ЭКОНОМИКА И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ И МОДОЛИРОВАНИЕ ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

КАСЫМ Р.Т. – магистр, член Ассоциации ВТПУ, старший преподаватель

Тленшиев Н.А. – магистрант

Визуализация биологических данных является частью биоинформатики, которая фокусируется на вопросах применения компьютерной графики в различных областях наук о жизни. Только часть проблем, которые решаются в этой области включают визуализацию генома, макромолекулярных структур, филогению зубов, микроскопию и визуализацю данных магнитно-резонансной томографии. Программное обеспечение систем визуализации также разнообразно, начиная от сравнительно простых до сложных интегрированных программных решений. Визуализация широко используется в образовательных целях. В свою очередь различные методы моделирования используются для раскрытия сущности процессов, законов функционирования и описания систем. Моделирование биологических систем является одной из наиболее важных задач системной биологии и биоинформатики. Вычислительная биология развивает алгоритмы, структуры данных и методы визуализации и моделирования биологических систем. Методы компьютерного моделирования и соответствующие языки моделирования на основе XML часто используются при решении задач. Одной из задач является проблема моделирования и визуализации процесса апоптоза. Апоптоз играет важную роль во многих физиологических состояниях и заболеваниях [1], например в понимании развития рака и сердечно-сосудистых заболеваний. Общепринятыми стандартами моделирования (не только апоптоза) являются SBML [2], BioPax и CellML [3]. Есть также сравнительно новые проекты, включающие в себя FieldML [4, 5] - язык, который описывает пространства (поля) и используется для описания органов человеческого тела. Несмотря на существующий прогресс, задача визуализации биохимических процессов и моделей не решена полностью. Поэтому мы предлагаем подходы к визуализации моделей апоптоза на базе качественных(описательных) и количественных моделей. Для реализации некоторых видов визуализации, разработаны видео ролики и программное обеспечение на основе игрового движка и C#. Для поддержки процесса, была создана база данных трехмерных моделей молекулярных комплексов.

В отчете приводится краткий и, по-видимому неполный, обзор языков и сред моделирования биологических процессов, которые используются и могут быть использованы для описания апоптоза. Также дается анализ подходов создания системы визуализации моделей апоптоза.

Описывается область исследований, включающая задачу визуализации биологических моделей на разных уровнях иерархии

Описывается создание анимации и статических визуализаций процесса апоптоза с использованием качественных (описательных) моделей

Рассматривается визуализация апоптоза и моделей, основанных на языке CellML

Приводится описание рабочего прототипа программы симуляции молекулярных процессов, описываемых моделями на языке CellML.

Целью исследования являлось моделирование процессов апоптоза.

Задачей работы было моделирование процессов апоптоза для научно-образовательных программ с созданием сайта.

Порядка 60 миллиардов клеток в теле человека погибают каждый день, что составляет 1% от полного числа клеток. Клеточная гибель является одним из основных физиологических процессов. Процесс гибели клеток является обратным процессу деления клеток, то есть процессу, в котором новые клетки рождаются. Клеточная гибель необходима для поддержания клеточного гомеостаза, и, следовательно, для того, чтобы организм мог быть в здоровом состоянии.

В частности, клеточная смерть нужна для удаления поврежденных клеток, для регулирования количества клеток в различных физиологических процессах, а также для формирования различных частей тела во внутриутробном развитии зародыша.

Современное состояние науки о клеточной гибели отстает в развитии от объема научных знаний о делении клеток. Причина в том, что деление клеток легче наблюдать экспериментально, чем клеточную смерть. В процессе деления, появляются новые клетки, поэтому продукты этого деления, а также состав этих клеток доступны для изучения в течение периода времени достаточного для применения многих, наработанных годами цитологических методик. В противоположность этому, клеточная смерть происходит за короткое время, и продукты гибели перерабатываются фагоцитами, разлагаются на элементарные молекулы для дальнейшего использования организмом и таким образом быстро становятся недоступными для изучения.

Не все клетки гибнут одинаково. Известны несколько основных механизмов клеточной гибели, и, возможно, новые механизмы еще будут обнаружены.

Клеточная гибель подразделяется на программированную и патологическую. Программированная клеточная гибель происходит по сценарию, запланированному физиологией организма. Она представляет собой способ избавления от ненужных клеток таким образом, чтобы гибель одной определенной клетки не вызывала дополнительных осложнений для соседних клеток и различных воспалений окружающей ткани. Патологическая клеточная гибель, также называемая "некроз" происходит не запланировано, в результате повреждения. Некроз сопровождается воспалением, реакцией иммунной системы и обычно затрагивает сразу большое количество клеток, например целый орган.

