МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Белорусский государственный медицинский университет

Кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии

Микробиологические основы

противомикробных мероприятий

Учебно-методическое пособие

Минск 2006

УДК

ББК

М

Авторы: канд. мед. наук, доц. В. А. Горбунов, канд. мед. наук Е. И. Гудкова

Рецензенты: зав. кафедрой эпидемиологии БГМУ, д-р мед. наук, проф. Г. Н. Чистенко; зав. лабораторией ВБИ ЦНИЛ БГМУ, канд. мед. наук, доц. Г. А. Скороход

Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве учебно-методического пособия 29.03.06, протокол №5.

Горбунов В. А., Гудкова Е. И.

Микробиологические основы противомикробных мероприятий: Учеб. – метод. пособие. - Минск: БГМУ, 2006. - с.

ISBN

В учебно-методическом пособии отражены вопросы стерилизации, дезинфекции, антисептики, представлены методические рекомендации по проведению лабораторных занятий по теме: «Противомикробные мероприятия»

Пособие предназначено для студентов 3 курса медико-профилактического факультета.

УДК

ББК

Видному белорусскому микробиологу и иммунологу, многолетнему руководителю кафедры микробиологии Минского государственного медицинского института, заслуженному работнику Высшей школы, ветерану ВОВ, доктору медицинских наук, профессору Красильникову Алексею Петровичу посвящается.

Список сокращений

Введение

Противомикробные мероприятия являются одним из важных аспектов деятельности практического врача. Студенты-медики нуждаются в изучении микробиологических основ противомикробных мероприятий для успешной профилактики и лечения заболеваний. Инфекционная заболеваемость в мире до сих пор остается широко распространенной, в ее структуре постоянно происходят существенные изменения. В последние десятилетия наблюдается нарастание удельного веса устойчивых к противомикробным препаратам форм микроорганизмов. Внедряются в медицинскую практику новые методы стерилизации, новые антисептические и дезинфицирующие препараты.

В связи с этим весьма важно, чтобы в обучении студентов медицинской микробиологии были даны достаточно полные знания, как о современных методах стерилизации, дезинфекции и антисептики, так и о биологии микроорганизмов, уровнях и механизмах их устойчивости к противомикробным средствам.

Материал пособия дополняет и уточняет отдельные разделы учебников с учетом учебной программы, включает практические рекомендации по выполнению лабораторных работ по микробиологии студентами медико-профилактического факультета. Пособие базируется на результатах исследований и разработках известного белорусского микробиолога и иммунолога, многолетнего руководителя кафедры микробиологии Минского государственного медицинского института, профессора Красильникова А. П.

А. П. Красильниковым дан критический анализ проблемы терминологии в области антимикробных мероприятий и предложены научно обоснованные определения антисептики, химиотерапии, стерилизации и дезинфекции. Определены цель и область их применения, средства и объекты воздействия, даны сравнительная характеристика антисептиков, химиопрепаратов и критерии их дифференциации, исчерпывающая классификация антисептических средств. Разработаны методы определения и комплекс показателей чувствительности-устойчивости бактерий к антисептикам. Обоснована необходимость постоянного микробиологического мониторинга циркуляции устойчивых к антисептикам вариантов микроорганизмов. Исследовано распространение в больничных условиях устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий. Разработаны оригинальные показатели и методика определения устойчивости бактерий к дезинфектантам. Разработана методика определения микробной контаминации антисептических и дезинфицирующих растворов.

Результаты исследований в области антисептики и дезинфекции, проведенных под руководством А. П. Красильникова, послужили основой для обоснования и выбора методов контроля за циркуляцией устойчивых к антисептикам и дезинфектантам форм бактерий в больничных стационарах, позволили обозначить пути создания Республиканской системы контроля за применением дезинфектантов и антисептиков.

Данное пособие может быть использовано студентами всех факультетов.

В. А. Горбунов, Е. И. Гудкова

1. Противомикробные мероприятия

Под противомикробными мероприятиями понимают совокупность методов уничтожения, подавления жизнедеятельности и ограничения миграции во внешней среде потенциально патогенных для человека микроорганизмов с целью профилактики, лечения инфекционных болезней и предупреждения распространения их возбудителей.

Совокупность строго регламентированных и обязательных для выполнения противомикробных мероприятий в конкретных лечебных или иных организациях или производствах называется противомикробным режимом.

Различают противомикробные мероприятия прямого, косвенного и сочетанного воздействия на микроорганизмы.

К косвенным относятся меры , тормозящие миграцию возбудителей в пределах конкретной экосистемы (эпидочаг, больничный стационар и др.) и за её пределами (разобщение инфицированных и неинфицированных людей, разделение материалов, помещений, транспортных, людских и воздушных потоков и др.), а также меры, снижающие численность популяции возбудителей на поверхности и внутри организма опосредованно через активацию иммунной системы (иммунопрофилактика, иммунотерапия).

Противомикробные мероприятия прямого действия подразделяют на антисептику, дезинфекцию, стерилизацию и химиотерапию (химиопрофилактику).

Высокий противоэпидемический эффект даёт сочетание прямых и косвенных методов воздействия на возбудителей (асептика, гнотобиотика).

Методы подавления роста или уничтожения патогенных бактерий:

1. Физические методы:

А. Термическая обработка:

· пастеризация;

· стерилизация сухим жаром (воздушная стерилизация);

· стерилизация текучим паром (паровая стерилизация, автоклавирование);

· тиндализация (дробная стерилизация);

· прокаливание,

· кипячение.

Б. Облучение:

· ультрафиолетовые лучи;

· гамма и рентгеновские лучи;

· микроволновое излучение;

· ультразвук.

В. Стерилизация фильтрованием.

2. Химические методы:

А. Химическая стерилизация.

Б. Применение химических дезинфектантов и антисептиков .

В. Применение химиотерапевтических средств (избирательное противомикробное действие).

1.1. Стерилизация

Под стерилизацией понимают совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся форм патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Целями стерилизации являются:

1) предупреждение заноса микроорганизмов в организм человека при медицинских вмешательствах;

2) создание и поддержание безмикробной (гнотобиотической) среды;

3) исключение микробной контаминации питательных сред и культур клеток при микробиологических и иммунологических исследованиях;

4) предупреждение микробной биодеградации материалов, в том числе лекарственных и диагностических.

В медицинской практике стерилизации подвергают: лекарственные и диагностические препараты, вводимые в организм человека; перевязочный и шовный материал, шприцы и инъекционные иглы, инструментарий, бельё, предметы ухода за больными; питательные среды, лабораторную посуду; при создании безмикробной зоны - воздух помещения, оборудование и все остальные объекты зоны (боксы, кюветы и др.).

Процесс стерилизации состоит из следующих технологических этапов:

1) дезинфекция (в случае микробной контаминации материала);

2) предстерилизационная очистка;

3) контроль качества предстерилизационной очистки;

4) сборка, группировка и размещение материалов в контейнере и стерилизаторе;

5) собственно стерилизация;

6) сушка (при влажных методах стерилизации);

7) контроль качества стерилизации;

8) хранение стерилизованных материалов.

Рис. 1. Паровые стерилизаторы (автоклавы): ВК-75 (слева) и ГК-100 3М (в центре). Металлический контейнер (бикс) для стерилизации предметов в автоклаве (справа), фото автора .

Дезинфекция, очистка, группировка и размещение преследуют цель снижения численности микробов на объекте и облегчения доступа к ним стерилизующего агента, этап стерилизации - полного освобождения объекта от всех микроорганизмов, этап хранения - предупреждения повторной контаминации в период от окончания стерилизации объекта до его применения.

Рис. 2. Суховоздушный стерилизатор (слева - вид снаружи, справа – внутри).

Стерилизующие агенты, аппараты для стерилизации разнообразны (рис1, 2). Чаще используют стерилизацию горячим насыщенным паром под давлением (автоклавирование) и сухим горячим воздухом.

1.1.1. Физические методы стерилизации.

