ИШЕМИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Структура церебро-васкулярных заболеваний.
Нейромедиаторы. Система возбуждающих аминокислот.
Роль оксида азота.
Регуляторные пептиды.
Нейротрофические и ростовые факторы. Интерлейкины.
Регуляция трансмембранных процессов при ишемии мозга.
Гормоны при ишемии мозга.
Ишемия неонатального мозга.
Интракраниальные геморрагии.
Нейропротекция и терапия ишемических заболеваний мозга.

1. СТРУКТУРА ЦЕРЕБРО-ВАСКУЛЯРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Заболевания сосудов головного мозга стоят на третьем месте в мире среди ведущих причин смерти, после заболеваний сердца и рака. В цивилизованных странах цереброваску- лярные патологии представляют основной комплекс нейрогенных нарушений, являющихся основой высокой заболеваемости и смертности. Принято считать, что термин «цереброваску- лярное заболевание» обозначает любое нарушение функций головного мозга, вызванное патологическим процессом в системе кровеносных сосудов; «инсульт» является клиническим определением, которое применяется к этим состояниям, особенно при остром начале симптомов.

Этиология цереброваскулярных заболеваний включает три основных причины: тромбозы, эмболии и кровотечения; патогенез и лечение пациентов существенно различаются в каждой группе.

С точки зрения патофизиологии и патологической анатомии цереброваскулярные заболевания рассматриваются как два процесса:

Гипоксия, ишемия и инфаркт мозга в результате расстройства церебральной циркуляции и нарушения обеспечения тканей кислородом.
Кровотечение, возникающее в результате разрыва сосудов мозга.

Около 80 % случаев мозгового инсульта связаны с общей или региональной ишемией мозга и только 20 % являются следствием интрацеллюлярной и субарахноидальной геморрагий, венозных тромбозов и других цереброваскулярных растройств. С физиологической и биохимической точки зрения мозг представляет собой наиболее активно перфузируемую кровью и метаболитами ткань. Адекватное кровообеспечение регионов мозга контролируется различными ауторегуляторными механизмами, среди которых – помимо миогенных и нейрогенных компонентов – системе химической регуляции принадлежит основное место. Соответственно, нарушение кровообеспечения структур мозга вносит серьезный дисбаланс в соотношение систем биорегуляторов и является источником патологических процессов, развивающихся на нейрональном и субклеточном уровнях. С этой точки зрения рассмотрение роли отдельных групп химических регуляторов мозга в условиях ишемических нейропатологий представляет попытку выяснения причинно-следственных отношений этих расстройств и определения средств нейропротекции и терапии.

Исторический обзор и изложение физиологических, биохимических, диагностических и терапевтических аспектов нарушений церебральной гемодинамики представили Heckmann et al. (2001).

При ограничении кровотока к какой-либо части головного мозга выживаемость тканей зависит от целого комплекса принципиальных обстоятельств: наличия коллатерального кровообращения, продолжительности ишемии, а также величины и скорости снижения кровотока. Эти факторы, в свою очередь, определяют точное анатомическое место и размер повреждения и, следовательно, параметры клинического дефицита. Распознаются следующие основные типы острого ишемического повреждения мозга.

Глобальная ишемия мозга (ишемическая/гипоксическая энцефалопатия) возникает как следствие генерализованного снижения перфузии головного мозга, например, при остановке сердца, шоке и гипотензии тяжёлой степени.
Местная ишемия мозга развивается вследствие ограничения или прекращения кровоснабжения локальной области головного мозга в результате поражения крупных сосудов (эмболическая или тромботическая закупорка артерий) или заболевания малых сосудов (васкулит).

Существует иерархия клеток ЦНС, которые проявляют селективную восприимчивость («предпочтительную чувствительность») к ишемии. Нейроны являются наиболее уязвимыми клетками мозга, хотя глиальные клетки (олигодендроциты и астроциты) также оказываются весьма реактивными к повреждающему воздействию. Активация глиальных клеток, как правило, сопровождает патогенез ишемии мозга. Существенное значение имеет большая вариабельность

чувствительности отдельных популяций нейронов в различных регионах ЦНС, которая зависит от особенностей регионарного кровотока мозга, метаболических потребностей клеток мозга и их нейрохимической специализации.

При глобальной ишемии мозга возникает его обширный инфаркт независимо от региональной подверженности. Однако и здесь отмеченная выше вариабельность биохимической чувствительности популяций нейронов играет существенную роль в определении тяжести и последствий патологического процесса. Пациенты, выжившие при таком состоянии, часто остаются в серьёзно неврологически нарушенном и стойком коматозном вегетативном состоянии. У части больных поражения соответствуют клиническим критериям «смерти мозга», включащих наличие устойчивого диффузного кортикального поражения, а также повреждение ствола мозга. У пациентов с такой глубокой формой повреждения в головном мозге постепенно развивается аутолитический процесс, приводящий к дезинтеграции мягких тканей.

При очаговой ишемии мозга, возникающей как следствие церебральной артериальной окклюзии, нарушение местного кровоснабжения может привести к инфаркту отдельного региона нейрональной ткани. Площадь и функциональная специфичность повреждённого мозга определяет, остаётся ли пациент бессимптомным или у него со временем разовьются признаки прогрессирующей недостаточности. В этих случаях исход оказывается фатальным или – в благоприятных случаях - характеризуется медленным улучшением в течение месяцев.

Окклюзивное сосудистое заболевание тяжёлой степени, достаточной для того, чтобы привести к инфаркту мозга, может возникать вследствие тромбоза in situ или эмболизации. Большинство тромботических окклюзий возникает вследствие атеросклероза; наиболее распространёнными местами поражения оказываются: разветвление сонной артерии, отхождение средней церебральной артерии и дистальный регион базиллярных артерий. Развитие артериального стеноза варьирует от прогрессирующего сужения просвета и тромбоза, что может сопровождаться антероградным расширением, до фрагментации и дистальной эмболизации. Как правило, ведущей причиной окклюзивного цереброваскулярного заболевания служит наличие таких системных патологий как гипертония и диабет.

Большое число экспериментальных исследований позволяет с достаточной точностью проследить этапные биохимические сдвиги, возникающие при нарушении церебральной гемодинамики и ишемии мозга. При ишемии мозга и реперфузии возникает целый каскад множественных биохимических процессов, включающих нарушение мембранной целостности и ионного транспорта, прогрессирующего протеолиза, расстройства функционально необходимого взаимодействия нейромедиаторов и других систем химических регуляторов, индукция апоптических процессов, ведущих к гибели популяций нервных клеток.

