо специальных добавок для своего культивирования. При первичном посеве используют одну и ту же питательную среду, меняя только температуру инкубации: до 30 °С – для выращивания мицелиальной формы и 37 °С - для дрожжеподобной. Основная задача культивирования – это получение культуры в двух фазах с целью доказательства диморфизма возбудителя, так как в мицелиальной фазе роста гриб нельзя отличить от многих, в том числе и непатогенных для человека грибов.

5.3 Биологический метод

Заражение биопробных животных применяется как для освобождения патологического материала от посторонней флоры, так и для оценки вирулентности патогена.

Взвесь испытуемой культуры или патологического материала (0,5-1,0 мл) вводят внутрибрюшинно белым мышам или интратестикулярно морским свинкам. Для предотвращения гибели животных от посторонней микрофлоры к исследуемому материалу рекомендуется добавить антибиотики, выдержать смесь в термостате при 37 °С в течение часа, а затем уже ввести животным. Обработка биопробных животных кортикостероидами (внутримышечно или подкожно по 1,5 мг в течение 6 дней) существенно снижает их резистентность.

На каждый образец патологического материала берут по 4 животных. Вскрытие животных проводят через 2 и 4 недели.

При наличии грибов рода Coccidioides в исследуемом материале, сферулы в органах зараженных животных можно идентифицировать как с помощью обычной, так и люминесцентной микроскопии за счет способности сферул светиться в сине-фиолетовых лучах (аутофлуоресценция). Единственным надежным критерием для подтверждения микотической природы сферул является их прорастание. Наилучшие условия для быстрого прорастания сферул (в первые 24 ч) создаются в раздавленных и запарафинированных по краю покровного стекла каплях изотонического раствора хлорида натрия с содержанием пенициллина и стрептомицина по 200 ЕД/мл при температуре инкубации 37 ⁰ С. В первые 2-16 ч прорастают свободно лежащие эндоспоры, через 16-48 ч – молодые сферулы, некоторые сферулы прорастают только через 72 ч, давая одновременно от 1 до 4-5 ростков. Наряду со сферулами в патологическом материале иногда удается обнаружить мицелий в виде коротких или длинных нитей. Такие находки возможны при исследовании смыва из каверн. При микроскопическом исследовании значение имеют лишь положительные результаты (обнаружение сферул), а отрицательные данные не позволяют исключить кокцидиоидную природу микоза.

Кроме того, из органов брюшной полости необходимо сделать посевы внутренних органов (печень, селезенка) на те же питательные среды. Сроки инкубации и порядок учета результатов аналогичны описанным для микологического метода исследования. Для оценки вирулентности возбудителя целесообразно посеять и кусочки легких, так как находки гриба в них свидетельствует о диссеминации. Выросшую культуру микроскопируют, как описано выше.

Точный диагноз гистоплазмоза основан на выделении и идентификации грибов в культуре или обнаружении типичных внутриклеточно расположенных элементов дрожжевой фазы в тканях, однако для подтверждения диагноза следует добиться конверсии мицелиальной формы с типичной микроскопической структурой, то есть с бугорчатыми макроконидиями и гладкостенными микроконидиями – в дрожжеподобную. Для получения конверсии in vitro мицелий тщательно растирают в ступке с физиологическим раствором. Эту взвесь засевают в несколько пробирок с агаром Фрэнсиса, которые инкубируют при

37 ⁰ С. Для получения чистой культуры в дрожжевой фазе иногда приходится делать от 2 до 5-6 пересевов на ту же среду. Идентификация дрожжевой фазы производится получением конверсии ее в мицелиальную, для чего применяется инкубация при 25-30 °С на агаре Сабуро с фосфорнокислыми солями или на картофельном агаре с 2 % глюкозы и изучение патогенности для биопробных животных с повторным получением чистой культуры гриба в двух фазах.

При диагностике бластомикоза биологический метод имеет меньше преимуществ перед получением культуры, чем при кокцидиоидомикозе или гистоплазмозе. B . dermatitidis патогенен для мышей, но в сроки от 3-4 недель в брюшной полости образуются только мелкие абсцессы без генерализации заболевания. Мышей забивают через 3-4 недели, исследуют гной и делают его посев из любых мелких абсцессов, найденных в брюшной полости. Они обычно бывают в сальнике, вблизи поджелудочной железы и часто припаиваются к брюшине, печени, селезенке или находятся в области таза. Патогистологическое исследование для диагностики бластомикоза используется редко, так как оно не имеет никаких преимуществ перед микроскопией и получением культуры в чистом виде.

P . brasiliensis не является высоко патогенным для лабораторных животных, поэтому биологический метод диагностики паракокцидиоидомикоза используется чаще в научных, нежели в практических целях.

5.4 Иммуно-серологические методы исследования

5.4.1 Кокцидиоидомикоз

Для проведения иммунодиагностических исследований используют МФА, РНГА, РИД, РЛА, РСК и ИФА.

Метод флуоресцирующих антител является одним из наиболее чувствительных и достоверных методов обнаружения возбудителей особо опасных микозов в различных объектах исследования. С помощью МФА предварительный ответ может быть получен в течение 1-2 час от начала исследований нативного материала.

Для постановки МФА используются «Иммуноглобулины флуоресцирующие кокцидиоидные сухие», приготовленные на основе антител кроличьих сывороток против артроконидий (артроспор) Coccidioides . Они обладают группоспецифическими свойствами, взаимодействуя с возбудителями кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза, бластомикоза и паракокцидиоидомикоза. Чувствительность МФА – 1х10⁵ клеток/мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследование материала проводится согласно инструкции по применению препарата.