Паровой метод стерилизации . В автоклаве возможна стерилизация почти всех малогабаритных материалов. Для него характерны надёжность, доступность, экономичность, высокая степень автоматизации. В зависимости от стерилизуемых материалов температура пара в автоклаве устанавливается от 110 до 138^о С, давление - от 0,4 до 2,5 атм., экспозиция - от 3 до 60 мин. Изделия из коррозионностойких материалов, стекла, изделия из текстильных материалов, резин, лигатурный шовный материал в ЛПО стерилизуется в автоклаве при давлении пара 2,0±0,2 кгс/см² (атм) - 132±2^о С – 20 мин. или 1,1±0,2 кгс/см² - 120±2^о С – 45 мин. Для получения надёжного стерилизующего эффекта необходимо свободное размещение материалов в биксах, бумажных и матерчатых пакетах, а также в автоклаве, полное удаление воздуха, строгое выдерживание регламента стерилизации, высушивание материала после стерилизации в таких условиях, которые исключают их повторную микробную контаминацию. Срок сохранения стерильности изделий в герметичной упаковке – 20 суток, негерметичной – 3 суток.

Дробная стерилизация. Термолабильные материалы, главным образом жидкие, стерилизуют 3-4-кратным (дробным) прогреванием текучим паром при 100^о С по 1 часу с перерывами в сутки (дробная стерилизация), в течение которых материал содержится в термостате при 37^о С (для прорастания спор).

Воздушный метод стерилизации. Стерилизация сухим воздухом в сухожаровых шкафах (аэростерилах) или других аппаратах этого типа также высокоэффективна, но более высокая температура (160-200^о С) и более длительные сроки экспозиции (1-2 часа), а также сухой горячий воздух могут оказывать повреждающее действие на ряд стерилизуемых материалов и, следовательно, ограничивают возможности этого способа. Сухим жаром стерилизуют предметы из стекла, различные наборы термостабильных инструментов, а также такие гидрофобные материалы как тальк, вазелин, масла. В ЛПО используются следующие режимы стерилизации воздушным методом: 180^о С - 60±5 мин., или 160^о С - 150±5 мин. Срок сохранения стерильности изделий в герметичной упаковке – 20 суток, негерметичной – 3 суток. Изделия без упаковки помещают на «стерильный стол» и используют в течение одной рабочей смены.

Гласперленовая стерилизация. (Glas - стекло, Perle - бисеринка, нем.). Для эндодонтических инструментов, некрупных изделий применима технология стерилизации, при которой инструмент погружают в среду, состоящую из гладких мелких стеклянных шариков, по размерам сопоставимых с бисером или крупным песком. Суть технологии - в резком повышении теплопроводности среды. У стекла этот показатель в сорок раз выше, чем у воздуха. Соответственно возрастает и скорость передачи тепла от шариков к инструменту сравнительно с нагревом в автоклаве или сухожаровом шкафу. Как теплоноситель в стерилизационной камере стеклянные шарики имеют ряд несомненных достоинств. Они гладки, не имеют пор, хорошо промываются. Прозрачность стекла допускает визуальное наблюдение за термообработкой. Процедура длится 15-20 секунд. Кратковременная термообработка меньше сказывается на режущих свойствах инструмента, продлевает его работоспособность.

Прокаливание. Бактериальные петли, иглы (в экстренном порядке) можно стерилизовать прокаливанием на пламени горелки в течение 0,5-1 мин. Кипячение в воде, даже с бикарбонатом натрия, не обеспечивает полного уничтожения микроорганизмов и поэтому не относится к способам стерилизации.

Лучевая стерилизация. Высоким антимикробным действием обладают гамма-лучи. Однако, микробоцидные дозы их очень высоки (0,2-4,5 Мрад), что приводит к быстрому разрушению объекта и требует создания сложных и дорогих систем защиты от радиации. Тем не менее, в заводских условиях они с успехом используются для стерилизации медицинских материалов, особенно одноразовых.

Механическая стерилизация. В настоящее время используются механические способы стерилизации в виде фильтрования жидкостей через мелкопористые (мембранные) фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, которые эффективно задерживают бактерии, но не их споры и вирусы; фильтрование воздуха через бактерицидные фильтры, «промывание» какого-либо помещения, пространства (например, бокса) ламинарным потоком стерильного воздуха.

1.1.2. Химический метод стерилизации.

Для стерилизации крупногабаритных объектов, предметов из термолабильных и разнородных материалов применяют химическую (холодную, низкотемпературную) стерилизацию. В этом случае предметы помещают в герметические контейнеры, которые заполняют газообразным стерилизующим веществом. Обычно для этой цели используют пары формальдегида (1 мг/л, влажность воздуха - 80-90%, температура выше 20^о С, экспозиция 24 часа) или этиленоксида (500-1200 мг/л, влажность - 60-90%, температура выше 20^о С - оптимальная 50-60^о С, экспозиция 6-24 часа). В связи с взрывоопасностью этиленоксид применяют в смеси с углекислотой. В аппаратах со сниженным или повышенным давлением бактерицидный эффект этих газов усиливается. Кроме газового, используется погружной способ химической стерилизации: объект погружается, например, в раствор формалин-этилалкоголя или формалин-изопропана на 24 часа. Для химической стерилизации могут использоваться: 6% раствор Н₂ О₂ , 2% раствор глютарового альдегида, комбинированные стериллянты на основе глютаральдегида. Основные методы низкотемпературной стерилизации представлены в табл. 1.

Таблица 1

Сравнительная характеристика некоторых методов

низкотемпературной стерилизации

Главным недостатком химических методов является необходимость освобождения объектов после стерилизации от остатков стерилизующего агента, во время которого возможна повторная их контаминация. Препятствует распространению этого способа также длительность стерилизации, высокая стоимость, возможность побочного действия химического вещества на обслуживающий персонал и больного. Тем не менее, по отношению к ряду сложных диагностических и лечебных аппаратов это единственно надёжный способ стерилизации в современных условиях.

Практика многих стран показала, что при децентрализованной стерилизации допускается много погрешностей на разных этапах технологического процесса стерилизации, что привело к возникновению и реализации в медицинской практике идеи централизованных стерилизационных отделений (ЦСО), в которых стерилизуются медицинские предметы для всех подразделений лечебно-профилактического учреждения.

1.1.3. Контроль стерильности изделий медицинского назначения.

Контроль качества стерилизации проводят физическим (с помощью контрольно-измерительных приборов), химическим (с использованием химических индикаторов) и бактериологическим (с использованием споровых форм тест-культур или посевов смывов с простерилизованных предметов) методами.

Контроль стерильности в лечебно-профилактических организациях (ЛПО) периодически осуществляют бактериологические лаборатории ЛПО и Центров гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья (ЦГЭиОЗ). Он проводится в условиях, исключающих возможность вторичной микробной контаминации: в боксах или иных специальных помещениях с соблюдением правил асептики.

Объектами контроля на стерильность являются: хирургические инструменты, шприцы, иглы, системы переливания крови, зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки, хирургический шовный материал, аппаратура, перевязочные материалы, бельё и др.

Для бактериологического контроля стерильности изделий используют: сахарный бульон Хоттингера (0,5-1% глюкозы), тиогликолевую среду, бульон Сабуро. Бактериологический контроль стерильности проводят путём погружения мелких изделий в питательные среды. С объектов больших размеров делают смыв стерильной салфеткой 5×5 см, предварительно увлажнённой стерильным физиологическим раствором или водопроводной водой. Засеянные бульон Хоттингера и тиогликолевую среду выдерживают при температуре 32^о С, среду Сабуро - при температуре 22^о С 8 суток. При отсутствии роста на всех средах выдают заключение о стерильности изделия. В случае прорастания посевов (помутнение, образование плёнки, осадка) готовят мазки для бактериоскопического подтверждения роста бактерий. При обнаружении бактерий изделие считается нестерильным.

1.2. Дезинфекция

Дезинфекция – это совокупность способов полного, частичного или селективного уничтожения потенциально патогенных для человека микроорганизмов на абиотических объектах внешней среды с целью разрыва путей передачи возбудителей инфекционных заболеваний от источников инфекции к восприимчивым организмам.

Очаговая дезинфекция – это дезинфекция, которая проводится в эпидемическом очаге в связи с возникновением случая инфекционного заболевания или бактерионосительства. Очаговая дезинфекция делится на текущую и заключительную.

Дезинфекция в очагах инфекционных заболеваний (квартира, дом, служебное и рабочее помещение, больничное отделение и др.), вызванных облигатно-патогенными микробами, ставит цель селективного уничтожения возбудителей конкретной болезни: например, в очаге туберкулёза - возбудителя туберкулёза, в очаге гепатита - вирусов гепатита и т.д. Дезинфекции в этом случае подвергается та группа объектов, которая служит фактором передачи возбудителя этой болезни.