Первично ишемия приводит к быстрой потере макроэргических фосфатов и общей деполяризации клетки, которая способствует эксцессивному рилизингу глутамата, и в уязвимых нейронах - к открытию регулируемых глутаматом кальциевых каналов. Как следствие резкого увеличения Са++ в цитозоле активируются калпаин, кальцинейрин и фосфолипазы. Важной частью этих начальных деструктивных процессов служит активация NO-синтазы, аккумуляция свободной арахидоновой кислоты и исход Са++ из эндоплазматического ретикулума. Нарушение нормальной

энергопродукции клеток и активация пероксинитритов стимулирует возникновение «агрессивных форм» кислорода. Высокий уровень катехоламинов, сопровождающий, как правило, ишемический приступ ведет к блокаде активности рецепторов тирозинкиназ, ассоциирующихся с нейротрофическими ростовыми факторами, и к подавлению сигнально-трансдукторных реакций нейронов. Активация каспаз, главных факторов апоптоза, возникающая в первые часы реперфузии, связана с нарушением целостности митохондрий и высвобождением из них каспазы-9 и цитохрома С.

Таким образом, цепь процессов, составляющих нарушение нормального энергетического метаболизма клетки и ионного транспорта (Са++, в первую очередь), нарушение синтеза структурных цитоскелетных и функциональных белков и, наоборот, активация деструктивного протеолиза (калпаин, каспазы), дезорганизация экспрессии и функций сигнальных и трансдукторных факторов составляют сложную картину патохимических расстройств мозга, обусловленных его ишемий и

реперфузией.

Представленная в общем виде картина свидетельствует о том, что распространенная некогда концепция монотерапевтического вмешательства в глобальный разлад вызванных ишемией и реперфузией процессов в мозге оказывается несостоятельной. По мнению White et al. (2000), мультитерапевтический подход, учитывающий поливалидность и стадийность ишемических расстройств мозга, должен включать:

нейротрофическую коррекцию ростовыми факторами, необходимыми для раннего поддержания биохимических сигнальных и трансляционных процессов в нервной клетке;
торможение образования продуктов перекисного окисления липидов;
торможение активности калпаинов, ферментов протеолиза;
торможение экспрессии и активности каспаз, ферментов апоптоза.

2. НЕЙРОМЕДИАТОРЫ. СИСТЕМА ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ

Согласно современным воззрениям глутамат расценивается как медиатор, обеспечивающий множественный ответ нейрона на разнообразные физиологические и биохимические стимулы. В основе вариабельности реакций нейрона на стимулы одного и того же порядка лежит различная специфичность рецепторов глутамата. Следует говорить о целой системе глутаматных рецепторов, их изотипов, которые в качестве основной реакции опосредуют деполяризацию мембраны синапса, т.е. формирование потенциала действия (инотропные рецепторы, iGluR) или регуляцию величины и длительности потенциала (mGluR). Инотропные Glu-рецепторы, к которым относятся NMDA рецепторы, каинатные рецепторы и

АМРА-рецепторы, опосредуют движение Na+/Ca++/K+- токов через мембрану синапса; метаботропные

Glu-рецепторы, среди которых идентифицировано по крайней мере восемь форм, связаны с активацией G-белков сигнального каскада в мембране нейрона.

Для глутаматных рецепторов характерно многоплановое взаимодействие, а также функциональная сопряженность с другими медиаторными системами мозга. Будучи основными

возбуждающими рецепторами, они вовлечены в интегративную деятельность мозга. Аппликация веществ, блокирующих глутаматергическую передачу, приводит к нарушениям сенсорной и моторной функций. Особенно значима роль глутаматной системы мозга в обеспечении высших физиологических функций, в частности, когнитивных процессов; соответствущие нейрональные структуры оказываются наиболее уязвимымыми при ишемических, стрессорных и нейродегенеративных повреждениях мозга.

Современные представления о системе глутаматных рецепторов изложены в обзорах Болдырева (2000), Гранстрем и Дамбиновой (2001); Мошаровой (2001); Kelly, Stanley (2001).

Изменение внеклеточной концентрации глутамата, провоцируемой аноксической деполяризацией мембран нейрона, является исходным моментом патогенеза церебральной ишемии. Установлена двухфазность рилизинга глутамата; начальный пик выброса медиатора во внеклеточное пространство связан с предшествующим увеличением Са++ и деполяризацией мембраны (Asai et al, 2000). Рилизинг глутамата вызывается также увеличением эндогенного

содержания DOPA, провоцируемого, кратковременной ишемией в эксперименте (Furukawa et al, 2001).

Конкретизация роли глутаматных рецепторов при ишемии мозга показывает, что метаботропные рецепторы (mGluR1 и mGluR5) вовлечены в ход реакций, приводящих к образованию арахидоновой кислоты. Аппликация антагонистов этих рецепторов защищает клетки переднего мозга от гибели в условиях кратковременной ишемии (Rao et al, 2000). Nava-Ocampo et al. (2000) обсуждают проблему ингибирования пресинаптического высвобождения глутамата в качестве основного нейропротекторного подхода в клинике ишемических расстройств. Поскольку агонист 1(А) рецептора серотонина, препарат BAYx3702, вдвое снижает рилизинг глутамата, вызываемый кратковременной окклюзией мозговых сосудов, постулируется связь серотонин- ергических и глутаматергических структур в контроле процессов, препятствующих развитию ишемии (Mauler et al, 2001).

Помимо глутамата, в начальный период церебральной ишемии важную роль играет тормозный медиатор ГАМК, который выполняет протективную функцию. Исследование соотношения глутамат/ГАМК in vivo (метод микродиализа) в центральном ядре и в периферической зоне мозга мышей, подвергнутого фокальной ишемии, показало, что нарушение этого соотношения в первые 30 минут в пользу глутамата является триггерным механизмом повреждения центральной коры (Wang et al, 2001). Соотношение возбуждающих и тормозных медиаторов, исследованное в спинно-мозговой жидкости 110 пациентов с полушарным ишемическим инсультом показало, что значительное увеличение уровня глутамата и аспартата в первые 6 часов служит критерием тяжести заболевания. Неблагоприятный прогноз связывается с показателями низкого уровня ГАМК в первые несколько дней инсульта и прогрессирующим увеличением аспартата, несмотря на нормализующееся в этот период содержание глутамата (Skvortsova et al, 2000). В обзоре Green et al, (2001) постулируется возможное использование агонистов ГАМК, ГАМК-миметиков или веществ, блокирующих обратный захват медиатора (CI- 966), в качестве нейропротекторов при ишемическом инсульте. При этом обращается

внимание на многообразие подтипов рецепторов ГАМК, которым могли бы специфически соответствовать выбранные фармакологические соединения.

При ишемии мозга увеличивается также уровень экстраклеточного аденозина. Функциональная связь ГАМК-ергической и аденозиновой систем играет важную роль в обеспечении постсинаптической нейротрансмиссии (Centonze et al, 2001). В условиях экспериментальной ишемии аденозин, очевидно, подавляет функцию ГАМК, включаясь в цепь процессов, ведущих к экспрессии возбуждающих аминокислот (глутамата). В глиальных клетках ишемическая аккумуляция аденозина может иметь как цитотоксическое, так и цитопротекторное следствия. Это немаловажное наблюдение (Imuta, Shimohata, 2000) свидельствует о клеточно- тканевой специфичности («химизме») различных популяций нейрональных структур, с которыми ассоциируется их чувстви-тельность в условиях повреждения. Важная роль рецепторов аденозина при церебральной ишемии анализируется Pedata et al. (2001). В экспериментальных исследованиях установлено значение агонистов А(1) и А(2) рецепторов аденозина (Кулинский и др. 2001) и ингибитора «аденозинового транспортера» нитробензилтиоинозина (Parkinson et al, 2000) в качестве потенциальных нейропротекторных средств.