Для обнаружения антигенов Coccidioides spp . используют РНГА с эритроцитарным диагностикумом («Диагностикум эритроцитарный кокцидиоидозный иммуноглобулиновый сухой»). Диагностикум представляет собой формализированные танизированные эрит­роциты, нагруженные иммуноглобулинами М противококцидиоидных сывороток. Препарат предназначен для обнаружения арт­роспор Coccidioides в пробах из объектов внешней среды. Чувствительность РНГА составляет 1x10⁴ - 1x10⁵ кл/мл по подсчету в камере Горяева или 5х10⁶ – 5х10⁷ кл/мл по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Исследование материала проводится согласно инструкции по применению.

Самым простым и доступным методом определения антител (IgM и IgG) считается РИД. Преимущество РИД состоит в том, что по характеру линий преципитата можно выявить специфические системы антиген-антитело. Однако ее чувствительность невысока – 73%, по сравнению с РСК (75%) и ИФА (87%), к тому же постановка РИД требует длительного периода инкубации – до 4 дней.

РЛА и ИФА являются наиболее чувствительными методами, но возможны ложноположительные результаты, которые должны подтверждаться с помощью РИД.

РСК и ИФА, отличающиеся значительной трудоемкостью, находят ограниченное применение в практических лабораториях. Тем не менее, ИФА обладает наибольшей чувствительностью, особенно в период ранней инфекции, в то время как использование РСК и РИД предпочтительно в более поздний период развития кокцидиоидомикоза.

Прогнозировать развитие инфекции позволяют количественные тесты, в первую очередь РСК, с помощью которой определяют уровень IgG. Нарастание количества IgG или титры IgG 1:32 и выше указывают на активность инфекционного процесса и возможность развития диссеминированной формы кокцидиоидомикоза. Однако IgG могут отсутствовать у иммунокомпрометированных пациентов, таких как больные СПИД, сахарным диабетом или больные, получающие иммуносупрессивную терапию. Кроме того, существующие коммерческие тест-системы могут существенно отличаться по чувстви­тельности и специфичности. В связи с этим результаты серологических исследований требуют подтверждения другими методами лабораторной диагностики, и, в первую очередь, культуральным.

Для диагностики кокцидиоидомикоза имеются зарубежные коммерческие тест-системы:

- тест-система для выявления антикокцидиоидных антител путем агглютинации частиц латекса (Coccidioides latex agglutination system) и реакции иммунодифузии (Meridian, Bioscience, Inc., USA).

- тест-система для количественного определения IgM и IgG-антител к кокцидиоидным антигенам (TP, СF) в твердофазном иммуноферментном анализе (Premier™ Coccidioides EIA, Meridian, Bioscience, Inc., USA).

-тест-система определения методом двойной иммунодиффузии сывороточных антител к микромицетам рода Coccidioides (Hyland– Coccidioidomycosis immunodiffusion test).

5.4.2 Гистоплазмоз

Для диагностики гистоплазмоза широко используются такие методы как МФА, РСК, РИД, ТИФА и иммуноблотинг.

В качестве антигенов в серологических тестах обычно исполь­зуют гистоплазмин или компоненты, выделенные из культурального фильтрата мицелиальной фазы, а также целые дрожжевые клетки.

Существующие трудности интерпретации результатов сероло­гических тестов связаны с наличием общих антигенов Н. capsulatum, В. dermatitidis и Coccidioides spp .

В настоящее время имеется коммерческая тест-система для выявления преципитирующих антител при гистоплазмозе - HP-test latex histoplasmin reagent (HP-test, «Hyland»).

Для диагностики гистоплазмоза используют реакцию преципитации в агаре. Преципитины появляются в начале болезни, на 2-3 неделе, сохраняются 4-6 недель. В качестве антигена в реакции преципитации обычно применяют гистоплазмин или его фракции. Для идентификации полос преципи­тации необходим контроль с заведомо положительной референс-сывороткой. Обнаружение линий преципитации к двум важным диагностическим антигенам H. capsulatum – H и М, один из наиболее широко доступных методов для диагностики. Специфичность этого теста составляет 70 - 100 %.

Реакция связывания комплемента (РСК) является более чувствительной, чем реакция преципитации (70 - 90 %), но менее специфичной (70 - 80 %). В качестве антигенов в данной реакции можно использовать как цельные клетки дрожжевой фазы, так и гистоплазмин. Следует отметить, что при использовании любых антигенов они дают перекрестные реакции с сыворотками от больных другими микозами (бластомикоз, кандидоз, кокцидиоидомикоз, паракокцидиоидомикоз). Антитела появляются на 3-6 неделях после инфицирования H. сapsulatum у 95 % пациентов с диагнозом гистоплазмоза, и повторные тесты дают положительные результаты в течение многих месяцев. Титры между 1:8 и 1:16 считаются слабоположительными и определяются в почти в 25 % случаев. Однако эти титры антител могут свидетельствовать о прошедшей инфекции или обнаруживаться в сыворотках здоровых людей из эндемичных по гистоплазмозу регионов. Высокие титры (1:32 и больше) или четырехкратное увеличение титра в течение времени – показатель острого гистоплазмоза.

При постановке ИФА используют различные антигенные препараты (гистоплазмин, экстракт дрожжевых клеток). Чувствительность составляет 45% - 100% в зависимости от длительности заболевания.

Методы, основанные на обнаружении антигенов, в ряде случаев могут быть более эффективными, чем выявление антител (при диагностировании гистоплазмоза в острой фазе, при диссеминированном гистоплазмозе у пациентов с ВИЧ-инфекцией). Антигены можно обнаружить при исследовании крови, плевральной, бронхоальвеолярной и цереброспинальной жидкостей, в моче.