Нарушения в протекании программированной клеточной гибели приводят к патологиям во внутриутробном развитии плода, к заболеваниям нервной и иммунной систем, а также к онкологическим заболеваниям.

Доказательства существования различных форм программированной клеточной смерти получены для всех основных царств живых организмов, причём как для многоклеточных, так и для одноклеточных. Неясным остается, почему одноклеточные организмы тоже подвергаются программированной клеточной смерти, так как у них это выглядит, как альтруизм, при котором отдельная бактерия жертвует своей жизнью ради каких-то целей всей колонии бактерий.

Механизмы программированной клеточной смерти у различных живых организмов протекают по-разному, хотя можно установить гомологии между отдельными стадиями этих процессов, по крайней мере, для различных типов животных.

Программированная клеточная гибель подразделяется на два типа: апоптоз и аутофагоцитоз. Из этих двух типов наиболее изучен апоптоз. Аутофагоцитоз был открыт всего несколько лет назад и большинство исследований по аутофагоцитозу проведено для чернобрюхой дрозофилы (плодовой мушки, drosophila melanogaster).

При апоптозе, клетка отделяется от окружающих ее клеток, затем она сжимается, происходит конденсация цитоплазмы, пикноз ядра. Далее, клетка распадается на несколько апоптотических телец, окруженных мембраной. Апоптотические тельца поглощаются фагоцитами. Внутри фагоцитов они перерабатываются лизосомной системой и распадаются на составляющие вещества для последующего использования организмом.

Эти морфологические стадии - отделение клетки от соседей, сжатие, конденсация, фрагментация, фагоцитоз и деградация - наблюдаются у всех многоклеточных (по крайней мере от нематод до млекопитающих). Одной из причин присутствия одних и тех же морфологических стадий между различными типами животных является то, что им соответствуют одни и те же молекулярные механизмы.

В отличии от апоптоза, при при патологической клеточной смерти (некрозе) происходят следующие морфологические изменения клетки. Вместо сжатия, клетка наоборот распухает, мембрана разрывается, цитоплазма и органеллы выходят наружу, что вызывает реакцию иммунной системы, приводящую к воспалениям.

Морфологические изменения клетки являются последней фазой процесса апоптоза, называемой деградационной (фаза экзекуции или деструкции). Этой фазе предшествуют две другие: сигнальная фаза и фаза детерминации. Во время сигнальной фазы происходит обработка сигналов, в результате которой делается выбор, будет ли клетка жить или погибнет. Во время фазы детерминации, включаются механизмы, безвозвратно начинающие гибель клетки. Все шаги в процессе апоптоза, такие как обработка апоптотических сигналов, включение или выключение тех или иных биохимических реакций, итд, осуществляются через взаимодействия различных белков между собой, а также белков с липидными мембранами клетки и митохондрии.

Среди белков, принимающих участие в апоптозе, можно выделить некоторые основные группы, объединяющие белки со схожими функциями, а именно группы сенсоров, хранителей, эффекторов, адапторов, каспаз. Необратимая фаза процесса апоптоза запускается эффекторами (effectors). В клетке, не подвергающейся апоптозу, эффекторы нейтрализуются хранителями (guardians). Хранители димеризуются с эффекторами чтобы блокировать их действия. Сенсоры (sensors) воспринимают и интегрируют различные апоптотические сигналы, переносимые сигнальными белками. Если количество этих сигналов превышает некое граничное значение, сенсоры либо непосредственно активируют эффекторы (прямая активация), либо нейтрализуют хранителей (гетеродимеризуясь с ними), таким образом освобождая эффекторы для необратимого запуска апоптоза (косвенная активация).

Освободившись от блокировки хранителей, эффекторы запускают механизмы, приводящие к образованию апоптосом - агрегатов, в которых происходит активация инициализирующих каспаз. Апоптосомы получаются путем олигомеризации белков-адапторов. Роль инициализирующих каспаз - активация эффекторных каспаз. Эффекторные каспазы разрушают различные клеточные структуры, в результате чего клетка переходит к завершающей стадии апоптоза, сжимается, ее цитоплазма конденсируется, наступает пикноз ядра, фрагментация ДНК, на внешней части мембраны появляются маркеры, которые распознаются макрофагами.