В экспериментальном исследовании Bogaert et al. (2000) изучался рилизинг из стриатума крысы глутамата, ГАМК и допамина в условиях кратковременной ишемии, которая вызывалась введением эндотелина-1, сильного вазоконстрикторного пептида. Уровень перечисленных медиаторов увеличивался в сотни раз. На основании анализа данных авторы делают вывод о том, что резкое увеличение внеклеточного допамина является в большей мере, чем рилизинг глутамата, триггерным фактором развития каскадных явлений, ведущих к неврологическому дефициту. Нарушение транспорта допамина и снижение связывающей функции D(2) рецепторов обнаружены в синаптосомах крыс при глобальной ишемии мозга, вызванной остановкой сердца. И хотя в последующий реанимационный период содержание допамина быстро восстанавливается, его функция остается «неполноценной», ввиду сниженной аффинности допаминового рецептора (Rafalowska et al, 2000).

3. РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА

Оксид азота (NO) является высоко реактивной сигнальной молекулой с широким спектром функций, представленных в большинстве тканей. NO выполняет роль посредника, универсального модулятора большого числа физиологических процессов и в структурах нервной системы участвует в регуляции интернейрональной коммуникации, синаптической пластичности, рилизинга медиаторов и ростовых факторов, активности (экспрессии) рецепторов и специальных молекул межклеточной сигнализации (см. обзор: Раевский и др. 2000). В мозге NO образуется в процессе

реакции окисления L-аргинина при участии Са++ - зависимых изоформ NO-синтазы. Немалое число

публикаций свидетельствует об участии NO-синтаз в ишемической патологии мозга.

NO-синтаза-I (NOS-I) содержится в 2% кортикальных нейронов. Эти клетки, как правило, также включают ГАМК, соматостатин и нейропептид Y. Кроме того, они активно экспрессируют

глутаматные рецепторы, опосредующие, как было отмечено выше, гипервозбуждение нейронов вследствие церебральной ишемии. Исследование соседних, неповрежденных, кортикальных нейронов выявило, что их резистентность к ишемии (модель фокального фототромбоза) связана с активностью NOS-I и антиапоптической защитой за счет белка Bcl-2 (Bidmon et al, 2001). На модели ишемического повреждения, вызываемого перевязкой средней мозговой артерии у спонтанно-гипертензивных крыс, было установлено, что синтез NO обратно зависимо коррелирует с образованием «агрессивного» кислорода (О2 ). Зависимость четко прослеживается при сравнении показателей ишемии и реперфузии; эти данные свидетельствуют о протективной роли NO: дефицит его образования в нейрональной ткани зависит от интенсивного образования молекул О2 , запускающего каскад апоптических реакций (Dobrucki et al, 2000). Однако по данным Sasaki et al. (2001) ингибирование нейрональной NOS (локальное введение L-NAME) и, соответственно, снижение уровня оксида азота в пирамидальных нейронах гиппокампа, наоборот, нивелируют выраженность ишемических повреждений. Сравнение образования NO в стриатуме крыс в острой и подострой фазах фокальной церебральной ишемии (соответственно, 24 и 48 часов) не выявило существенно увеличенного содержания NO в начальный период; очевидно, зависимое от индуцибельной NO-синтазы образование больших количеств этой субстанции играет свою роль на более поздних стадиях нейродегенеративного процесса (Fassbender et al, 2000).

Следует принять во внимание значение различных – нейрональной, индуцибельной и эндотелиальной форм фермента в ишемизированном мозге. С помощью селективного ингибитора нейрональной NOS 7-нитроиндазола было установлено, что опосредуемое этим ферментом активное образование NO было выражено лишь в первые 5 минут ишемического повреждения стриатума; синтез NO на поздних стадиях ишемии блокировался неселективным ингибитором L- NAME (Adachi et al, 2000). Доказательства улучшения состояния ишемизированного мозга при использовании L-NAME были продемонстрированы также Self-l-Nasr, Fahim (2001) на модели генерализованной церебральной ишемии крыс. Рассмотрение соотношения NO и эндотелина-1 при 10-минутной билатеральной окклюзии сонных артерий установило их сопряженные изменения в микроглии и в астроцитах подверженных поражению клеток гиппокампа. Повреждения, затрагивающие поле СА1, наблюдались через 4 недели после операции (Yamashita et al, 2000).

Большой массив экспериментальных исследований предваряет исследование роли оксида азота в клинике ишемического инсульта. В работе на 102 пациентах, анализируемых в системе Canadian Stroke Scale, у которых определялся уровень NO в спинномозговой жидкости, выявлено в среднем большее содержание вещества по сравнению с контрольными испытуемыми. У половины пациентов с ранними проявлениями неврологических расстройств уровень NO был вдвое выше, чем у инсультных больных со стабильным состоянием. Таким образом, значительное увеличение содержания NO (> 5 микромолей/мл) достоверно коррелирует с проявлениями ранних неврологических нарушений, независимо от других важных показателей ишемического инсульта, такого, например, как уровень глутамата в спинномозговой жидкости (Castillo et al, 2000).

В целом, данные этого раздела позволяют сделать ряд заключений:

Синтез NO в ишемизированных структурах мозга является важным фактором, включенным в регуляцию отсроченной гибели клеток. Его образование в ранний период ишемического повреждения препятствует запуску апоптических процессов программируемой гибели нейронов.
Синтез NO, зависимый от определенной изоформы синтазы, вносит различный вклад в развитие постишемических процессов в конкретном регионе мозга, подвергнутого повреждению.
Клинический анализ свидетельствует, что увеличенный уровень NO в спинномозговой жидкости пациентов с ишемическим инсультом ассоциируется с более выраженными нарушениями мозга и более ранними проявлениями неврологической недостаточности.
В экспериментальных исследованиях показана возможность коррекции изменений уровня NO с помощью ингибиторов NO-синтазы.

4. РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ

Поскольку присутствующие в мозге физиологически активные пептиды играют большую роль в разнообразных видах регуляции функций ЦНС, представляет интерес анализ их участия в патологии ишемических расстройств мозга.