Для обнаружения и идентификации антигенов H. capsulatum в мокроте и в тканях органов используют МФА и ИФА.

5.4.3 Бластомикоз

Для серологической диагностики бластомикоза используются РИД, РСК, а также различ­ные варианты реакции РНГА и РЛА. Чувствительность РИД составляет 80%, тогда как РСК лишь 50%. Для идентификации полос преципи­тации необходим контроль с заведомо положительной референс-сывороткой. Тем не менее, отрицательный результат обеих реакций не исключает диагноз бластомикоза.

Широко используется в различных иммунологических реакциях референс-сыворотка, приготовленная на основе видоспецифи­ческого, так называемого А-антигена. Очищенный А-антиген состоит из 5 больших гликопротеиновых комплексов. Из этих компонентов только 2 связаны с А-антигенной активностью возбудителя бластомикоза. РИД с А-антигеном в настоящее время применяют как для идентификации культур возбуди­теля бластомикоза, так и для обнаружения антител в сыворотках больных. Более точный диагноз может быть поставлен при соче­танном использовании РИД и РСК.

Для иммунодиагностики бластомикоза используют различные модификации ИФА как с А-анти­геном, так и антигенами дрожжевой фазы гриба. Для мечения антител применяют преиму­щественно щелочную фосфатазу, однако хорошие результаты получены и при метке уреазой. При сравнительной оценке чувствительности ИФА, РСК и РИД со взвесью дрожжевых клеток в качестве антигена показано, что чувствительность первого метода превосходила таковую РСК и РИД. Однако отмечено наличие у некоторых штаммов возбудителя бластомикоза антигенов, реагирующих перекрестно с сыворотками больных гистоплазмозом.

В работах зарубежных исследователей показана перспективность использования антигенов клеточной стенки дрожжевой формы B. dermatittidis (BAD1 и α-(1,3)-глюкан) для разработки диагностических тест-систем.

5.4.4 Паракокцидиоидомикоз

Наибо­лее часто применяются РИД и иммуноэлектрофорез с различными антигенами мицелиальной или дрожжевой фаз.

Для выявления антител у больных легочной формой может быть использован метод подавления твердофазного иммуноферментного анализа, основанный на выявлении молекул антигенов 43 кДа и 70 кДа в бронхоальвеолярном лаваже, а также дот-блот-анализ как альтернатива ИФА для выявления 27кДа рекомбинантного антигена.

5.5 Молекулярно-генетические методы исследования

В качестве альтернативных способов выявления и идентификации грибных патогенов в последнее время все более активно используются молекулярно-генетические методы.

Работу выполняют в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1794 – 03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».

5.5.1 Обеззараживание проб для исследования методом ПЦР

Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность возбудителями особо опасных микозов, проводится в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Отобранные для исследования пробы могут быть инактивированы следующими способами:

А) Для обеззараживания предварительно подготовленного нативного материала в пробирки с тестируемыми образцами добавляют раствор мертиолята натрия до конечной концентрации 1:1000 и прогревают на водяной бане при температуре (56±1) ⁰ С в течение 40 мин и далее инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч.

К пробам крови добавляют раствор мертиолята натрия (до конечной концентрации 1:1000) и выдерживают при комнатной температуре 24 ч.

Б) Обработка лизирующим буфером, содержащим гуанидинтиоцианат Na и фенол.

К пробе объемом 0,1 мл добавляют 600 мкл лизирующего раствора, содержащего 6 М гуанидинтиоцианат натрия и фенол (приложение 2), забуференный Tris-HCl, pH 8,0 (в соотношении 1:1), и перемешивают на вортексе в течение 10 с. Затем инкубируют при 95 ⁰ С в течение 30 минут. Для этого используют микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с защелкой.

Обработанные таким образом пробы считаются обеззараженными и всю последующую работу проводят как с незаразным материалом.

Для проведения этого этапа и дальнейшего выделения ДНК готовят необходимые реактивы (приложение 2).

5.5.2 Выделение ДНК

На этапе обработки лизирующим раствором используют микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с защелкой.

Выделение ДНК из чистых культур микромицетов после обеззараживания проб осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом. Подготовленные пробы в объеме 100 мкл смешивают с 600 мкл лизирующего буфера, содержащим 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата натрия и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0, и перемешивают на вортексе в течение 10 с. Для лизирования клеток грибов пробы инкубируют в течение 30 мин при температуре 95 ⁰ С. После этого образец центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 10 с для осаждения конденсата. Затем к пробе добавляли 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют в течение 5 мин при 12000 об/мин. После центрифугирования верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и добавляют 0,1 объема 3M ацетата натрия и равный объем изопропанола для осаждения ДНК. Смесь перемешивают и выдерживают 1 час при –20 ⁰ С. После осаждения ДНК пробы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин, отбирают супернатант. Осадок дважды промывают 500 мкл раствора для отмывки 1, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70 % этанола. После этого осадок высушивают при температуре 60 ⁰ С в течение 10 мин и растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера. Супернатант используют для постановки ПЦР.

Выделение ДНК из проб почвы и воды проводится путем гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции. Подготовленные пробы почвы и воды в объеме 100 мкл смешивают с лизирующим буфером, содержащим 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата натрия и 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0, лизис клеток проводят при 95 ⁰ С в течение 30 мин. После этого образец центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 10 с для осаждения конденсата.

Затем к пробе добавляют 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют на микроцентрифуге при 12000 об/мин в течение 5 мин, после чего верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и экстрагируют равным объемом хлороформа. Этот этап повторяют 2 раза. Центрифугируют в течение 5 мин при 12000 об/мин.