Текущая дезинфекция - это дезинфекция, которая проводится в очаге в присутствии источника инфекции и направлена на уничтожение возбудителей по мере их выделения больным или носителем.

Текущей дезинфекции подвергают постельное и нательное бельё, полотенца, матрацы, подушки, мягкую мебель, ковры, посуду, выделения больных, предметы ухода за больными, инструменты, приборы, поверхности различных объектов, воздух, сточные воды. Дезинфекция сточных вод и выделений проводится термическим и химическим методами, дезинфекция белья – химическим методом, сочетающим стирку и дезинфекцию. Постельные принадлежности (матрац, одеяло, подушки, иногда вместе с кроватью) дезинфицируют термохимическим способом в камерах, но можно протиранием и аэрозолем. Ковры, мягкую мебель обрабатывают дезинфицирующими аэрозолями; поверхности пола, стен, потолка, окон, твёрдой мебели и других крупногабаритных предметов дезинфицируют протиранием, мытьём, опрыскиванием; посуду и малогабаритные предметы - погружением в дезинфицирующие растворы. Инструменты и медицинские приборы деконтаминируют стерилизацией, но перед стерилизацией они должны быть обязательно подвергнуты очистке и дезинфекции протиранием или погружением. Несоблюдение этого правила является одной из частых причин развития внутрибольничных инфекций (ВБИ). Воздух дезинфицируют фильтрованием через бактериальные фильтры, ультрафиолетовым облучением и созданием в помещении влажного дезинфицирующего аэрозоля или, ещё лучше, тумана (спрея).

Заключительная дезинфекция - это дезинфекция, которая проводится после госпитализации, выздоровления или смерти больного, то есть после удаления источника инфекции с целью полного освобождения очага от возбудителей, рассеянных больным. Кроме того, рекомендуется проводить регулярную плановую заключительную дезинфекцию поочерёдно одного за другим больничных отделений через определённые промежутки времени. Проведение дезинфекции должно учитывать не только её качество и эффективность, но также переносимость дезинфектантов людьми и материалами, а также стоимость дезинфекционных мероприятий.

Профилактическая дезинфекция - это дезинфекция, которая проводится вне связи с эпидемическими очагами в местах вероятного скопления возбудителей инфекционных болезней (ЛПО, детские дошкольные учреждения, предприятия пищевой промышленности и общественного питания, вокзалы, вагоны, зрелищные учреждения и т.д.). Дезинфекция в этих учреждениях имеет цель резкого снижения численности популяций всех потенциально патогенных для человека микробов на всех объектах помещения.

1.2.1. Дезинфицирующие средства .

Дезинфицирующий эффект может быть достигнут с помощью таких физических факторов как сжигание объекта (использованный перевязочный материал, малоценные игрушки и отходы, мусор и др.), прокаливание в пламени, воздействие горячего воздуха в сухожаровых камерах (температура 120^о С, экспозиция 2,5 часа), проточного или концентрированного пара под давлением в паровых дезкамерах, ультразвука. Кипячение в воде, особенно с поверхностно-активными веществами, также оказывает дезинфицирующий эффект. Широко распространён способ дезинфекции воздуха ультрафиолетовыми лучами, но он эффективен только в обеспыленных помещениях и при длительной экспозиции. Эффективна, но мало доступна, дезинфекция бета- и гамма-лучами. Очистка, стирка, мытьё, протирание, проветривание, вытряхивание, выколачивание и другие механические способы снижения массивности микробной контаминации также могут быть отнесены к дезинфицирующим мерам при оппортунистических инфекциях. Однако в подавляющем большинстве случаев для целей дезинфекции используют химические вещества, которые носят название дезинфектанты.

Дезинфектанты должны обладать:

1) широким спектром действия;

2) микробицидным эффектом;

3) хорошо растворяться в воде или образовывать с ней или с воздухом стойкие активные суспензии, эмульсии, аэрозоли, туманы;

4) обладать низкой токсичностью и аллергенностью;

5) сохранять активность в обеззараживаемой среде;

6) не повреждать обеззараживаемые объекты.

Сырьё, из которого изготавливаются дезинфектанты, должно быть доступным, а сам дезинфектант - недорогим. В нашей стране применяются дезинфектанты, представленные в табл. 2.

Таблица 2

Некоторые современные дезинфектанты, их состав и режимы применения

Примечание. *Торговые названия препаратов указаны исключительно в качестве примеров.

Выбор дезинфектанта, его концентрации, галеновой формы (раствор, аэрозоль, эмульсия, суспензия, порошок, паста, лак, краска, покрытие), экспозиции (времени действия дезинфектанта) зависит от требуемой степени дезинфекции, спектра и уровня чувствительности микроба-возбудителя, вида дезинфекции, объекта дезинфекции, условий, в которых протекает процесс дезинфекции. Из условий дезинфекции следует выделить температуру раствора, с повышением которой качество дезинфекции увеличивается. Она должна быть не ниже 20^о С.

1.2.2. Контроль качества дезинфекции.

Контроль качества дезинфекционных мероприятий периодически осуществляют отделы дезинфекции ЦГЭиОЗ, дезинфекционных станций и лаборатории больниц. Контроль проводят: визуальным, бактериологическим и биологическим методами. Бактериологический контроль качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций проводят путём выявления бактерий группы кишечной палочки (БГКП), в очагах капельных инфекций - путём выявления стафилококка, в ЛПО – условно-патогенных бактерий. В родовспомогательных и хирургических отделениях, кроме того, определяют общее число бактерий в воздухе и там же - число золотистого стафилококка в 1 м³ . При лабораторном контроле качества дезинфекции по эпидпоказаниям производят смывы для выделения патогенных бактерий. Пробы отбирают не позже 30-45 мин по окончании дезинфекции. В квартирных очагах берут не менее 10 контрольных смывов, в ЛПО и детских учреждениях - не менее 30. Площадь смыва должна составлять 100-200 см² . У мелких предметов смывают всю поверхность. При отборе проб отмечают дату взятия, когда и кем приготовлен дезраствор, какая концентрация указана на этикетке, каковы условия хранения препарата. Смывы осуществляют стерильным ватным тампоном на палочке, вмонтированном в бактериологическую пробирку. В пробирке должен содержаться увлажнитель тампона (нейтрализатор дезинфектанта, например, 1% раствор тиосульфата натрия для хлорсодержащих препаратов).

Посевы смывов проводят с соблюдением правил асептики, в условиях, исключающих возможность вторичной контаминации, обычно в боксах, микробная контаминация воздуха которых должна составлять не более трёх колоний сапрофитных бактерий на 2 чашки с МПА, оставленные открытыми на столе бокса на 15 минут.

Смывы (тампоны) из очагов кишечных инфекций засевают в среду Кесслера (или среду Кода), которую инкубируют в термостате при 37^о С. Через сутки из среды Кесслера (Кода) делают высев на чашки со средой Эндо. После 48-часовой инкубации в термостате при 37^о С чашки просматривают, из подозрительных колоний (гладкие, красного или розового цвета) делают мазки, окрашивают их по Граму и проводят тест на оксидазу. Из остатков колоний, содержащих грамотрицательные палочки, делают пересев на полужидкую глюкозопептонную среду (ГПС). Среду инкубируют в термостате при 37^о С одни сутки, после чего определяют образование газа и кислоты при ферментации глюкозы. К БГКП относят грамотрицательные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием кислоты и газа, оксидазоотрицательные. Дезинфекция считается качественной, если из всех смывов не выделены БГКП.

Смывы (тампоны) из очагов капельных инфекций засевают в 6,5% солевой бульон; бульон инкубируют в термостате при 37^о С одни сутки; делают высев на ЖСА; инкубируют ЖСА 48 часов при температуре 37^о С; из подозрительных колоний на ЖСА (лецитиназоположительных и отрицательных) делают пересев на скошенный МПА. После суточной инкубации при 37^о С у культуры на скошенном МПА определяют плазмокоагулазу и морфологию в мазке, окрашенном по Граму. Заключение об обнаружении золотистого стафилококка делают на основании роста в солевом бульоне, на ЖСА, характерной морфологии и положительной реакции на плазмокоагулазу. Дезинфекция считается качественной, если стафилококк не обнаружен во всех смывах.