Ренин-ангиотензиновая система, причастна не только к периферической регуляции уровня артериального давления, но и модулирует церебральный кровоток. Роль ангиотензина II, его АТ(1) рецепторов была исследована у спонтанно-гипертензивных крыс на модели ишемии, вызываемой окклюзией средней церебра-льной артерии с последующей реперфузией. Уровень церебральной гемодинамики исследовался лазерной Допплеровской флоуметрией. Применение кандесартана, антагониста АТ(1) рецепторов, используемое в режиме 14-дневной профилактики, предотвращало изменения кровотока в приграничном кортикальному инфаркту регионе мозга и значительно снижало зону ишемического поражения. Существенно уменьшался отек мозга, выявляемый через 2 часа после реперфузии. Таким образом, используемая в экспериментальной ишемии мозга блокада рецепторов ангиотензина II приводила к нормализации церебральной гемодинамики (Nishimura et al, 2000). Изящные эксперименты, выполненные Walther et al. (2002) на трансгенных мышах с выключенными АТ(1) рецепторами, показали, что вызываемая окклюзией средней мозговой артерии ишемия выражена в значительно меньшей степени. Результаты, таким образом, демонстрируют прямую корреляцию между активностью ангиотензина II в мозге и тяжестью ишемического нарушения при экспериментальном инсульте, а также возможность влиять на эту патологию с помощью блокаторов рецепторов АТ(1).

Ангиотензин-превращающему ферменту (АПФ), основному фактору образования ангиотензина-II во всех тканях, придается преимущественное значение как регулятору кардио- васкулярных процессов в норме и при патологии. В клинических исследованиях выявлена связь между генотипом АПФ и вероятностью развития ишемического инсульта у «негипертензивных» пациентов (Моляка и др, 1998; Farrer et al, 2000).

Экспериментальные данные свидетельствуют также о патогенетической роли нейропетида

Y при церебральной ишемии, вызываемой окклюзией средней мозговой артерии. Предшествующая

информация указывает на увеличение содержания этого нейропептида в поврежденной зоне коры мозга. Интракаротидная или интра-цистернальная инъекция нейропептида Y в начальный период окклюзионной ишемии или в период реперфузии значительно ухудшали течение и исход церебральной ишемии (Chen, Cheung, 2002).

Опиоидный пептид ноцицептин (орфанин FQ), очевидно, также причастен к ухудшению патологических явлений при экспериментальной ишемии мозга. При глобальной ишемии, вызываемой повышением внутричерепного давления с последующей реперфузией, отмечалось увеличение уровня этого пептида с 67 до 266 пкг/мл. Антагонист рецепторов орфанина тормозил рилизинг и вазодилататорные эффекты глутамата и NMDA и препятствовал патологическим проявлениям (Amstead, 2000). Блокада рецепторов ноцицептина/орфанина также препятствовала рилизингу глутамата, вызываемого ишемическими стимулами в срезах коры мозга (Nelson et al, 2000). Блокаторы опиоидных рецепторов (налоксон и др.) существенно ограничивали размеры кортикального инфаркта (Chen, Cheng et al, 2000).

В исследовании Reglodi et al. (2000) на модели окклюзии средней церебральной артерии был выявлен нейропротективный эффект Полипептида, активирующего аденилатциклазу гипофиза (PACAP); в дополнение к этой информации следует указать на работу Shin et al. (2001), которые, также постулируя нейропротекторную функцию РАСАР, обнаружили изменения уровня пептида, вызванные кратковременной ишемией. Иммунореактивность РАСАР была существенно сниженной в пирамидных клетках особенно чувствительных к повреждению полей С1 и в клетках Пуркинье; не было выявлено изменений в пирамидных клетках более резистентных полей С3.

Роль группы тахикининовых пептидов (вещества Р, нейрокинина В и группы рецепторов - NK1, NK2, NK3) была рассмотрена на модели фокальной церебральной ишемии крыс. Окклюзия средней мозговой артерии приводила к значительной экспрессии вещества Р и NK1 в популяции глутаматергических пирамидных клеток; увеличенная экспрессия мРНК, кодирующей препротахикинин В, наблюдалась между 2-м и 7-м днями после ишемии в ГАМК-ергических нейронах. Ишемия вызывала также кратковременную экспрессию рецепторов NK1 в церебровентрикулярном эндотелии в зоне, пограничной инфаркту. Индукция этих рецепторов может влиять на развивающийся отек ткани и диапедез лейкоцитов. Таким образом, тахикининовые рецепторы могут рассматриваться в качестве конкретной мишени терапии ишемического инсульта (Stumm et al, 2001).

Данная публикация в какой-то мере служит моделью понимания роли нейропептидов в ишемической патологии мозга: не будучи ведущим участником патогенеза, как глутамат или ГАМК, экспрессируемые в адекватных нейронах пептиды, в добавление к своей ведущей физиологической роли, участвуют в эндогенной нейропротекции, повышая ингибирующий потенциал ГАМК, или, наоборот, облегчают провоцируемую глутаматом нейротоксичность.

В последние годы все больший интерес приобретает исследование эндотелиновых пептидов. Помимо регуляции процессов, связанных с функцией сосудистого эндотелия, эта группа веществ оказывается причастной к регуляции тонуса церебральных сосудов и ответственна за возникновение ишемических расстройств мозга. В опытах на крысах продемонстрировано участие эндотелина-1 в контроле констрикторных реакций средней артерии

мозга при экспериментальном ишемическом инсульте (Фадюкова и др., 1998). Сильная вазоконстрикторная активность эндотелина-1 использована для воспроизведения модели церебро-васкулярной ишемии (Ostrowski, 2000).

Интересные данные получены при изучении мелатонина. Он рассматривается как нейропротективный агент, нейтрализатор свободных радикалов, которые как продукты окисления липидов участвуют в инициации деструктивных процессов в ишемизированной клетке. В исследованиях на кошках с использованием неврологического и гистологического контролей изучались эффекты внутривенной инъекции мелатонина на фоне церебральной ишемии. Ишемия вызывала тяжелые нарушения структуры полей гиппокампа СА1-СА4, которые, однако, были выражены значительно меньше у животных, получавших мелатонин. Неврологический дефицит, контролируемый в течение недели эксперимента, оказался ниже в 2-3 раза в начальной фазе ишемии и сводился практически к нулевому значению на 7-й день (Letechipia-Vallejo et al, 2001).

Влияние мелатонина на изменения уровня свободных радикалов и образующегося из NO пероксинитрита, а также на активность миелопероксидазы было изучено на монгольских хомячках, подверженных церебральной ишемии. Инфузия мелатонина приводила к снижению постишемического отека мозга и cдерживанию роста малондиальдегида и активности миелопероксидазы в гиппокампе. Гистологический анализ выявил меньшее повреждение нейронов у животных, получавших мелатонин (Sarro & Caputi, 2000). Нейропротекторный эффект мелатонина был подтвержден также на глиальных клетках мозга крыс, подвергнутого окклюзионной ишемии. Инъекция мелатонина (26 мкМ/крыса) за 1 час до окклюзионной ишемии улучшала показатели локомоторного дефицита и состояние глиальных клеток, тестируемых по специфическому маркеру и кислому фибриллярному белку. Детекция с помощью иммуноглобулин- G/гематоксилин-эозинового окрашивания свидетельствовала о лучшем сохранении клеток. В экспериментах in vitro на культуре астроцитов, обработанных нитропруссидом натрия и 3- нитропропионатом, образующими свободнорадикальные токсины, мелатонин (100 мкМ) препятствовал гибели астроцитов. Принципиальным в данном случае оказывается вывод авторов о возможности альтернативного подхода к защите ишемизированного мозга воздействием на его глиальные структуры (Borlongan et al, 2000).