У млекопитающих сенсоры, хранители и эффекторы состоят из белков суперсемейства Bcl-2. Белки этого суперсемейства имеют схожие домены (гомологии), называемые BH (Bcl-2 homology). Многие из этих белков могут взаимодействовать друг с другом. Для большинства белков этого семейства характерно наличие гидрофобного хвоста, которым они могут взаимодействовать с липидными мембранами. Точные молекулярные механизмы взаимодействия белков суперсемейства Bcl-2 с липидными мембранами и друг с другом вблизи липидных мембран неизвестны, что является одним из наиболее важных, но до сих пор нерешенных вопросов в изучении апоптоза. Попытки исследования этих взаимодействий биохимическими методами натыкаются на технические сложности, поэтому компьютерное моделирование может оказать здесь существенную помощь.

В настоящее время известно восемь сенсоров в клетках млекопитающих. Это белки Bad, Bim, Bid, Bik, Hrk, Puma, Noxa, Bmf. Белки этой группы имеют одну гомологичную область BH3. Противоапоптотические хранители в клетках млекопитающих: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B, Bcl-2A1. Белки этой группы имеют четыре гомологичных области: BH1, BH2, BH3, BH4. Эффекторы клеток млекопитающих: Bax, Bak, Bok. Белки этой группы имеют три гомологичных области: BH1, BH2, BH3.

Доказано, что сенсоры выполняют две функции. Во-первых, они "подготавливают" эффекторы. В случае Bax это выражается в изменении структуры Bax, что приводит к выведению наружу его гидрофобного хвоста и передислокации его к наружной мембране митохондрии. Когда эффекторы приближаются к внешней мембране митохондрии, они там блокируются хранителями, например Bcl-2. В это время, задача сенсоров - опередить хранителей, гетеродимеризовться с ними так, чтобы эффекторы были свободны для запуска апоптоза. У млекопитающих (и в более общем случае, у позвоночных) известны два основных пути протекания апоптоза: митохондриальный и рецепторно-зависимый.

При митохондриальном пути, апоптотические стимулы приводят к активации сенсоров суперсемейства Bcl-2, что приводит к прямой или косвенной активации эффекторов Bax и Bak. Будучи активированными, Bax и Bak приводят к селективной проницаемости мембраны митохондрии с помощью до сих пор неизвестного механизма. Данная селективная проницаемость позволяет цитохрому c выходить из межмембранного пространства митохондрии в цитоплазму. Соединение цитохрома c в цитоплазме с мономерами Apaf-1 приводит к собиранию апоптосомы. Собранная апоптосома способствует активации инициализирующих каспаз, а именно каспаз 9. Когда каспазы 9 становятся активными, они активируют эффекторные каспазы, в данном случае каспазы 3. Активные каспазы 3 участвуют в процессах PS экстернализации, фрагментации ДНК итд, что приводит к морфологическим изменениям клетки, ее сжатию, поглощению макрофагами и деградации.

Рецепторно-зависимый путь апоптоза инициируется ФНО-альфа-подобными лигандами (TNFalpha-like ligands). Эти лиганды соединяются с рецепторами смерти на внешней мембране клетки, такими как рецепторы ФНО. Присоединение лигандов к рецепторам приводит к тому, что несколько таких рецепторов собираются вместе. Собравшиеся вместе рецепторы, взаимодействуют своими цитоплазменными доменами, и это взаимодействие приводит к образованию на внутренней мембране клетки комплекса под названием DISC (death-inducing signaling complex). Кроме цитоплазменных доменов рецепторов смерти, комплекс DISC содержит несколько молекул белка FADD. FADD может соединяться с цитоплазменными доменами рецепторов смерти с одной стороны, и с прокаспазами 8 с другой. После образования комплекса DISC, несколько молекул FADD могут присоединять несколько молекул прокаспазы 8, что делает возможным активацию прокаспазы 8. Будучи активированными, каспазы 8 расщепляют белки Bid, превращая их в tBid (truncated Bid). tBid запускает митохондриальный путь, блокируя хранителей, и активируя эффекторы. Кроме этого, каспаза 8 непосредственно активирует эффекторные каспазы 3.

Рецепторно-зависимый путь в основном встречается в клетках иммунной системы, но не только в них. Напротив, митохондриальный путь присутствует во всех типах клеток (включая клетки иммунной системы). Таким образом, митохондриальный путь является преобладающим.