Далее верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и добавляют 20 мкл раствора сорбента, содержащего 10мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 10 мкг сорбента SiO₂ , который предварительно тщательно перемешивают на вортексе. Пробы инкубируют при температуре 60 ⁰ С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК.

Затем пробы центрифугируют при 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с, отбирают супернатант, а к осадку добавляют 100 мкл 4 М раствора гуанидинтиоцианата натрия. Содержимое перемешивают до гомогенного состояния в течение 10-20 с на вортексе, центрифугируют на микроцентрифуге в том же режиме и отбирают супернатант. К осадку добавляют 500 мкл раствора для отмывки 1, содержащего 10 мМ Трис, 50 мМ NaCl и 70 % этанола, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Процедуру отмывки повторяют, после чего осадок высушивают при температуре 60 ⁰ С в течение 10 мин. Для растворения ДНК к осадку добавляют 100 мкл ТЕ-буфера, выдерживают при температуре 60 ⁰ С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе. По окончании процедуры десорбции взвесь центрифугируют при 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 1-2 мин и отбирают супернатант для проведения ПЦР.

Для выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из крови используют такой же метод выделения, как и для экстракции и очистки ДНК из почвы, за исключением того, что перед этапом подсушивания осадок ДНК дополнительно промывают 500 мкл ацетона, перемешивают на вортексе и центрифугируют 12000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с, после чего высушивают при температуре 60 ⁰ С в течение 10 мин и растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера.

При исследовании секционного материала часть биоптата (печень, селезенка, легкое, сердце) массой около 30 мг растирают тефлоновым гомогенизатором в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл с 300 мкл 6 М гуанидинтиоцианата натрия, затем добавляют 300 мкл фенола, забуференного Tris-HCl, pH 8,0, перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 30 мин при температуре 95 ⁰ С. Далее выделение ДНК проводят так же, как и с пробами крови.

5.5.3 Проведение ПЦР для специфической индикации и идентификации возбудителей особо опасных микозов

Для проведения реакции используют тест-системы для выявления ДНК возбудителей особо опасных микозов, разрешенные к применению в установленном порядке, позволяющие проводить учет результатов методами электрофореза в агарозном геле или методом ПЦР в режиме реального времени либо с флуоресцентной детекцией по «конечной точке». Работу проводят в соответствии с инструкциями к диагностическим тест-системам.

Для идентификации грибов рода Coccidioides можно использовать праймеры, предназначенные для выявления интерспейсерных областей рибосомальных генов, участков последовательностей генов 19 кДА специфичного антигена и пролинобогащенного антигена А2, гена макрофагзависимого белка MBP-1 и SOWgp82 гена, кодирующего иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул данных микромицетов.

Идентификацию H.capsulatum можно проводить на основе праймеров, фланкирующих фрагменты рибосомальных генов, ITS – регионов рибосомальной ДНК, гена mold-specific MS8 protein (MS8 ), экспрессия которого происходит в мицелиальной фазе развития гриба и гена calcium-binding protein (CBP1), экспрессия которого происходит в дрожжевой фазе и способствует выживанию клеток в макрофагах человека.

Для выявления B.dermatitidis также используют рибосомальные гены, ITS – регионы, ген WI-1 адгезина и ген вирулентности ВАД1. Обнаружение P. brasili­ensis можно проводить с помощью праймеров, фланкирующих фрагменты рибосомальных генов и гена gр 43.

5.6 Идентификация культур на основе фенотипических признаков

5.6.1 Получение микрокультур

По общим правилам готовится любая, подходящая для тест-организма плотная питательная среда и наливается тонким слоем в чашку Петри. После застывания среда разрезается скальпелем, проведенным через пламя спиртовки, на кусочки (блоки) произвольных размеров (в среднем 1х1 см² ). Данный блок помещается на стерильное предметное стекло и на него наносится пипеткой маленькая капля заранее приготовленной взвеси исследуемого микромицета. При этом следует учесть, что взвесь должна содержать от 5 до 7 клеток в поле зрения (не более). Блок накрывается стерильным покровным стеклом. Микрокультуру помещают в стерильную чашку Петри, края чашки герметично закрывают и помещают в термостат. Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру. Рекомендуется готовить 2-4 микрокультуры одного гриба, поскольку не во всех препаратах выявляется хороший рост и отчетливые морфологические признаки. Перед просмотром микрокультуры производят ее обеззараживание парами формалина в течение не менее одних суток.

После просмотра микрокультур весь материал необходимо подвергнуть автоклавированию.

6 Выдача заключений по результатам лабораторного исследования на особо опасные микозы

После проведения соответствующих этапов лабораторного исследования на особо опасные микозы в определенные сроки можно давать следующие заключения о его результатах. В расчетные сроки не включено время, необходимое для подготовки проб (разбор проб и предварительная очистка, фильтрование, разведение или концентрирование материала, разделение на аликвоты).

Предварительные результаты специфической индикации

При исследовании материала из объектов внешней среды, а также сельскохозяйственной продукции:

- через 2-4 ч, по результатам МФА;

- через 2-6 ч, по результатам РНГА, ИФА;

- через 6-8 ч, по результатам ПЦР.

При исследовании биологического материала от людей и животных:

- через 1-6 ч, по результатам МФА;

- через 2-6 ч, по результатам ИФА;

- через 6-8 ч, по результатам ПЦР;

- через 1-3 суток, по морфологии микрокультур.