Информация последних лет уделяет большое внимание полифункциональному белку эритропоэтину. Имеются данные о его протективной роли при экспериментальной ишемии мозга и обусловленной глутаматом нейрональной смерти. Введение реком-бинантного человеческого эритропоэтина монгольским хомячкам снижало неврологические показатели после окклюзионной ишемии мозга. Препарат уменьшал гибель нейронов в СА1 зоне гиппокампа (эффект сохранялся в течение 7 дней наблюдения) и препятствовал образованию нитратов и нитритов (индекс NO) в гиппокампе. Очевидно, протективный эффект эритропоэтина связан с торможением активного синтеза NO при церебральной ишемии (Calapai et al, 2000). Эти данные не согласуются с результатами работы Wiesner et al. (2001), которые на трансгенных мышах с гиперпродукцией эритропоэтина обнаружили, наоборот, ухудшение показателей после кратковременной окклюзии церебральной артерии. Авторы связывают этот факт со значительным увеличением гематокрита у животных с генетически обусловленной гиперпродукцией белка.

Исследования с другим рекомбинантным белком – активатором плазминогена (rtPA) – выявили сниженную реактивность церебральных артерий (тестируемую по ацетилхолину и серотонину) после 2-х часовой очаговой ишемии мозга крыс (Cipolla et al, 2000). Постишемические изменения реактивности мозговых сосудов, обусловленные реперфузионным повреждением и/или активацией системы плазмина, могут оказаться существенными при повторных ишемических атаках в условиях клиники.

5. НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЕ И РОСТОВЫЕ ФАКТОРЫ МОЗГА. ЦИТОКИНЫ.

Нейротрофические и ростовые факторы. Логично начать этот раздел с изложения данных, посвященных группе сосудистых эндотелиальных ростовых факторов (VEGF). Ряд данных свидетельствует о том, что основная функция этих биорегуляторов связана с селективным воздействием на сосудистый эндотелий и периваскулярные клетки. Исследования, выполненные с мутантными мышами и полученными рекомбинантным способом белками, подтвердили, что VEGF не только опосредует пролиферацию эндотелиальных клеток, но также регулирует сосудистую дифференцировку, регрессию и проницаемость. При острой церебральной ишемии в микрососудах мозга нарушается проницаемость и стабильная функция гемато-энцефалического барьера. Через несколько дней после ишемического инсульта выявляются пролиферативные явления в эндотелиальных клетках, стимулируется ангиогенез. Исследования подтверждают ключевую роль VEGF в этих процессах, которая реализуется комплексным и согласованным действием. При этом каждый из компонентов семейства VEGF обнаруживает при церебральной ишемии свою уникальную функцию как в начальный период сосудистой дестабилизации, так и на последующих этапах ангиогенеза. Эти обобщения, а также информация о роли VEGF в регуляции гемато-энцефалического барьера при ишемии мозга представлены в обзорах Croll et al. (2001); Zhang, Chopp (2002).

Терапевтическое использование рекомбинантных препаратов VEGF направлено на стимуляцию коллатеральной микроциркуляции и, соответственно, церебральной реваскуляризации. Инфузия rVEGF(165) в латеральный желудочек мозга крыс в течение 7 дней увеличивала плотность микрососудов при минимальном проявлении отечных признаков; явления вентрикуломегалии также отсутствовали (Harrigan et al, 2002). Исследование соотношения VEGF и NO-синтаз при церебральной ишемии, вызванной артериальной окклюзией у крыс, выявило, что экспрессия VEGF была выражена в течение 7 дней в цитоплазме и в мембране краевой повреждению зоне вместе с активированной eNOS. Экспрессия нейрональной синтазы (nNOS), имевшая пик через 24-48 часов, исчезала на 3-и сутки (Leker et al, 2001).

Нейротрофический фактор мозга (BDNF) широко представлен в структурах ЦНС. Его мРНК идентифицирована в гиппокампе, амигдале, таламусе, пирамидных клетках неокортекса и в мозжечке. BDNF контролирует баланс глутаматергической и ГАМК-ергической систем.

Изменения уровня BDNF в различных частях переднего мозга после окклюзии средней артерии показали значительные вариации. Содержание фактора в гиппокампе и фронтальной коре

ишемизированной стороны мозга было выше в сравнении с контралатеральной областью (Zhao et al, 2001). Определение уровня BDNF мРНК при умеренной (олигомической) ишемии мозга в отсутствие очевидных признаков нейронального нарушения показало его значительную (более 80%) экспрессию в гранулярных клетках гиппокампа уже через 6 часов окклюзии. Сниженный на 70% церебральный кровоток сохранялся таковым в течение целой недели. В последующие 1-14 суток уровень BDNF мРНК оставался на контрольном уровне (Schmidt-Kastner et al, 2001).

Эти данные указывают на вероятное участие BDNF в ишемической патологии мозга, однако его конкретизация и специфичность остаются неизученными. Нейропротективное действие BDNF было выявлено с помощью конъюгированной формы BDNF с моноклональными антителами рецептора трансферрина. В этой форме BDNF, введенный внутривенно, проникал через ГЭБ и оказывал защитное действие на ишемизированный мозг крысы. Эффект выражался в существенном (до 70%) снижении объема кортикального инсульта при наблюдении от 24 часов до 7 суток. Эти позитивные явления не относились к субкортикальным клеткам ишемизированного мозга (Zhang & Pardridge, 2001).

Структурный «родственник» BDNF – нейротрофин-3 (NT-3), на три четверти совпадающий с ним по структуре, а также с Фактором роста нервов (NGF), имеет отношение к развитию мозга, участвует в регуляции функций допамин- и адренергических структур мезэнцефалона и участвует в репарации поврежденных нервных клеток. 10-минутная ишемия переднего мозга вызывала снижение уровня NT-3 мРНК в гиппокампе. Кислородная гипербарическая терапия приводила не только к снижению ишемических нарушений структур мозга, но и к увеличению уровня NT-3 мРНК (Yang, Chang, Lee et al, 2001).

Получены также данные противоположного значения. У мутантных мышей с генетически обусловленным дефицитом нейротрофина-3 (однако сохранявших способность к экспрессии BDNF, рецептора NT-3, тирозинкиназы C и низкоаффинного рецептора нейротрофина p75NTR), окклюзионная ишемия вызывала значительно меньшие поражения структур мозга (данные через 23 часа). Добавление NT-3 к первичной культуре клеток коры, подверженных кислородно/глюкозной депривации, усиливало признаки нейрональной смерти и образование свободных радикалов. Вероятно, потенцирующее ишемию действие NT-3 связано с его включением в каскад апоптических реакций (Bates et al, 2002).