Наличие в клетках млекопитающих такого разнообразия белков в каждой из групп суперсемейства Bcl-2 (сенсоров, хранителей и активаторов) объясняется тем, что разные белки в пределах одной группы имеют немного разные функции. Кроме того, экспрессия разных сенсоров, активаторов и эффекторов происходит по разному в разных клетках, тканях и органах, и по разному в разные периоды развития (внутриутробного периода, периода взросления и взрослой жизни). Еще такое разнообразие объясняется возможностями подстраховки: если один вид белков не сработает, его может заменить другой вид, что делает процесс более устойчивым. Однако такое разнообразие сенсоров, хранителей и активаторов и схожесть их функций затрудняет их изучение.

У более простых организмов, количество белков, участвующих в апоптозе меньше. Например, может присутствовать всего один сенсор, один хранитель и один эффектор. Поэтому много исследований апоптоза проводится для простых организмов, и потом для изученных явлений ищутся гомологии у млекопитающих. Среди более простых многоклеточных организмов, апоптоз лучше всего изучен у нематоды Caenorhabditis elegans (C.elegans) и у плодовых мушек (drosophila melanogaster).

Каждый гермафродит C. elegans состоит из 959 соматических клеток [6, 7, 8]. Ровно 131 из 1090 изначально сформировавшихся клеток погибает. 113 из этих 131 клеток погибают во время эмбрионного развития. Оставшиеся 18 погибают во время развития личинки. Характер клеточной смерти у C. elegans обладает высокой степенью инвариантности от особи к особи, что делает его полезным для генетических и биохимических исследований отдельных стадий апоптоза. При апоптозе, клетки C. elegans подвергаются тем же самым морфологическим изменениям, что и клетки млекопитающих. Они отстраняются от соседних клеток, затем сжимаются, их цитоплазма конденсируется, ядро становится пикнотическим, затем они поглощаются и подвергаются разложению соседними клетками. У C. elegans этот процесс происходит быстро, в течение 30-40 минут. Гибнущие клетки можно наблюдать в живых C. elegans используя ДИК микроскоп. Большая часть из 131 клеток, погибающих в период развития C. elegans, погибают апоптотически.

Сигнальная фаза C. elegans содержит белки ces-1 и ces-2. Фаза детерминации содержит egl-1, ced-9, ced-4, ced-3, причем их взаимодействие происходит именно в такой последовательности. Белки egl-1, ced-4, ced-3 проапоптотические, а ced-9 - антиапоптотический. Если egl-1 активен, то он инактивирует ced-9, таким образом ced-4 становится активным, и в свою очередь активирует ced-3, что безвозвратно приводит к апоптозу. Если же egl-1 неактивен, то активируется ced-9 и блокирует действие ced-4. В этом случае ced-3 тоже неактивен и апоптоз не происходит, клетка остается живой.

Суперсемейство Bcl-2 обладает гораздо меньшей избыточностью у C. elegans. Имеются всего два сенсора: egl-1 и ced-13, однако роль ced-13 в апоптозе до сих пор не выявлена. Далее, имеется только один хранитель, ced-9. Специальных белков-эффекторов у C. elegans нет, и роль эффектора выполняет опять же ced-9. Когда сенсор egl-1 активен, он гетеродимеризуется с ced-9, что во-первых нейтрализует противоапоптозное действие ced-9, а во-вторых превращает ced-9 в эффектор, который и запускает необратимый механизм апоптоза. Ced-3 является каспазой – ферментом, необратимо расщепляющим белки. Роль каспаз в апоптозе также сохраняется от нематод до млекопитающих. Было установлено, что экспрессия ced-3 в клетках млекопитающих также вызывает их апоптоз. Активность каспаз контролируется белками суперсемейства Bcl-2. Наряду с ced-3, в C. elegans имеются еще три дополнительных каспазы. Их роль в данное время исследуется. Пока еще не непонятно, имеют ли они общие функции с ced-3. На 2011 год было найдено 10 различных каспаз в клетках человека, и по крайней мере 7 из них принимают участие в процессе апоптоза. Гомологом ced-3 у млекопитающих является каспаза 3 (caspase-3). Как и ced-3, каспаза 3 вначале формируется в виде неактивной зимогены, или прокаспазы, а затем активируется при необратимом запуске апоптоза.