Окончательные результаты специфической индикации

При исследовании любого материала, подозрительного на зараженность возбудителями особо опасных микозов, через 2-10 сут на основании:

- результатов МФА и ПЦР с исследуемым материалом из среды накопления.

Окончательные результаты полного лабораторного анализа

При исследовании любого материала, подозрительного на зараженность возбудителями особо опасных микозов, через 15-35 сут на основании:

- получения «чистых» культур особо опасных микромицетов в двух фазах (дрожжевой и мицелиальной);

- морфологии клеток в мазках из выросших колоний;

- патологоанатомической картины у забитых на 14-30 сутки или павших белых мышей, обнаружения паразитической формы возбудителей особо опасных микозов в тканях биопробных животных и морфологии колоний при посеве органов на питательном агаре;

- результатов ПЦР.

Диагноз у человека считают установленным при наличии соответствующей клинической картины, эпидемиологического анамнеза и положительных результатов одного из нижеперечисленных способов:

- выделение из патологического материала культуры микромицетов II группы патогенности и гибель хотя бы одного зараженного лабораторного животного и выделение из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителей особо опасных микозов;

- выделение культуры возбудителей особо опасных микозов из предполагаемого источника.

Хранение штаммов возбудителей особо опасных микозов

Штаммы микромицетов II группы патогенности поддерживаются в сапрофитической фазе путем периодических пересевов на плотных питательных средах. В качестве основной среды используют плотную среду Сабуро с левомицетином (50 г/л), а частота пересевов составляет 1 раз в 4 месяца.

7 Режим работы в лабораториях, работающих с микромицетами II группы патогенности (опасности)

Все работы с возбудителями особо опасных микозов должны проводиться в строгом соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

1. В случае аварии во время работы в лаборатории с заразным материалом, как то: бой посуды с посевами, разбрызгивание из шприца или пипетки жидкостей, содержащих возбудителей глубоких микозов, а также во всех других случаях, ведущих к загрязнению заразным материалом окружающих предметов, одежды и открытых частей тела самих работников, немедленно принимаются следующие меры:

а) если не было разбрызгивания заразного материала в воздухе сотрудник, не выходя из комнаты тотчас же вызывает заведующего лабораторией или руководителя учреждения, включает бактерицидную лампу и одновременно приступает к обеззараживанию дезинфицирующими растворами (5% раствор фенола, лизола, формальдегида) всех открытых частей тела, если на них попал заразный материал или имеется подозрение на его попадание;

б) в соседней комнате с пострадавшего снимается зараженная одежда, в последнюю очередь маска, а находившиеся под одеждой подозрительные на соприкосновение с заразным материалом части тела пострадавшего подвергаются обработке дезинфицирующими растворами;

в) сотрудник, оказывающий помощь пострадавшему, должен быть одет в противочумный костюм 1 типа;

г) в глаза и нос пострадавшему вводят несколько капель 1 % раствора азотно-кислого серебра, рот и горло прополоскивают несколько раз раствором перманганата калия 1:2000;

д) после предварительного обеззараживания пострадавший должен принять душ и надеть чистую одежду;

е) снятая с пострадавшего одежда подвергается дезинфекции;

ж) сотрудник, помогавший потерпевшему аварию, проводит дезинфекцию помещения, где произошла авария, объем и вид которой определяется руководителем учреждения в зависимости от характера аварии;

з) сотрудник, проводивший дезинфекцию после снятия одежды и ее дезинфекции, также принимает душ и надевает чистую одежду;

и) если имело место разбрызгивание зараженного материала (бой посуды с культурой, разрыв шприца и т.п.), сотрудники, находившиеся в комнате, немедленно выходят из нее в соседнее помещение, плотно закрывают за собой дверь, чтобы не иметь дальнейшего контакта с заразным материалом, распыленным в воздухе. После этого осуществляют все вышеуказанные меры дезинфекции и санобработки.

2. В случае подозрения на инфицирование пострадавший должен находиться под наблюдением терапевта или инфекциониста в течение 3 недель с обращением внимания на явления со стороны дыхательных путей, эритематозные высыпания и другие симптомы.

3. Вопрос о применении профилактического лечения решается в каждом конкретном случае.

Профилактическое лечение может быть назначено лишь при подозрении на массивное заражение спорами грибов при аварии с разбрызгиванием заразного материала в большом объеме.

4. В случае подозрения, что сотрудник учреждения заболел кокцидиоидомикозом, гистоплазмозом, бластомикозом или паракокцидиоидомикозом, руководитель учреждения обязан немедленно сообщить об этом руководству Роспотребнадзора.

8 Профилактика особо опасных микозов

Специфическая профилактика особо опасных микозов до сих пор не разработана.

Экстренная профилактика особо опасных микозов путем введения медикаментозных средств не применяется. Гуморальные антитела при микозах хотя и формируются, но защитной роли не играют.

Наиболее эффективными в эндемичных очагах глубоких микозов являются меры личной и общественной профилактики. Они связаны с возможностью предотвращения аэрогенного попадания грибов в организм. Для этого используются обычные респираторы.

Общественные меры профилактики (особенно при кокцидиоидомикозе) связаны с увлажнением почвы, асфальтированием площадок, примыкающих к жилищу и т.д. В эндемичных очагах гистоплазмоза рекомендуется ликвидация мест скопления птиц (особенно, скворцов).