Инсулиноподобные ростовые факторы (IGF’s) имеют широкое представительство и разнообразный спектр контролируемых процессов в организме. Ряд данных свидетельствует о протективном действии IGF-I при церебральной ишемии. Интрацистернальное, интраназальное введение препарата или локальная аппликация приводили к существенному уменьшению ишемических повреждений мозга крыс, вызываемых окклюзией церебральной артерии (Liu et al, 2001; Schabitz et al, 2001). Эффект наблюдался в первые сутки после предварительного введения IGF-I. Иммуногистохимическое исследование подтвердило, что терапия Фактором снижала также содержание каспазы-3 в поврежденной зоне, но не влияла на уровень белка теплового шока 72-

kDa (Wang et al, 2001). Поскольку IGF-I плохо проходит через гемато-энцефалический барьер, рекомендовано его применение в виде интраназальной апликации, более удобной для клинической терапии ишемического инсульта (Liu et al, 2001).

Трансформирующий ростовой фактор (TGF-alpha) имеет также широкое распространение в тканях организма. В структурах ЦНС идентифицирована TGF-alpha мРНК на всех стадиях развития мозга. Исследования на бабуинах показали, что кратковременная ишемия (окклюзия церебральной артерии) приводила к экспрессии TGF-alpha мРНК в тех регионах мозга, где отмечалось снижение кислородного метаболизма. Гистологические исследования подтвердили, что наибольшая экспрессия TGF-alpha отмечена в зоне, пограничной инфаркту, и соответствует индексу сохраненных зон мозга. В этой связи авторами формулируется вопрос о TGF-alpha как “эндогенном маркере неврологического стресса” (Ali et al, 2001).

Внутрижелудочковое введение TGF-alpha крысам, подверженным окклюзионной ишемии мозга, значительно снижало поражения структур, которые более выражены в коре, нежели в стриатуме. В равной степени эффективной была аппликация TGF-alpha как до, так и через 30 минут после воспроизведения ишемической процедуры, и протективный эффект сохранялся до 4-х суток наблюдения. Существенно, что, в отличие от ранее описываемого сосудистого эндотелиального фактора (VEGF), TGF-alpha не влиял на микроциркуляцию сосудов коры и тонусную реактивность артерий мозга (Justicia et al, 2001). В другом исследовании (Zhu, Culmsee et al, 2001) введение крысам кленбутерола, агониста бета(2)-адренорецепторов, на фоне цереброваскулярной ишемии приводило к экспрессии TGF-beta1 в СА1 пирамидных нейронах. Увеличение уровня TGF-beta1, начинавшееся к 3-му часу ишемии, сохранялось в течение 2 суток.

В большом семействе факторов роста фибробластов (FGF), насчитывающем более 20 разновидностей, наиболее изученными представляются основной (basic) FGF и FGF-alpha. Оба фактора выполняют важные функции в нейрональных структурах (гипо-таламус, сетчатка глаз и др.), в секретирующих органах (гипофиз, тимус, кора надпочечников), обладают хемотаксической активностью и стимулируют рост новых капилляров in vivo и in vitro. bFGF приписывается важная роль в репарации нервных клеток после травмы мозга. В экспериментах на культуре клеток РС12 было установлено, что механизм нейропротективной активности bFGF связан с экспрессией трансдукторного фактора Ras-фосфатидилинозитол 3-киназы, максимально выраженной в первые сутки (Kawamata et al, 2001). Окклюзионная ишемия мышей приводила к инфаркту мозга, неврологическому дефициту, а также к быстрой экспрессии активности каспазы-3 в ишемизированной области. Icv введение bFGF (>10 нг, в течение 30 минут после окклюзии), помимо улучшения показателей ишемического повреждения мозга, снижало потенцированую ишемией активацию каспазы-3. Совместное введение подпороговых концентраций bFGF и ингибиторов каспаз (z-VAD.FMK или z-DEVD.FMK) еще более уменьшало размеры инфаркта и величины неврологического дефицита. По мнению авторов, эффективное использование очень низких доз bFGF и ингибиторов каспаз открывает возможности новых терапевтических приемов лечения ишемического инсульта (Ma et al, 2001).

Изучение другого фактора этого семейства - FGF-alpha, исследованное в эпендиме и хороидном сплетении желудочков мозга, выявило значительные изменения уровня Фактора в

условиях глобальной ишемии переднего мозга крыс. Одновременно менялась цитогистоло- гическая картина этих зон. Icv инфузия FGF-alpha (осмотический насос) приводила к сохранению уровня Фактора в эпендиме и хороидном сплетении. Постулируется идея, что эти ткани мозга играют ведущую роль в синтезе ростовых факторов, включая FGF-alpha, и их секреции в цереброспинальную жидкость (Hayamizu et al, 2001).

Нейропротективный механизм Нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF) осуществляется за счет модуляции активности NMDA рецепторов (Nicole et al, 2001). В экспериментах на молодых и возрастных крысах показано, что GDNF препятствует гибели нигральных допаминовых нейронов, вызываемой 6-гидрокситриптамином (Fox et al, 2001). У крыс с окклюзионной ишемией мозга выявлялись повреждения, преимущественно локализованные в стриатуме, а также в теменной коре. Исследования обнаружили одновременное увеличение уровня GDNF мРНК в слое гранулярных клеток зубчатого ядра (Arvidsson et al, 2001). На мышах с генетическим дефицитом глиального фибриллярного кислого белка (GRAF) ишемия мозга приводила к более выраженной в сравнении с контрольными животными депрессии электро- физиологических реакций нейронов гиппокампа. Гистологический анализ выявил существенные изменения в структурах СА1 и СА3 пирамидных клеток у GRAF-нокаутных мышей (Tanaka et al, 2002).

Наконец, представлена информация относительно Фактора роста гепатоцитов (Hepatocyte growth factor, HGF), который в эксперименте с цереброваскулярной ишемией предупреждал развитие апоптоза в нервных клетках. Интравентрикулярное введение рекомбинантного препарата HGF предотвращало смерть нейронов за счет влияния на уровень проапоптического белка Bcl-2. HGF также стимулировал ангиогенез в структурах мозга (Tsuzuki et al, 2001).

Кратко суммируя приведенные данные, следует характеризовать участие цитокинов и нейротрофических факторов как весьма еще далекое от полного понимания их роли. Можно полагать, что применительно к ишемической патологии мозга, нейротрофические факторы или оказываются вовлеченными неспецифично (как отголосок общей картины ишемического “шторма” в структурах мозга) или – например, для VEGF – отражают его основную функцию как регулятора сосудисто-эндотелиального гомеостаза. Следует также констатировать, что, согласно приведенной информации, эти регуляторы могут играть роль протективных факторов, или, наоборот, соучастников картины патогенеза.

Интерлейкины. Ишемические и реперфузионные нарушения мозга сопровождаются развитием воспалительных реакций поврежденной ткани и изменениями микроглии и активности лейкоцитов. Цитокины, осуществляющие регуляцию провоспалительных процессов, активируют хемотаксис и «организуют» репарацию поврежденной ткани. Имеется значительная информация о том, что цитокины активно участвуют в начальной стадии постишемических изменений мозга.