Бактериологический контроль качества дезинфекционных мероприятий в ЛПО осуществляют методом смывов с различных объектов окружающей среды для выделения санитарно-показательных бактерий. В лаборатории тампоны опускают в среду Кесслера (Кода), а смывную жидкость переносят в 6,5% солевой бульон. После суточной инкубации при 37^о С со среды Кесслера (Кода) делают пересев на среду Эндо, а с солевого бульона - на ЖСА. Дальнейший ход исследования культур, выросших на ЖСА, таков же, как при контроле дезинфекции в очагах капельных и кишечных инфекций.

1.3. Антисептика

Под антисептикой понимают совокупность способов уничтожения или подавления жизнедеятельности потенциально опасных для здоровья человека микроорганизмов в ранах, на интактных и повреждённых коже, слизистых оболочках и в полостях с целью предупреждения развития и лечения инфекционных процессов. Антисептику необходимо отличать от антимикробной химиотерапии , которая представляет собой совокупность способов уничтожения или подавления жизнедеятельности потенциально опасных для человека микроорганизмов во внутренней среде организма с целью предупреждения развития и лечения инфекционных болезней.

В зависимости от цели выделяют два типа антисептики: профилактическую и терапевтическую.

Профилактическая антисептика применяется для предупреждения развития инфекционных заболеваний путём резкого снижения численности микробных популяций на нормальных или повреждённых участках кожи и слизистых оболочек. Различают следующие категории профилактической антисептики:

1) профилактическая антисептика свежих травматических, операционных и ожоговых ран,

2) хирургическая антисептика рук медицинского персонала, участвующего в хирургическом вмешательстве,

3) гигиеническая антисептика рук медицинских работников перед, в процессе и после проведения мануальных и инструментальных диагностических и терапевтических процедур,

4) антисептика кожи и слизистых оболочек перед оперативным или иным вмешательством, ведущим к нарушению целости покровов,

5) профилактическая антисептика пупочной раны, опрелостей, ссадин кожи у новорождённых и др.

Терапевтическая антисептика ставит цели:

1) подавления жизнедеятельности возбудителя(лей) болезни в местном патологическом очаге с целью излечения болезни и предупреждения развития сепсиса, перехода острого процесса в хронический,

2) предупреждения повторного попадания микробов в патологический очаг и развития суперинфекции, реинфекции и вторичной инфекции. Процесс антисептики того или иного участка кожи и слизистых оболочек состоит из следующих этапов:

· очистки от грязи, сгустков крови, слизи, инородных частиц,

· хирургической обработки с иссечением мёртвых и нежизнеспособных тканей,

· внесении антисептического препарата,

· изоляции обработанного антисептиком биотопа от повторного попадания микробов,

При антисептической обработке здоровых тканей этап хирургической обработки, вполне понятно, не применяется. Этап нейтрализации остаточных количеств антисептика применяется в случаях появления раздражения в месте нанесения антисептика, при частом применении антисептика у чувствительных к нему людей.

Используемые для целей антисептики факторы называют антисептическими средствами. В зависимости от природы повреждающего фактора они подразделяются на:

· химические антисептики,

· биологические антисептики,

· физические и механические антисептические средства.

К последней группе относятся хирургическая обработка свежих и гнойных ран, проточное промывание и промывание пульсирующей струёй жидкости, вакуумная, лазерная и ультразвуковая обработка ран, дренирование, удаление содержимого ран повязкой или сорбентами. Химические и биологические средства антисептики подавляют или умерщвляют находящиеся в биотопе микроорганизмы. Физико-механические средства такой активностью не обладают, но они снижают численность микробных популяций, находящихся в патологическом очаге, до количеств, которые не оказывают патогенного действия. Сочетанное применение химических и биологических или химических и физико-механических средств антисептики даёт аддитивный (суммарный) или даже синергидный эффект.

1.3.1. Химические антисептические средства.

Применяемые в настоящее время антисептики в зависимости от источника получения и химической структуры разделяют на следующие классы:

1. Антибиотики антисептического назначения

2. Антисептики растительного и животного происхождения

3. Высшие жирные кислоты

4. Галогены и их органические и неорганические производные

5. Имидазольные антисептики

6. Катионные и анионные поверхностно-активные вещества (ПАВ)

7. Красители

8. Неорганические и органические кислоты и их производные

9. Нитрофурановые антисептики

10. Перекись водорода и перманганат калия

11. Спирты

12. Сульфаниламидные антисептики

13. Тяжёлые металлы и их неорганические и органические соли

14. Фенол и его производные

15. Хинолиновые антисептики

16. Четвертичные аммониевые соединения (ЧАС)

17. 8-оксихинолиновые антисептики

К готовым лекарственным формам (ГЛФ) антисептиков предъявляют ряд требований:

· наличие выраженного противомикробного действия и безвредность для организма человека (отсутствие отрицательных побочных эффектов);

· должны обладать достаточно широким спектром действия;

· должны хорошо растворяться в липидах и плохо в воде, что обеспечивает накопление в коже и слизистых и препятствует всасыванию в кровь;

· должны быть недорогими, экологически чистыми в производстве и стабильными при хранении;

· не должны существенно снижать противомикробную активность в присутствии гноя и других патологических и нормальных субстратов.

1.3.2. Биологические антисептические средства.

С антисептической целью применяются две группы препаратов: биопрепараты из микробов-антагонистов и бактериофаги. Для той и другой группы препаратов характерно, что они:

· содержат живые организмы, способные к размножению,

· оказывают прямое повреждающее действие на возбудителей инфекционных болезней,

· предназначены для местного применения с целью терапии и профилактики заболеваний,

· обладают специфичностью действия на микроорганизмы и безвредностью для пациента.

Бактериальные препараты готовят из живых авирулентных вариантов бактерий, обладающих стабильно высокой конкурентной активностью к отдельным видам патогенных и условно-патогенных микробов. Лучшие из производственных штаммов, кроме того, устойчивы к антибиотикам и антисептикам, что делает возможным их совместное применение. В настоящее время в медицинской практике из этой группы препаратов применяют: колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол, бактисубтил и др. Основное их назначение - терапия и профилактика кишечных инфекций, дисбактериозов. Реже их и с такими же целями вносят во влагалище и раны. Препараты бактериофагов готовят из живых поливалентных вирулентных бактериальных вирусов, обладающих свойством размножения в бактериях, которое заканчивается гибелью последних. Медицинская промышленность в настоящее время выпускает следующие формы бактериофагов: брюшнотифозный, дизентерийный, сальмонеллёзный, коли-протейный, стафилококковый, синегнойный, пиофаг комбинированный. Бактериофаги применяют для лечения и профилактики соответствующих заболеваний. Фаготерапию можно сочетать с терапией антибиотиками, антисептиками, иммунопрепаратами и другими фармакологическими средствами. Применяют местно и перорально.

1.4. Механизмы антимикробного действия

дезинфектантов и антисептиков

Микробостатическое и микробоцидное действие антисептиков и дезинфектантов связано с их способностью:

· вызывать деструкцию структур микробной клетки,

· повышать проницаемость цитоплазматической мембраны,

· окислять входящие в состав микробной клетки органические соединения,

· вступать в метаболические реакции с ферментами и метаболитами.

Таблица 3

Некоторые механизмы антибактериального действия

антисептиков и дезинфектантов

1.5. Резистентность микроорганизмов к антисептикам и дезинфектантам

Отдельные виды или формы микроорганизмов обладают природной устойчивостью к рабочим растворам антисептиков и дезинфектантов (рис.3), а в последние десятилетия наблюдается формирование и распространение форм микроорганизмов с приобретенной резистентностью к этим препаратам.

Рис.3. Резистентность к антисептикам и дезинфектантам в порядке убывания

Таблица 4

Некоторые механизмы резистентности микроорганизмов

к антисептикам и дезинфектантам

1.6. Контроль за распространением устойчивых к антибиотикам,антисептикам и дезинфектантам вариантов бактерий и грибов

В больничных стационарах широко распространены устойчивые к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам варианты бактерий. Явление устойчивости ведёт к снижению эффективности лечебных и противоэпидемических мероприятий, является одной из главных причин широкого распространения ВБИ. В связи с этим в больничных стационарах всех профилей и ряде других ЛПО устанавливается контроль (эпидемиологический и микробиологический мониторинг) за устойчивостью микроорганизмов к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам. В задачи такого контроля входит:

1) определение уровня и спектра устойчивости к антибиотикам и антисептикам бактерий и грибов, выделенных от стационарных больных:

· от хронических носителей из числа медицинского персонала и длительно находящихся в стационаре больных,

· из эпидемически значимых объектов внешней среды;

2) выборочное определение устойчивости циркулирующих в больничном стационаре микроорганизмов к дезинфектантам;

3) определение присутствия микроорганизмов в ГЛФ противомикробных препаратов (антибиотиков, антисептиков, дезинфектантов);

4) слежение за уровнем, перечнем и объёмом использования антибиотиков, антисептиков и дезинфектантов в больничном стационаре, а также за обоснованностью их применения;

5) обобщение и анализ информации об основных видах-возбудителях инфекционных заболеваний, прежде всего ВБИ, циркулирующих в стационаре, и частоты, уровня и спектра их устойчивости к противомикробным препаратам.