Учитывая высокую опасность внутрилабораторных заражений возбудителями особо опасных микозов, при работе с ними предусмотрены меры безопасности, регламентированные санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Приложение 1

Питательные среды, применяемые для выделения и идентификации возбудителей особо опасных микозов

Агар Сабуро

- Пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76 – 1,0 г

- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 4,0 г

- Агар пищевой, ГОСТ 16280-88 – 1,5%

- Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72 – до 100 мл

- Левомицетин (хлорамфеникол) – 0,005%

Агар Чапека

- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 20,0 г

- Калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный, чда,

ГОСТ 2493-75 – 1,0 г

- Натрий азотнокислый, хч, ГОСТ 4168-70 – 3,0 г

- Калий хлористый, хч, ГОСТ 4234-77 – 0,5 г

- Магний сернокислый, 7-водный, хч, ГОСТ 4523-77 – 0,5 г

- Железо (II) сернокислое, 7-водное, хч, ГОСТ 4148-78 – 0,015 г

- Агар пищевой, ГОСТ 16280-88 – 1,5%

- Водопроводная вода – 1 л

Среда Фрэнсиса

- Мясной бульон – 1000 мл

- Дефибринированная кровь (кроличья или лошадиная) – 8%

- Пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76 – 1%

- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 1%

- Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 – 0,5%

- L-Цистеин, ч, ТУ 6-09-3251-73 – 0,1%

- Агар пищевой, ГОСТ 16280-88 – 1,5%

Среда применяется для выращивания дрожжевой фазы возбудителя гистоплазмоза из мицелиальной, реже для хранения музейных культур дрожжевой фазы возбудителя.

Сердечно-мозговой агар

- Вытяжка из говяжьего мозга – 20%

- Вытяжка из говяжьего сердца – 25%

- Пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76 – 1%

- Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 – 0,5%

- Натрий фосфорнокислый двузамещенный, чда, ГОСТ 11773-76 – 0,25%

- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 0,2%

- Агар пищевой, ГОСТ 16280-88 – 1,5%

Среда применяется для культивирования дрожжевой фазы возбудителя гистоплазмоза.

Сахарный мясо-пептонный агар

- Агар пищевой, ГОСТ 16280-88 – 1,5%

- Мясной бульон – 100 мл

- Пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76 – 1%

- Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 – 0,5%

- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 1%

Среда применяется для выращивания дрожжевой фазы возбудителей бластомикоза и паракокцидиоидомикоза.

Среда Курунга

- Крахмал (нерастворимый) – 1,0 г

- Желтки куриных яиц – 150 мл

- Белки куриных яиц – 50 мл

- Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72 – 100 мл

Среда применяется для хранения дрожжевой фазы возбудителя гистоплазмоза.

Среда Конверса

- Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72 – 1 л

- Калий фосфорнокислый однозамещенный, хч, ГОСТ 4198-75 – 0,3 г

- Калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный, чда,

ГОСТ 2493-75 – 0,4 г

- Магний сернокислый, 7-водный, хч, ГОСТ 4523-77 – 0,4 г

- Цинк сернокислый, 7-водный, чда, ГОСТ 4174-77 – 0,2 мл (1% р-р)

- Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 – 1,4 мл (1% р-р)

- Кальций хлорид, 2-водный, ч, ТУ 6-09-5077-83 – 0,003 г

- Натрий углекислый кислый, хч, ГОСТ 4201-79 – 1 мл (1% р-р)

- Аммоний уксуснокислый, хч, ГОСТ 3117-78 – 1,23 г

- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 10 г

Среда применяется для получения сферул возбудителя кокцидиоидомикоза.

Приложение 2

Приготовление рабочих растворов и реагентов

для проведения ПЦР

2.1 Лизирующий буфер с 6 М гуанидинтиоцианатом (ЛБ ) – на 50 мл: гуанидинтиоцианат Na – 35,4 г, растворяют в дистиллированной воде, добавляют 1 мл 0,5 раствора ЭДТА и доводят до 50 мл дистиллированной водой. К раствору гуанидинтиоцианата Na добавляют в сухом виде дитиотрейтол (ДТТ) до конечной концентрации 20мМ. На 50 мл раствора гуанидинтиоцианата Na необходимо взвесить 154 мг. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4-10 ^о С до 6 месяцев.

2.2 Раствор 4 М гуанидинтиоцианата натрия – навеску гуанидинтиоцианата Na, равную 23,6 г растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 50 мл. Рекомендуется добавить ДТТ до конечной концентрации 20мМ.

2.3 Раствор для первой отмывки 1 – к 1 мл раствора 1 М Трис-HCl, рН 8,5, добавить 1 мл 5 М раствора натрия хлорида, довести объем до 30 мл дистиллированной водой и добавить спирт этиловый 70 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4-10 ^о С – до 6 месяцев.

2.4 Суспензия сорбента (СС ) – готовят 50 % (вес/объем) суспензию силикагеля (SiO₂ ) с размером частиц 0,5-10 мкм в деионизованной воде.

2.5 TE буфер рН 7,4: на 100 мл – 1М раствор Трис-HCl, рН 8,0 – 1 мл, 0,5 М раствор ЭДТА – 0,2 мл, деионизованная вода – до 100 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4-10 ^о С – до 6 месяцев.

2.6 0,5 М раствор ЭДТА , рН 8,0. 18,61 г соли помещают в химический стакан на 100 мл, добавляют 80 мл дистиллированной воды, интенсивно размешивают на магнитной мешалке и доводят рН до 8,0±0,1 с помощью натрия гидроокиси. Раствор хранят в темной полипропиленовой посуде при температуре (4±2) ^о С до 3 мес.

2.7 1 М раствор трис- HCl , рН 8,0±0,1. Навеску трис-(оксиметил)-аминометана – 6,5 г помещают в химический стакан на 50 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 50 мл и выставляют рН 8,0±0,1 с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят при температуре (4±2) ^о С до 3 мес.