Существование гомологичных каспаз у совершенно разных живых организмов указывает на то, что сохранение молекулярных механизмов апоптоза у разных типов животных не ограничивается гомологиями белков суперсемейства Bcl-2. Гомологии существуют в гораздо более широких пределах. Активация каспаз в клетках млекопитающих начинается после выхода цитохрома c из митохондрии в цитоплазму. Цитохром c выполняет две совершенно разные функции в клеткe. С одной стороны, он участвует в процесе переноса электрона в митохондрии при конвертации энергии, потребляемой при питании в АТФ. С другой стороны, цитохром c необходим для активации каспазы 3, что необратимо приводит к апоптозу. То есть, с одной стороны, без цитохрома c клетка не могла бы жить, так как не могла бы получать митохондриальную АТФ - основную молекулу для сохранения и переноса энергии в клетке. С другой стороны, цитохром c убивает клетку, активируя каспазу 3. Цитохром c был первым белком, для которого обнаружено то, что кроме участия в апоптозе, он также выпоняет и другие функции. Как оказалось, это свойство является общим для ряда других белков, задействованных в молекулярных механизмах апоптоза [9, 10]. Более того, часть митихондриального пути апоптоза или даже весь путь целиком может использоваться в неапоптотических целях. Например, он может использоваться для программированного избавления от внутренностей клеток. Известны по крайней мере два типа клеток млекопитающих, которые программированно избавляются от собственных ядер и от большинства своих органелл. Это красные кровяные тельца и клетки волокн в веществе глазного хрусталика.

Цитохром c находится в межмембранном пространстве митохондрии, будучи слабо связанным с внутренней мембраной митохондрии. В ответ на апоптотические стимулы, клетки выпускают цитохром c из межмембранного пространства митохондрии в цитоплазму. Выход цитохрома c в цитоплазму является общим свойством апоптотических клеток, по крайней мере для позвоночных. Известно, что подвергаясь апоптотическим стимулам, клетки HeLa выпускают почти весь свой цитохром c из митохондрии в цитоплазму в течении 5 минут. Выход цитохрома c из митохондрии в цитоплазму может быть заблокирован действием Bcl-2. Попав в цитоплазму, цитохром c соединяется с белком-адаптором Apaf-1, гомологичным адаптору ced-4 у C. elegans. Это присоединение происходит при посредничестве доменов WD40, которые имеются в Apaf-1, но отсутствуют в ced-4 у C. elegans. Белки Apaf-1 у млекопитающих и ced-4 у C. elegans имеют важное сходство последовательности аминокислот, называемое CARD домен (caspase recruitment domain). CARD домен интересен тем, что белки, имеющие CARD домен, могут взаимодействовать друг с другом через свои CARD домены. Например, прокаспаза 9 и Apaf-1, а также про-ced-3 и ced-4 взаимодейтвуют через CARD домены.

Выход цитохрома c в цитоплазму и его присоединение к Apaf-1 приводит к формированию апоптосомы - белкового комплекса в виде колеса с семью спицами, форма которого была обнаружена с помощью крио-электронной микроскопии [11]. Апоптосома состоит из семи молекул Apaf-1, каждая из которых соединена с одной молекулой цитохрома c. Как только апоптосома сформировалась, потенциально до семи молекул прокаспазы 9 может присоединиться к апоптосоме через CARD-CARD взаимодействия с Apaf-1.Точно неизвестно, каким образом происходит активация прокаспазы 9. Предполагается, что присоединяясь к апоптосоме, прокаспазы 9 могут димеризоваться. Хотя, прокаспазы гораздо менее активны, чем каспазы, у них тем не менее присутствует небольшая протеолитическая активность. Этой небольшой протеолитической активности может быть достаточно для активации прокаспаз 9 если две молекулы прокаспазы 9 присоединяются к одной и той же апоптосоме и, димеризуясь друг с другом, оказываются на достаточно близком расстоянии друг от друга.

Таким образом, функция апоптосомы - собирать вместе молекулы прокаспазы 9 для их активации. Будучи активированными, каспазы 9 остаются ассоциированными с апоптосомой и активируют прокаспазы 3.

Вместо целого каскада каспаз у млекопитающих, у C. elegans присутствует всего одна каспаза ced-3. Белки C.elegans, гомологичные Apaf-1, а именно ced-4 собираются в апоптосому, которая также, как и у млекопитающих необходима для активации каспаз.