Контроль за устойчивостью микроорганизмов к противомикробным препаратам является ключевым звеном системы эпидемиологического надзора за ВБИ.

1.7. Микробиологический контроль за присутствием

микроорганизмов в ГЛФ антибиотиков, антисептиков и дезинфектантов

ГЛФ по степени микробиологической чистоты разделяются на инъекционные и неинъекционные. К инъекционным ГЛФ предъявляются требования стерильности. В неинъекционных препаратах, за рядом исключений, допускается содержание качественно и количественно регламентированного количества бактерий и грибов. Поэтому первую группу препаратов называют ещё стерильными, вторую - нестерильными. В процессе развития медицинской помощи круг ГЛФ, к которым предъявляются требования стерильности, всё больше расширяется. Микроорганизмы попадают в ГЛФ, во-первых, в процессе их изготовления, и, во-вторых, в процессе хранения и использования в лечебных учреждениях. В процессе изготовления (в лабораториях, на заводах, в аптеках и др.) микроорганизмы заносятся в лекарственный препарат с сырьём, полуфабрикатами, растворителями и разбавителями, посудой, руками работников, с воздухом и др. В лечебных учреждениях микробы попадают в лекарственный препарат в случаях хранения в открытых ёмкостях, многократного забора препарата и др. Возможность выживания и даже размножения попавших в противомикробные препараты штаммов микроорганизмов обеспечивается их природной или приобретённой устойчивостью к препарату, заниженной дозировкой препарата, истекшим сроком годности активнодействующего вещества (АДВ). Применение контаминированных (обсеменённых) микробами лекарств часто приводит к развитию инфекционного поражения тканей места введения препарата, которое может осложниться септикопиемией. Особенно опасен в смысле развития ятрогенной инфекции занос микроорганизмов в ГЛФ в больничных стационарах, так как в этих случаях в препараты чаще попадают больничные штаммы бактерий и грибов, обладающие повышенной вирулентностью и множественной устойчивостью к антибиотикам, а иногда также к антисептикам и дезинфектантам. Для предупреждения развития лекарственных инфекций - так называют осложнения, вызванные проникшим в организм вместе с лекарственным препаратом микроорганизмом,- осуществляют микробиологический контроль за ГЛФ антибиотиков, антисептиков и дезинфектантов. Имеется две формы такого контроля: производственный и текущий. Производственный контроль осуществляет предприятие, выпускающее препарат в лечебную сеть, текущий - баклаборатория лечебного учреждения и/или санитарно-бактериологическая лаборатория ЦГЭиОЗ. Инъекционные и приравненные к ним препараты контролируют на стерильность, остальные препараты - на микробиологическую чистоту (микробную контаминацию).

1.7.1. Методика контроля стерильности противомикробных препаратов.

Целью контроля является обнаружение живых микробов в ГЛФ противомикробных препаратов, которые отнесены к категории стерильных. Испытание на стерильность проводят в асептических условиях: в боксах, в стерильной одежде, обработанными антисептиками руками, используя стерильные инструменты, посуду и среды. Для малых объёмов испытуемого препарата обычно используют метод прямого посева, для больших объёмов - метод мембранных фильтров. В том и другом случае посев проводят на одни и те же стандартные среды, которыми являются:

· жидкая тиогликолевая среда, рН 7,2 (для аэробных и анаэробных бактерий)

· жидкая среда Сабуро, рН 5,6 (для грибов).

Обе среды стерилизуют 15 мин насыщенным паром при температуре 121^о С.

Метод прямого посева. Испытуемый лекарственный препарат засевают в стерильные колбы (пробирки) со средами в соотношении 1:10, исходя из объёма контролируемой единицы ГЛФ: при объёме менее 1 мл засевают весь объём, 1-4 мл - 1 мл; 5-19 мл - 2 мл; 20-100 мл - 2-4 мл; более 100 мл - 10 мл. Одновременно ставят контроль на нейтрализацию противомикробного вещества разведением, для чего в посевы таких же объёмов и тех же сред вносят по 0,1 мл взвеси суточных культур (посевная доза около 1000 бактерий) тест-штаммов золотистого стафилококка, кишечной палочки и сенной бациллы. Посевы инкубируют 14 дней: тиогликолевую среду - при 3-35^о С, среду Сабуро - при 20-25^о С. По мере помутнения среды или в конце инкубации (14 день) делают высев на среды с последующим приготовлением мазка и окраской его по методу Грама. Если после 14-дневной инкубации в опытных колбах (пробирках) нет микроорганизмов, а в контроле нейтрализации есть рост, то испытуемый препарат считается стерильным; при наличии роста в опытных и контрольных посевах испытуемый препарат оценивается как нестерильный. При испытании на стерильность мазей, паст, гелей, эмульсий на жировой основе, а также растворов препаратов в маслах, образец (0,1 мл (г)) асептически отобранного испытуемого препарата вносят в колбы, содержащие стеклянные бусы, 100 мл 1/15 М фосфатного буфера и эмульгатор твин-80 в концентрации 2,5%. Содержимое колб подогревают до 41^о С, встряхивают до получения однородной эмульсии, после чего по 5 мл полученной эмульсии вносят в колбы с 40 мл тиогликолевой среды и среды Сабуро. Дальнейший ход исследования и оценка такие же, как при испытании растворов. Методика санитарного и внутреннего контроля за микробной контаминацией нестерильных противомикробных препаратов. Согласно Госфармакопее, выпускаемые в ЛПО нестерильные лекарственные средства не должны содержать представителей семейства энтеробактерий, золотистых стафилококков и синегнойных бактерий в объёме 10 мл. В препаратах, предназначенных для применения на коже, допускается присутствие не более 200 сапрофитических бактерий в 1 г (мл); в препаратах перорального применения - не более 1000 бактерий и 100 грибов в 1 мл (г). Такие же требования предъявляются при осуществлении текущего и санитарного контроля. Имеются дополнительные требования к ГЛФ для детей.

Подготовка препарата к исследованию. Для испытания образец препарата готовят в форме раствора, суспензии или эмульсии. Твёрдые ГЛФ (порошки, таблетки, драже и др.) измельчают и разводят в стерильном фосфатном буфере 1:10. Жидкие ГЛФ (растворы, капли, настои, отвары, сиропы, лосьоны и др.) разбавляют стерильным фосфатным буфером также 1:10. Мягкие ГЛФ (мази, пасты, свечи, эмульсии и др.) готовят к испытанию по такой же методике как при испытании на стерильность (см.).

Определение общего микробного числа. При титрационном методе основное разведение разводят в 10 раз фосфатным буфером или 0,5% раствором хлорида натрия с 0,1% желатином. По 1 мл основного (1:10) и дополнительного (1:100) разведений вносят в 2 стерильные чашки, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 48-50^о С сахарного МПА. Посевы инкубируют при 30- 35^о С 48 часов, после чего подсчитывают число колоний и рассчитывают среднее число колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл (г) цельного испытуемого препарата. Среднее число КОЕ в посеве основного разведения для кожных антибиотиков и антисептиков должно быть не больше 10, для пероральных - не больше 100, в дополнительном разведении - соответственно не больше 1 и 10. У сильных антибиотиков и антисептиков в посеве основного разведения может наблюдаться торможение роста или полное отсутствие роста, вызванное ингибирующим действием остаточной концентрации препарата. В разведении 1:100 такое явление мало вероятно. Тем не менее, в таких случаях лучше использовать метод мембранных фильтров. Испытание ГЛФ на общее содержание в них грибов проводят также способом прямого посева, но на плотную среду Сабуро, которую инкубируют 5 суток при 20-25^о С. Определение присутствия в ГЛФ противомикробных препаратов энтеробактерий, стафилококков и синегнойных бактерий проводят способами прямого посева или мембранных фильтров. При способе прямого посева 10 г (мл) образца препарата засевают на 100 мл среды обогащения. Для энтеробактерий такой средой является бульон Хоттингера, для стафилококков и синегнойных бактерий - 5% солевой бульон. Посевы инкубируют 48 часов при 30-35^о С, после чего делают пересев со среды Хоттингера на среду Эндо, из одной колбы солевого бульона - на ЖСА (на стафилококки), из другой колбы с солевым бульоном - на среду Кинг А (для выявления пигмента). Идентификация выделенных культур проводится по тем же тестам, как и в других случаях выделения этих бактерий из объектов внешней среды. При отсутствии в посевах 10 г образца препарата энтеробактерий, золотистых стафилококков и синегнойных бактерий делается вывод о пригодности препарата для использования в лечебных и профилактических целях. Метод прямого посева на среды может дать искажённые результаты в случаях, если разведение препарата в 10 раз недостаточно для исключения противомикробного действия препарата. В этих случаях необходимо параллельно ставить контроль на нейтрализацию с типовыми тест-штаммами кишечной палочки, золотистого стафилококка и синегнойных бактерий. Более надёжные результаты даёт испытание методом мембранных фильтров.