В клинических исследованиях была установлена увеличенная продукция цитокинов (типа IL- 1, IL-6 и TNF), способствующих инфильтрации лейкоцитов в первые часы после возникновения ишемического инсульта. Выявлена положительная корреляция между изменением уровня интерлейкина-6 (IL-6) в плазме крови и функциональной динамикой состояния пациентов (см. обзор Clark, Lutser, 2001). Увеличение IL-8 в крови больных на 1-, 3-, 7-е сутки ишемического

инсульта соотносилось с изменениями других биохимических показателей (неоптерина, ионов супероксида, гена транскрипции тканевого фактора и прокоагулянтной активности). У большинства пациентов повышенное содержания IL-8 сохранялось в течение этих семи дней, тогда как другие показатели обнаруживали разнородную динамику. Очевидно активность цитокина не сопряжена с экспрессией противосвертывающей системы крови и скорее влияет на активацию полиморфоядерных лейкоцитов на ранних этапах патогенеза ишемического инсульта (Grau et al, 2001). У пациентов, перенесших кардиоэмболический инсульт, установлена корреляция между увеличением уровня IL-6 и активностью матриксных металлопротеиназ в первые 48 часов заболевания (Montaner et al, 2001). Изменения уровня цитокинов и С-реактивного белка выявлены в цереброспинальной жидкости у больных в острый период ишемического инсульта. На этом основании предложены иммунологические критерии прогноза развития инсульта и возможности восстановления нарушенных неврологических функций (Скворцова и др, 1999).

Экспериментальные исследования позволяют проанализировать клеточные и молекулярные механизмы активности цитокинов при ишемических нарушениях непосредственно в ткани мозга. В экспериментах на крысах, подверженных окклюзионному воздействию с последующей реперфузией, обнаружена увеличенная экспрессия IL-8 и TNF-alpha в ишемизированных регионах. Ингибитор цитокинов широкого спектра (препарат NR58-3.14.3) снижал число инфильтрированных гранулоцитов и макрофагов в прилежащих областях, однако не влиял на их количество в непосредственно ишемизированной зоне (Beech et al, 2001).

На мышах с нокаутным дефектом IL-1 выявлены значительно меньшие размеры ишемического инфаркта мозга в сравнении с контрольными животными. Интрацеребральная инъекция антагониста рецептора IL-1 также уменьшала размеры повреждения как у контрольных, так и у IL-1 нокаутных мышей. Констатируя несомненное участие IL-1 в патогенезе окклюзионной ишемии мозга, авторы подчеркивают различия вклада этого цитокина и его изоформы IL-1alpha (Boutin et al, 2001). В работе Touzani et al. (2002) было установлено, что блокатор рецепторов IL- 1beta существенно снижал объем ишемического повреждения мозга мышей после окклюзии средней церебральной артерии, тогда как icv инъекция этого цитокина вдвое увеличивала повреждение. Однако у трансгенных животных с дефицитом рецептора IL-1beta ишемические нарушения в мозге не отличались от контрольных. Делая вывод о том, что IL-1beta, очевидно, способствует ухудшению патогенеза постишемических повреждений, авторы не связывают это влияние с функцией рецептора цитокина. В другом исследовании (Togashi et al, 2001) рассмотрена связь между активностью IL-1beta и NO при ишемическом повреждении мозга крыс. Интрацистернальное введение антагониста IL-1beta нивелировало ухудшение электрофизио- логических показателей поврежденных синапсов зубчатой извилины и снижало синтез NO в ишемизированной ткани мозга. Центральная аппликация IL-1beta имитировала ишемические изменения синаптической активности клеток dentate gyrus и увеличенную продукцию NO в гиппокампе у контрольных, неишемизированных мышей.

Сравнительные исследования интерлейкина-18 (IL-18), структурно сходного с IL-1beta, выявили значительную разницу их участия в церебральной ишемической патологии. На моделях окклюзионной или фототромботической ишемии у крыс обнаружена “отставленная” экспрессия

мРНК IL-18 (через 48 часов после начала ишемии), достигавшая пика в период 7-14 суток. Экспрессия IL-1beta, напротив, достигала максимума через 16 часов, постепенно снижаясь в последующие сроки. Существенно, что параллельно увеличению уровня IL-18 (но не IL-1beta!) шла экспрессия мРНК каспазы-1. Иммуноцитохимический анализ показал преимущественную локализацию IL-18 в ED1-некротических зонах с инфильтрованными в микроглии фагоцитами в период 3-6 дней ишемии. Локализация IL-1beta была выражена в разветвленной микроглии пограничной инфаркту зоне и в ипсилатеральном кортексе в первые 16 часов ишемического поражения. Данное исследование существенно в акцентировании функций различных цитокинов в мозге, а также впервые конкретизируемой связи IL-18 с апоптическим процессом деструктивных нарушений мозга (Jander et al, 2002).

Важные результаты были получены на клеточных моделях. На культуре срезов гиппокампа исследовано влияние различных концентраций интерлейкина. IL-1beta в низких концентрациях потенцировал вызванную гипоксией нейродегенерацию, тогда как высокие дозы не имели такого эффекта. Наоборот, эти высокие дозы обладали нейропротективным действием на комбинированной модели NMDA-нейротоксичности и кислородно/глюкозной депривации. Оба эффекта, и нейротоксический, и протективный блокировались антагонистами рецепторов IL-1beta (Pringle et al, 2001). Данные свидетельствуют о сложной парадигме про- или анти- ишемических эффектов цитокинов, зависящих, в частности, от типа вещества и от уровня его экспрессии (т.е. действующей концентрации).

Логически с этой работой связаны эксперименты, проведенные с IL-1 на культуре нейронов стриатума. Аппликация интерлейкина приводила к быстрой активации фосфорилирования р38 МАР- киназы. Ингибитор рецепторов IL-1 блокировал этот эффект. Одновременно IL-1 дозозависимо активировал транслокацию транскрипционного фактора NF-kB. Иммунохимический анализ установил, что стимуляция как фосфорилирования р38, так и транслокации NF-kB имеют место только в астроцитах. Поскольку ингибитор р38 МАP-киназы (SB203580) не влиял ни на эффекты IL-1, ни на транслокацию NF-kB, именно цитокину принадлежит ведущая роль в регуляции сигнальных процессов с участием перечисленных факторов (Dunn et al, 2002).

6. РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСМЕМБРАННЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ИШЕМИИ МОЗГА.

Введение в проблему. Исследования последних двух десятилетий привели к открытию огромной системы внутриклеточной регуляции, в составе которой несколько десятков химических факторов, дивергентно связанных между собой. Эта система ферментов и функциональных белков является весьма сложно устроенным звеном, заполняющим пространство между рецептором («входные ворота» любой регуляторной функции) и ядерным аппаратом клетки, где происходит синтез белковых структур, необходимых для реализации кратковременных или долговременных процессов. Особенно сложной и лабильной оказывается эта система в

нейрональных структурах, хотя общий принцип организации сигнальных и транскрипторных систем всех клеток организма является достаточно стереотипным.

В общем плане можно определить три последовательных уровня функций молекулярных посредников.