2.8 0,1 М раствор трис- HCl , рН 6,4±0,1. Навеску трис-(оксиметил)-аминометана – 1,21 г помещают в химический стакан на 100 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 100 мл. Доводят рН до 6,4±0,1 с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят при температуре (4±2) ^о С до 3 мес.

2.9 5 М раствор натрия хлорида . Навеску натрия хлорида – 2,922 г помещают в химический стакан и добавляют 8 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в стеклянной посуде при температуре (4±2) ^о С до 3 мес.

2.10 3 M раствор ацетата натрия. Навеску ацетата натрия 40,8 г помещают в химический стакан на 100 мл растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

2.11 Фенол, забуференный Tris- HCl , pH 8,0. Перед употреблением перегнанный фенол достать из холодильника, выдержать при комнатной температуре и расплавить при 68 °С. К расплавленному фенолу добавить равный объем H₂ O, тщательно перемешать и выдержать раствор до разделения фаз. После этого удалить верхнюю водную фазу. К фенолу добавить равный объем 1 М раствора трис-HCl, рН 8,0±0,1, тщательно перемешать и выдержать раствор до разделения фаз. Удалить верхнюю водную фазу. Затем фенол насыщают равным объемом 0,1 М раствора трис-HCl, рН 8,0±0,1, тщательно перемешивают и выдерживают раствор до разделения фаз до тех пор, пока рН водной фазы не станет > 7,6. Раствор фенола можно хранить при 4 ^о С до появления розового окрашивания.

Предостережение. При работе с фенолом следует надевать перчатки и очки, так как он является едкой жидкостью и вызывает тяжелые ожоги.

Приложение 3 (справочное)

Лечение особо опасных микозов

Кокцидиоидомикоз

Чувствительность большинства штаммов Coccidioides spp . к антимикотикам: амфотерицин В (МПК 0,03-0,5 мг/л), кетоконазол (0,5-1 мг/л), итраконазол (0,5-1 мг/л), флуконазол (8-32 мг/л, чувствительность зависит от дозы), вориконазол (МПК около 0,125 мг/л).

В лечении кокцидиоидомикоза используются разные системные антимикотики, включая амфотерицин В и три пероральных азольных антимикотика: итраконазол, флуконазол и кетоконазол (табл.2). Отдельные формы инфекции могут потребовать хирургического вмешательства.

Первичная инфекция в форме абортивной острой пневмонии без риска диссеминации обычно не требует лечения. Показаниями к терапии являются сохраняющиеся дольше 6 недель симптомы заболевания, а также изменения корней легких на рентгенограмме или повышение титров РСК выше 1:16. При прогрессирующей острой пневмонии или предполагаемом риске диссеминации назначают амфотерицин по 0,4-0,6 мг/кг в сут до стабилизации состояния больного, а затем по 0,8-1,0 мг/кг в сут через 2 сут. Лечение ведут до общей курсовой дозы в 0,5-1,5 г. В настоящее время также используют флуконазол или итраконазол в дозах 400 мг/сут и более.

При наличии остаточных явлений в легких используют флуконазол по 400 мг/сут в течение 6-12 мес. В то же время больные с единичными небольшими полостями требуют не лечения, а наблюдения до разрешения этих очагов. Увеличивающиеся полости каверны, близкие к плевре, осложнения в виде бактериальной инфекции или кровотечения требуют хирургического вмешательства.

Таблица 2

Схема терапии различных форм кокцидиоидомикоза

Хроническая прогрессирующая пневмония в настоящее время является показанием к назначению флуконазола в дозах 200-400 мг/сут. Ранее использовали амфотерицин в дозах 0,4-0,6 мг/кг в сут. При отмене того и другого препарата возможны рецидивы.

При угрожающей пневмонии с выраженной дыхательной недостаточностью, а также при внелегочной диссеминации гриба назначают амфотерицин в дозах 0,6-1,5 мг/кг в сут до курсовой дозы в 2 г. После стабилизации состояния больного в настоящее время предпочитают переход на использование азольных антимикотиков в режиме поддерживающей терапии. Назначают флуконазол, по 400 мг/сут или итраконазол по 200 мг/сут, или увеличенные дозы этих препаратов. Поддерживающая терапия обычно ведется в течение, по крайней мере, 1 года, а иногда и пожизненно.

При изначально стабильном состоянии больных или медленном развитии симптомов начинают сразу с пероральных антимикотиков в тех же дозах.

При кокцидиоидомикозном остеомиелите нередко требуется хирургическое вмешательство для удаления пораженных тканей или дренажа очагов в мягких тканях.

При кокцидиоидомикозном менингите назначают флуконазол или итраконазол по 400 мг/сут или в более высоких дозах. Возможно изначальное лечение амфотерицином В с переходом на флуконазол.

Хирургический метод лечения применяют при ограниченных формах кокцидиоидомикоза легких; положительные результаты хирургического вмешательства отмечены при поражении опорно-двигательного аппарата.

С кокцидиоидомикозом могут сочетаться заболевания, связанные с дефектами иммунитета. Терапия таких заболеваний зависит от интенсивности клинических проявлений. При дефектах клеточного иммунитета полезными оказываются препараты, способствующие их устранению, в сочетании со специфическим лечением.

Гистоплазмоз

Чувствительность большинства штаммов Histoplasma capsulatum к антимикотикам: амфотерицин В (МПК в пределах 0,03-0,5 мг/л), кетоконазол (0,125-0,5 мг/л), итраконазол (0,015-0,5 мг/л), флуконазол (8-32 мг/л, дозозависимая чувствительность), вориконазол (МПК около 0,25 мг/л).