2. методические рекомендации к самостоятельному выполнению заданий по контролю качества противомикробных мероприятий

2.1. Стерилизация изделий из стекла и контроль ее качества

Цель: Освоить методику контроля качества стерилизации.

Задания:

1. Подготовить к стерилизации и простерилизовать стеклянные пипетки,

2. Провести контроль качества стерилизации.

Материалы: суховоздушный стерилизатор, пипетки стеклянные, бумага плотная (крафт), бульон Хоттингера, тиогликолевая среда, бульон Сабуро, реактивы для окраски по Граму.

Методика стерилизации:

1. Провести предстерилизационную очистку и дезинфекцию пипеток: а) погрузить пипетки на 15 минут в 3% раствор перекиси водорода с 0,5% препарата типа «Лотос»; б) промыть пипетки струёй тёплой воды в течение 1 минуты; в) просушить;

2. Завернуть пипетки в плотную (крафт) бумагу;

3. Простерилизовать пипетки в суховоздушном стерилизаторе при режиме: температура 180^о С, экспозиция 60 минут;

4. После охлаждения на свободном конце упаковки указать дату и способ стерилизации.

Методика контроля качества стерилизации (рис.4):

1. В асептических условиях над пламенем спиртовки втянуть стерильные среды Сабуро, Хоттингера, тиогликолевую среду до половины пипетки и выдуть её обратно в пробирку (на каждую среду отдельная пипетка);

2. Среды Хоттингера и тиогликолевую поместить в термостат при температуре 32^о С, бульон Сабуро оставить при температуре 20-22 ^о С;

3. Наблюдать за помутнением среды в течение 8 дней;

4. В случае помутнения сделать препарат-мазок, окрасить его по Граму, микроскопировать для констатации наличия бактерий.

5. Сделать заключение: стерилизация считается качественной, если во всех средах при восьмидневной инкубации не появился рост бактерий.

Рекомендации по выполнению задания:

1. Подготовка и стерилизация проводится в первый день, на следующем занятии проводится контроль качества стерилизации.

2. Наблюдение за средами вести до появления помутнения. В случае помутнения одной из сред делают препарат-мазок и при обнаружении в нем бактерий дают заключение. При отсутствии помутнения в течение 8 дней наблюдение прекращают и дают заключение.

3. Выполнение задания оформляется в виде протокола в альбоме.

Пипетки втянуть и выдуть пипетками среды

Стерилизованные Бульон Тиогликолевая Бульон

пипетки Хоттингера среда Сабуро

инкубация инкубация

32^о С– 8 сут. комн. t ^о С– 8 сут.

по Граму

Рис. 4. Методика контроля качества стерилизации предметов из стекла

2.2. Стерилизация медицинского инструментария и контроль ее качества

Цель: Освоить методику контроля качества стерилизации медицинского инструментария.

Задания:

1. Простерилизовать инъекционные иглы в паровом стерилизаторе (автоклаве);

2. Провести контроль качества стерилизации.

Материалы: паровой стерилизатор, нестерильные инъекционные иглы; нестерильные бактериологические пробирки, бульон Хоттингера, тиогликолевая среда, бульон Сабуро, реактивы для окраски по Граму.

Методика стерилизации:

1. Провести предстерилизационную очистку и дезинфекцию игл: а) промыть иглы в проточной воде 5 минут; б) замочить иглы в горячем 3% растворе перекиси водорода с 0,5% препарата типа «Лотос» на 15 минут; в) прополоскать иглы струёй тёплой воды в течение одной минуты;

2. Поместить иглы в контейнер (бактериологические пробирки);

3. Простерилизовать иглы в автоклаве: давление 2,0 атмосферы, экспозиция 20 минут.

4. После стерилизации и охлаждения отметить на контейнере дату и способ стерилизации.

Методика контроля качества стерилизации (рис. 5):

1. В асептических условиях над пламенем спиртовки погрузить по одной простерилизованной игле в среды Хоттингера, тиогликолевую и бульон Сабуро;

2. Среды Хоттингера и тиогликолевую поместить в термостат при температуре 32^о С, бульон Сабуро оставить при температуре 20-22 ^о С;

3. Наблюдать за помутнением сред в течение 8 дней;

4. В случае помутнения сделать препарат-мазок из помутневшей среды и окрасить его по Граму, микроскопировать для констатации наличия бактерий;

5. Дать заключение: стерилизация считается качественной, если во всех средах на протяжении восьми дней не появился рост бактерий.

Рекомендации по выполнению задания:

1. Стерилизацию провести в первый день, погружение простерилизованных игл в питательные среды - на следующем занятии;

2. Наблюдение за средами вести до появления помутнения, но не больше 8 дней. В случае помутнения одной из сред делают препарат-мазок и при обнаружении в нем бактерий дают заключение. Дальнейшее наблюдение за средами прекращают.

3. Выполнение задания оформляется в виде протокола в альбоме.

Инъекционные иглы

Стерилизованные бульон тиогликолевая бульон

иглы Хоттингера среда Сабуро

инкубация инкубация

32^о С– 8 сут. комн. t ^о С– 8 сут.

по Граму

Рис. 5. Методика контроля качества стерилизации инструментов

2.3. Контроль качества дезинфекции поверхностей в очагах

капельных инфекций

Цель: освоить методику контроля качества дезинфекции в очагах капельных инфекций.

Задания:

1. Провести дезинфекцию поверхностей 0,5% раствором хлорамина;

2. Проконтролировать качество дезинфекции.

Материалы: 0,5% раствор хлорамина; трафарет 10×10 см, поверхность лабораторного стола, взвесь суточной 1 млрд. культуры S . aureus , ватные тампоны для контаминации, стерильные тампоны, смонтированные в пробирке с 1 мл 1% тиосульфата натрия, среды: 6,5% солевой бульон, чашки с ЖСА, скошенный МПА, плазма кроличья, реактивы для окраски по Граму.

Методика:

1. Ограничить площадь лабораторного стола или иной поверхности трафаретом 10х10 см;

2. Контаминировать её тампоном, смоченным взвесью стафилококка (дважды по 1 мин); дать высохнуть;

3. Тщательно в течение 10 минут протереть тампоном, смоченным раствором хлорамина (не ниже 20^о С), ограниченную трафаретом и контаминированную стафилококком поверхность.

Методика контроля качества дезинфекции:

1. Проводится не позднее 30-45 минут после дезинфекции;

2. Смыть стерильным ватным тампоном, смоченным в растворе тиосульфата натрия, продезинфицированную площадь (не выходя за границы трафарета);

3. Тампон опустить в пробирку с солевым бульоном;

4. Через 24 часа инкубации в термостате при 37^о С из бульона сделать высев на ЖСА;

5. После 48-часовой инкубации в при 37^о С подозрительные колонии высеять из ЖСА на скошенный МПА, поместить МПА в термостат на 24 часа при 37^о С;

6. Сделать мазки с окраской по Граму из культуры на МПА и поставить пробу на плазмокоагулазу;

7. Ответ об обнаружении золотистого стафилококка дают на основании характера роста на питательных средах, характерной морфологии и положительного теста на плазмокоагулазу;

8. Заключение: дезинфекция считается качественной, если в посевах смывов не выделен золотистый стафилококк.

Рекомендации по выполнению задания:

1. В первый день провести дезинфекцию, сделать смыв и посеять его в солевой бульон; на второй день из солевого бульона сделать высев на среду ЖСА; на четвёртый день отсеять подозрительные колонии на скошенный МПА; на пятый день определить морфологию, поставить тест на плазмокоагулазу и дать заключение.

2. Выполнение задания оформляется в виде протокола в альбоме.

по Граму

плазма МПА ЖСА солевой бульон

37^о С – 24 ч. 37^о С – 48 ч. 37^о С – 24 ч.

Рис. 6. Общая схема исследования по контролю качества дезинфекции поверхностей в очаге капельных инфекций

2.4. Контроль качества дезинфекции поверхностей в очагах

кишечных инфекций

Цель: освоить методику контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций.

Задания:

1. Провести дезинфекцию посуды 0,5% раствором хлорамина;

2. Проконтролировать качество дезинфекции.

Материалы: 0,5% раствор хлорамина; взвесь суточной 1 млрд. агаровой культуры E . coli , ватные тампоны для контаминации чашек, стерильные тампоны, смонтированные в пробирках с 1 мл 1% тиосульфата натрия, среды: Кесслера, Эндо и ГПС; реактивы для окраски по Граму, кастрюля на 1-2 л., чашки Петри.

Методика:

1. Тампонами, увлажненными взвесью тест-микроба контаминировать внутреннюю поверхность чашки Петри.

2. Контаминированные E . coli и высушенные чашки Петри опускают в раствор хлорамина (температура не ниже 20^о С);

3. После 15-минутной экспозиции чашки вынимают из дезраствора.

4. Методика контроля дезинфекции (не позднее 30-45 минут после дезинфекции):

5. Всю внутреннюю поверхность чашки протереть тампоном, смоченным раствором тиосульфата натрия;

6. Тампон опустить в среду Кесслера, которую поставить в термостат при 37^о С на одни сутки;

7. Сделать высев со среды Кесслера на среду Эндо петлёй и выдержать среду в термостате при 37^о С - 48 часов;

8. Подозрительные колонии (красного и розового цвета гладкой формы), содержащие грамотрицательные палочки, пересеять на ГПС;

9. После суточной инкубации при 43^о С учесть образование кислоты и газа;

10. Ответ об обнаружении кишечной палочки дают на основании характера роста на средах Кесслера и Эндо, грамотрицательной окраски бактерий, ферментации глюкозы с образованием кислоты и газа;

11. Заключение: дезинфекция считается качественной, если из смывов продезинфицированного объекта не выделена кишечная палочка.

Рекомендации по выполнению задания:

1. Ход выполнения: в первый день провести дезинфекцию, сделать смыв с продезинфицированных чашек и посеять смыв на среду Кесслера; на второй день - из среды Кесслера сделать высев на среду Эндо; на четвертый день - отобрать подозрительные колонии, сделать мазок и в случае обнаружения грамотрицательных палочек остаток колонии пересеять на полужидкую ГПС; на пятый день - учесть ферментацию глюкозы и сделать заключение.

2. Выполнение задания оформляется в виде протокола в альбоме.

по Граму

ГПС Cреда Эндо Cреда Кесслера

43^о С – 24 ч. 37^о С – 24 ч. 37^о С – 24 ч.

Рис. 7. Общая схема исследования по контролю качества дезинфекции поверхностей в очаге кишечных инфекций

2.5. Методика испытания противомикробной активности антисептика профилактического назначения. Гигиеническая антисептика.

Цель: освоить методику испытания противомикробной активности антисептика профилактического назначения.

Материалы:

Стерильные чашки Петри – 8 шт., чашка Петри с 10-15 мл взвеси тест-культуры E . coli плотностью 10⁹ КОЕ/мл., пробирки с 10 мл 1% пептонной воды – 8 шт., пробирки с 4,5 мл 1% пептонной воды – 32 шт., чашки с МПА – 8 шт., стерильные пипетки на 1-2 мл – 32 шт., пастеровские пипетки – 8 шт.

Методика:

I этап:

1. Вымыть руки теплой водой с туалетным мылом (2 минуты). Высушить руки на воздухе.

2. Контаминировать кожу 2-х дистальных фаланг указательного, среднего и безымянного пальцев одной руки взвесью E . coli плотностью 10⁹ КОЕ/мл путем погружения на 10 сек. в чашку Петри с культурой. Высушить контаминированные пальцы на воздухе.

3. Провести смывы с контаминированных пальцев руки в чашке с 10 мл 1% пептонной воды путем втирания в дно чашки (контроль).

4. Выполнить обработку кожи рук антисептиком путем тщательного втирания 3 мл препарата в кожу в течение 30 секунд.

5. Провести смывы с контаминированных фаланг пальцев руки в чашке с 10 мл 1% пептонной воды путем втирания в дно чашки (опыт).

6. Выполнить посевы смывов (рис. 8).

0,5 мл смывной жидкости из чашки Петри перенести в пробирку с 4,5 мл 1% пептонной воды и далее приготовить разведения от 10^-1 до 10^-4 .

Все разведения смывов посеять по 0,05 мл на соответствующие сектора чашек Петри с МПА.

II этап:

9. Подсчитать количество колоний на секторах чашек.

10.Определить концентрацию жизнеспособных бактерий (КОЕ/мл) в контрольных и опытных высевах и десятичные логарифмы числа выживших микробов.

Формула для определения концентрации жизнеспособных бактерий (КОЕ/мл):

N = n ×20 ×10 ^x ,

где: n – число колоний на питательной среде; 20 – коэффициент перерасчета посевного объема; 10^х – фактор разведения.

11.Рассчитать фактор редукции (разница между десятичными логарифмами КОЕ/мл в контроле и опыте).

Примеры расчета показателей:

Число колоний на секторе «10^-4 » в контроле 5 шт., КОЕ/мл – N_к =5×20×10⁴ =1 ×10⁶ ; десятичный логарифм – ln_к =6,0.

Число колоний на секторе «10^-1 » в опыте 4 шт., КОЕ/мл – N_о =4×20×10¹ =0,8×10³ ; десятичный логарифм – ln_о =3,9

RF (фактор редукции) = ln_к - ln_о = 6,0-3,9=2,1 ln

Значения десятичных логарифмов чисел определяются по таблицам или с помощью калькулятора.

Для гигиенической антисептики активность препаратов (величина фактора редукции) по отношению к тест-культуре E . coli должна составлять > 4,0 ln.

Чашка Петри со 0,5 мл 0,5 мл 0,5 мл

смывной жидкостью

0,5 мл 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4

0,05 мл

МПА

Рис. 8. Схема выполнения посевов при испытании противомикробной активности антисептика профилактического назначения

2.6. Методика испытания противомикробной активности антисептика профилактического назначения. Хирургическая антисептика.

Цель: освоить методику испытания противомикробной активности антисептика профилактического назначения.

Материалы:

Стерильные чашки Петри – 8 шт., пробирки с 10 мл 1% пептонной воды – 8 шт., пробирки с 4,5 мл 1% пептонной воды – 24 шт., чашки с МПА – 8 шт., стерильные пипетки на 1-2 мл – 24 шт., пастеровские пипетки – 8 шт.

I этап:

1. Вымыть руки теплой водой с туалетным мылом (2 минуты).

2. Высушить руки на воздухе.

3. Провести смывы с кожи 2-х дистальных фаланг указательного, среднего и безымянного пальцев одной руки в чашке с 10 мл 1% пептонной воды путем втирания в дно чашки (контроль).

4. Выполнить обработку кожи рук антисептиком путем тщательного втирания препарата в кожу дважды по 5 мл в течение 5 минут.

5. Провести смывы с кожи дистальных фаланг пальцев другой руки в чашке с 10 мл 1% пептонной воды путем втирания в дно чашки (опыт).

6. Выполнить посевы смывов (рис.9).

0,5 мл смывной жидкости из чашки Петри перенести в пробирку с 4,5 мл 1% пептонной воды и далее приготовить разведения от 10^-1 до 10^-3 .

Все разведения смывов посеять по 0,05 мл на соответствующие сектора чашек Петри с МПА.

II этап:

9. Подсчитать количество колоний на секторах чашек.

10.Определить концентрацию жизнеспособных бактерий (КОЕ/мл) в контрольных и опытных высевах и десятичные логарифмы числа выживших микробов.

Формула для определения концентрации жизнеспособных бактерий (КОЕ/мл):

N=n×20 ×10^x ,

где: n – число колоний на питательной среде; 20 – коэффициент перерасчета посевного объема; 10^х – фактор разведения.