В лечении гистоплазмоза используют современные системные антимикотики (табл.3). Препаратом выбора считается итраконазол, средством замены — флуконазол, а в лечении тяжелых форм заболевания применяют амфотерицин В.

Таблица 3

Схемы терапии различных форм гистоплазмоза

При острой форме легочного гистоплазмоза после самопроизвольного разрешения симптомов лечения не требуется. Системную терапию итраконазолом (200-400 мг/сут в течение 6-12 нед.) назначают, если симптомы заболевания сохраняются более 2-4 нед. Ранее назначали кетоконазол по 400 мг/сут в течение 12 нед.

При тяжелом течении острого гистоплазмоза легких назначают амфотерицин В по 0,5-0,7 мг/кг в сут в течение 2-4 недель. При диффузном или милиарном гистоплазмозе легких с выраженной гипоксией, но без иммунодефицитного состояния назначают кортикостероидные гормоны, преднизолон по 60 мг/сут в течение 2 нед.

Больным, у которых первичный острый гистоплазмоз легких сопровождается реактивным артритом или перикардитом, показаны противовоспалительные средства без системной противогрибковой терапии. При тампонаде перикарда и выраженных расстройствах гемодинамики назначают кортикостероидные гормоны в течение 2 недель, а затем интраконазол.

При гранулематозном медиастините противогрибковую терапию назначают, если симптомы заболевания сохраняются более 1 месяца. Итраконазол (400 мг/сут) назначают в течение 3 месяцев, а при неудачном лечении в части случаев предпринимают хирургическое вмешательство.

Лечение фиброзирующего медиастинита, как правило, оказывается неудачным при использовании как противогрибковых средств, так и кортикостероидных гормонов или оперативного лечения.

Больным с хронической кавернозной легочной формой гистоплазмоза назначают итраконазол по 400 мг/сут в течение 6 месяцев. Альтернативный подход — использование кетоконазола по 400 мг/сут в течение 6-12 месяцев. Менее эффективно использование флуконазола по 400 мг/сут. Для предотвращения рецидивов у части больных лечение продлевают до 2 лет. Больным, которыми это лечение не переносится или у которых оно оказывается неэффективным, назначают амфотерицин В по 0,5-0,7 мг/кг в сут в течение 10 недель. После окончания курса показано наблюдение в течение года.

При диссеминированном гистоплазмозе без иммунодефицита назначают итраконазол по 400 мг/сут в течение 6 месяцев. В настоящее время в лечении диссеминированного гистоплазмоза используются и липидные формы амфотерицина, в том числе - «Амбизом», по 3 мг/кг в сут, на курс 100-120 мг/кг. «Амбизом» рекомендуется и при гистоплазмозе с диссеминацией в центральную нервную систему.

Бластомикоз

Чувствительность большинства штаммов Blastomyces dermatitidis к антимикотикам: амфотерицин В (МПК 0,125-0,5 мг/л), кетоконозал (0,125-0,5 мг/л), итраконазол (0,015-0,06 мг/л), флуконазол (4,0-32 мг/л), вориконазол (МПК около 0,5 мг/л).

В лечении используются различные системные антимикотики, как амфотерицин В, так и азольные производные (табл. 4).

Таблица 4

Схема терапии различных форм бластомикоза

Препаратом выбора считается итраконазол. При легочной форме бластомикоза его назначают по 200 мг/сут в течение 6 месяцев или до выздоровления с последующим назначением в течение 3 месяцев. Если улучшения не происходит, дозу увеличивают до 400 мг/сут.

Препаратом замены служит кетоконазол, назначаемый по 400 мг/сут (при необходимости дозу приходится увеличивать до 600-800 мг/сут). Возможно использование флуконазола, особенно при непереносимости или плохой абсорбции других азолов. Флуконазол назначают по 400-800 мг/сут.

Больным с тяжело протекающей легочной формой бластомикоза, диссеминированной формой с поражением внутренних органов, бластомикозом центральной нервной системы назначают амфотерицин В по 0,3-0,6 мг/кг в сут, нередко переходя в режим дозирования по 0,6-0,8 мг/кг через день после улучшения состояния больного. Общая курсовая доза составляет 1,5-2,5 г (30 мг/кг). Возможно чередование амфотерицина с итраконазолом после улучшения состояния больного на фоне лечения амфотерицином.

Больным с самостоятельно прошедшей острой легочной формой противогрибковая терапия, как правило, не назначается. Они подлежат активному наблюдению.

Паракокцидиоидомикоз

Чувствительность большинства штаммов Paracoccidioides brasiliensis к антимикотикам: амфотерицин В (МПК 0,125-0,5 мг/л), кетоконозал (0,125-0,5 мг/л), итраконазол (0,015-0,06 мг/л), флуконазол (4,0-32 мг/л).

В лечении паракокцидиоидомикоза в настоящее время используют азольные антимикотики и амфотерицин Б. Препаратом выбора при большинстве клинических форм заболевания является итраконазол. Как правило, необходимо длительное лечение с наблюдением больных по его окончании.

Итраконазол назначают по 100 мг/сут в течение 6 месяцев. При развитии рецидива заболевания лечение продолжают. Поздние рецидивы нехарактерны.

В качестве альтернативы итраконазолу можно использовать кетоконазол, по 200-400 мг/сут или флуконазол в тех же дозах. Флуконазол назначают 6-месячным, а кетоконазол — 6-12-месячным курсом, или до разрешения всех клинических проявлений, затем в течение еще 6 месяцев.

Амфотерицин В назначают при тяжелых формах инфекции по 0,7-1 мг/кг в сут в течение 4-8 нед.

Приложение 4

Схема лабораторной диагностики глубоких микозов