11.Рассчитать фактор редукции (разница между десятичными логарифмами КОЕ/мл в контроле и опыте).

Примеры расчета показателей:

Число колоний на секторе «10^-3 » в контроле 5 шт., КОЕ/мл – N_к =5×20×10³ =1 ×10⁵ ; десятичный логарифм – ln_к =5,0.

Число колоний на секторе «10^-1 » в опыте 4 шт., КОЕ/мл – N_о =4×20×10¹ =0,8×10³

десятичный логарифм – ln_о =3,9.

RF (фактор редукции) = ln_к - ln_о = 6,0-3,9=2,1 ln

Значения десятичных логарифмов чисел определяются по таблицам или с помощью калькулятора.

По отношению к собственной микрофлоре рук фактор редукции должен быть > 2,0 ln.

Чашка Петри со 0,5 мл 0,5 мл

смывной жидкостью

0,5 мл 10^-1 10^-2 10^-3

по 0,05 мл

МПА

Рис. 9. Схема выполнения посевов при испытании противомикробной активности антисептика профилактического назначения

2.7. Контроль стерильности готовых лекарственных форм

антибиотиков и антисептиков

Цель: Освоить методику контроля стерильности готовых лекарственных форм противомикробных препаратов.

Задание: Провести испытание на стерильность образца 0,02% водного раствора фурацилина.

Материалы: Образец 0,02% раствора фурацилина; две бутылочки с 40 мл стерильной тиогликолевой среды, рН 7,2; две бутылочки с жидкой стерильной средой Сабуро, рН 5,6; по 1,0 мл бульонных культур тест-штаммов S . aureus (ATCC 653 P) и C . albicans (ATCC 885-653) плотностью 10 КОЕ/мл; пипетки стерильные 5 мл - 4; пипетка стерильная 1 мл - одна; реактивы для окраски по методу Грама; предметные стёкла, микроскоп.

Методика испытания (рис. 10):

1. 5 мл образца испытуемого препарата внести в колбу со средой Сабуро;

2. 5 мл образца препарата внести в колбу с тиогликолевой средой;

3. В колбу с тиогликолевой средой внести 5 мл образца препарата и 0,1 мл взвеси тест-культуры S . aureus (контроль качества нейтрализации);

4. В колбу со средой Сабуро внести 5 мл образца препарата и 0,1 мл взвеси тест-культуры C . albicans (контроль качества нейтрализации);

5. Тиогликолевые среды поместить в термостат при 30-35^о С, среды Сабуро инкубируют при 20-25^о С. Наблюдение ведут 14 дней.

6. В контрольных посевах должно быть помутнение. В случае помутнения опытных посевов, не дожидаясь окончания срока наблюдения, а при отсутствии помутнения на 14 день инкубации из опытных и контрольных посевов следует приготовить мазки и окрасить их по Граму.

Оценка результатов:

1. Препарат считается стерильным, если в опытных посевах нет роста микроорганизмов, а в контрольных - есть рост.

2. Препарат считается нестерильным, а, следовательно, непригодным к использованию, если в опытных и контрольных посевах обнаружен рост микроорганизмов.

3. Если в контрольных посевах нет роста, исследование повторяют, используя метод мембранной фильтрации.

Среда Сабуро Исследуемый Тиогликолевая среда

образец ГЛС

5 мл 5 мл

0,1 мл 0,1 мл

тест-культуры Candida , 20-25^о С тест-культуры Staphylococcus , 30-35^о С

14 дней 14 дней

Рис. 10. Методика контроля стерильности готовых лекарственных форм противомикробных препаратов

2.8. Определение общего микробного числа в готовых

лекарственных формах дезинфектантов

Цель: Освоить методику контроля микробной контаминации ГЛФ противомикробных препаратов.

Задание: Определить общее микробное число в образце 0,5% раствора хлорамина.

Материалы: Образец 0,5% водного раствора хлорамина в объёме 10 мл. Стерильные чашки Петри - две. 2% МПА в пробирках по 20 мл – 2. 0,5% раствор тиосульфата натрия в пробирках по 9 мл – 2. Пипетки 1 мл - 2.

Методика испытания (рис. 11):

1. Образец развести 0,5% раствором тиосульфата натрия в 10 раз (основное разведение).

2. Основное разведение разбавить 0,5% раствором тиосульфата натрия в 10 раз (дополнительное разведение).

3. По 1 мл основного и дополнительного разведений внести в пустые стерильные чашки Петри (раздельно).

4. Чашки залить 20 мл расплавленного и охлаждённого до 45±5^о С МПА, смешать, оставить на ровной поверхности до затвердения.

5. Поместить в термостат при 30-35^о С на 40 часов.

6. Подсчитать количество КОЕ на обеих чашках и сделать пересчёт на 1 мл испытуемого препарата.

Оценка результатов:

Микроорганизмы не должны обнаруживаться в 100 мл раствора дезинфектанта, предназначенного для хранения стерильного инструментария. В остальных типах дезинфицирующих растворов (в 10 мл) не должны обнаруживаться патогенные микроорганизмы, S . aureus , энтеробактерии и P . aeruginosa . Допускается наличие сапрофитных бактерий не более 10 в 100 мл исследуемого раствора.

Исследуемый Разведение Разведение

образец ГЛФ образца 1:10 образца 1:100

(основное) (дополнительное)

0,5% раствор фосфатный буфер фосфатный буфер

хлорамина 90 мл 90 мл

10 мл

1 мл 1мл

20 мл МПА 20 мл МПА

Рис. 11. Методика контроля микробной контаминации ГЛФ противомикробного препарата

ЛИТЕРАТУРА

1. Беляков В. Д., Дегтярев А. А., Иванников Ю. Г. Качество и эффективность противоэпидемических мероприятий. - Л.: Медицина, 1981. - 304 с.

2. Гандельсман Б. И. Дезинфекционное дело. - М.: Медицина, 1971. - 391 с.

3. Гудкова Е. И., Красильников А. П. Контроль за микробной контаминацией антисептиков и дезинфектантов // Лабор. дело. 1991. – №1. – С. 59-61.

4. Козлов И. М., Лярский П. П. Руководство по дезинфекции, дезинсекции и дератизации. - М.: Медицина, 1983. - 277 с.

5. Красильников А. П. Справочник по антисептике. – Мн.: Выш. шк., 1995. – 367 с.

6. Методика определения чувствительности-устойчивости бактерий к антисептикам: Метод. рекомендации / Сост. А. А. Адарченко, А. П. Красильников, О. П. Собещук. - Мн.: МГМИ, 1989.

7. Приказ МЗ РБ № 165 от 25.11.2002 г. О проведении дезинфекции и стерилизации учреждениями здравоохранения. Приложения 1-5. – 2002. – 44 с.

8. Санитарная микробиология / Под ред. С. Я. Любашенко.–М.: Медицина. 1980.

9. Санитарные нормы и правила 3.2.569-96. - М., 1997.

10. Справочник по санитарной микробиологии / Под ред. Л. В.Григорьевой. – Кишинев. - 1981.

11. Чистенко Г. Н. Основы дезинфекции. / Мир медицины. – 2005, № 11. – С. 3-5.

12. Чистенко Г. Н. Основы дезинфекции. / Мир медицины. – 2005, № 12. – С. 2-4.

13. Чистенко Г. Н. Основы дезинфекции. / Мир медицины. – 2005, № 9. – С. 2-4.

14. Чистенко Г. Н., Филонов В. П., Горбачева В. Н. Основы дезинфекции и стерилизации. – Мн.: Асобны Дах, 1998. – 160 с.

15. McDonnell G., Russell D. / Clinical Microbiology Reviews. – 1999, Vol.12, P.147-179.

Оглавление

УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ

Горбунов Владимир Анатольевич,

Гудкова Елена Ивановна

Микробиологические основы

противомикробных мероприятий

Учебно-методическое пособие

Ответственный за выпуск: доцент В. А. Горбунов

Редактор

Компьютерная верстка

Подписано в печать г. Формат 60х84/16. Бумага писчая.

Печать офсетная. Гарнитура «Times».

Усл. печ. л. _____. Уч.-изд. л. _____. Тираж _____экз. Заказ _____.

Издатель и полиграфическое исполнение –

Белорусский государственный медицинский университет

ЛИ № 02330/0133420 от 14.10.2004; ЛП № 02330/0131503 от 27.08.2004.

220050, г. Минск, Ленинградская, 6.