ПЕРВЫЙ – активация сигнальных систем после взаимодействия лиганда (медиатора, гормона, ростового фактора и др.) с адекватным ему рецептором цитоплазматической мембраны клетки. При этом существенной оказывается химическая конгруентность («согласованность») определенных структур лиганда и рецептора (его домена/-ов), образующих рабочий комплекс. Это взаимодействие приводит к активации (фосфорилированию) белков и ферментов (протеинкиназ) сигнального каскада. Взаимодействие рецепторов с G-белками индуцирует передачу сигнала на различные мишени, включая ионные каналы, активацию ферментов фосфолипаз и аденилатциклазы. Существенным оказывается наличие механизма усиления или ослабления рецепторного сигнала, а также его вариабельной реализации с включением одной из многих цепей каскадных процессов.

ВТОРОЙ уровень – активация систем вторичных мессенджеров, к которым относится гуанилатциклаза и семейства фосфолипаз А2 и С.

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫМ этапом сигнальной трансдукции служит активация так называемых транскрипторных факторов ядра клетки, наиболее значимыми из которых оказываются фактор NF- kB, активирующий протеин AP-1 и активирующий транскрипторный фактор ATF. Следующая затем быстрая активация индуцибельных транскрипторных факторов (c-fos, c-jun, nut-77, CREB, Krox-24) регулирует экспрессию “ранних генов” (immediate-early gene). Экспрессия этих геномишеней служит кодированию структурных белков, ферментов, ионных каналов, нейротрансмиттеров, которые обеспечивают реализацию морфологических, структурных и функциональных изменений в нервной ткани (Huges, Draganov, 1999; см также обзор Herdegen & Leach,1998).

Среди существенных соображений общего плана следует констатировать, что пути передачи сигнала от различных рецепторов взаимосвязаны и что клеточный ответ (реакция нейрона) на активацию того или иного рецептора зависит не только от уровня экспрессии

«собственных» сигнальных белков, но и белков других сигнальных систем, т.е. запускаемых через другие рецепторы (Белецкий и др, 2002). Второе соображение относится к оценке каскадного принципа активации белков и трансляции сигнала. Очевидно, таким способом обеспечивается легкая обратимость регуляторного сигнала и наличие многих стадий, на каждой из которых возможна тонкая модуляция сигнала путем его усиления или ослабления (Болдырев, 2001).

В общефизиологическом плане принято считать, что индукция «ранних генов» происходит при широком спектре воздействий: стимуляции рецепторов гормонами и регуляторными пептидами, электрическом раздражении нейрональных структур, активации синаптических рецепторов нейромедиаторами. Белковые продукты, синтезируемые клетками мозга на основе экспрессии «ранних генов», определяют направление физиологических реакций клетки в ответ на стимулы внутренней и внешней среды, являясь, таким образом, базовой системой адаптационных процессов в организме. Также важна роль «ранних генов» в организации центральных механизмов эмоционального стресса (см. Умрюхин, 2000).

Сигнальные и транскрипторные факторы и церебральная ишемия.

Два хорошо изученных сигнальных каскада, включающих митоген-активированные протеинкиназы MAPK/ERK и p38/SAPK2, активируются факторами, причастными обычно к индукции ишемической патологии мозга – глутаматом, IL-1 и TNF. Изучение изменений активации и клеточного распределения фосфорилированных ERK1/2, -p38 и транскрипторного фактора CREB было изучено на модели окклюзионной церебральной ишемии. Уровень определяемого иммунохимически ERK1/2 был заметно увеличен в цитоплазме нейронального перикария, а p38 - в астроцитах пенумбральных регионов. При этом, если иммунореактивность p38 была преимущественной в субкортикальных зонах, то характерная для фосфорилированных CREB и ERK1/2 окраска проявлялась в олигодендроцитах. Повышенный уровень факторов сохранялся в течение первых суток после воспроизведения 90-минутной окклюзии. Таким образом, существенной оказывается не только экспрессия сигнальных молекул, вызываемая ишемией мозга, но и особенное региональное распределение в нейронах и олигодендроцитах (Irving, Barone et al, 2000).

С помощью сканирующей конфокальной микроскопии и блотт-анализа исследовали сигнальные пути, связанные с экстрацеллюлярно регулируемой киназой (ERK) и c-Jun-NH2-киназой при 15-минутной ишемии переднего мозга с последующей реперфузией. Активация ERK выявлялась через 30 минут и 4 часа эксперимента в сохранен-ных клетках dentate gyrus, но не в погибших нейронах CA1. В этих же клетках выявлены увеличенное фосфорилирование и активация транскрипционного фактора-2(ATF-2) и c-Jun в поздний период реперфузии. По мнению авторов, экспрессия Trk-ERK сигнального пути отражает нейропротективную роль гранулярных клеток зубчатой извилины; активация ATF-2- и c-Jun- сопряженных путей связана с деструктивным развитием процессов в этих нейронах (Hu еа, 2000).

На модели кратковременной ишемии мозга мышей было изучено действие селективного ингибитора МАР-киназы/ERK-киназы (МЕК1/2), препарата SL327, на размеры инфарктной зоны мозга и экспрессию цитокинов. Установлено, что вводимый за 15 минут до окклюзионной ишемии ингибитор на 64% снижал величину поражения мозга и уменьшал пик экспрессии IL-1beta mRNA (но не TNF-alpha mRNA). Таким образом, нейропротективный эффект ингибитора MEK1/2 опосредован супрессией интерлейкина; данные также впервые свидетельствуют о различной регуляции экспрессированной киназы сигнальных путей, сопряженных с IL-1beta или TNF-alpha (Wang et al, 2001).

Тирозинкиназные рецепторы Tie-1, -2, играющие важную роль в эндотелии микрососудов мозга, исследованы на модели церебральной ишемии/реперфузии; установлена связь этих рецепторов с функцией Основного фактора роста фибробластов (bFGF) и Васкулярного фактора роста эндотелия (VEGF) в регуляции ангиогенеза и ремоделирования сосудов после ишемии мозга (Lin et al, 2001). См. также обзорные публикации о митоген-активированных протеинкиназах (Noxaki et al, 2001) и терапевтическом потенциале ингибиторов аденозинкиназы (Kowaluk & Jarvis, 2000).

Исследования активности аденилатциклазы в начальной фазе острой ишемии мозга выявили ее снижение через 2-6 часов после ишемического воздействия. Места сниженной активности фермента строго соответствовали инфарктной зоне. Связывающая активность РКА по отношению к цАМФ, которая отражает функциональную «полноценность» фермента, резко

падала в начальный период ишемии, особенно в уязвимых регионах (СА1 зона гиппокампа); в периишемической зоне связывающая активность РКА, соответственно, оставалась повышенной.

В этой связи информация о факторе CREB (c-AMP-Response Binding Protein) представляет новые грани интереса. Недавно были опубликованы данные о том, что CREB - связанный с ДНК транскрипторный фактор, который оказывается конвергирующим белком нескольких сигнальных каскадов, - играет важную роль в контроле физиологических и патологических состояний, включая синаптическую пластичность и защиту нервных клеток при инсульте (Hedergen et al, 1998; Tanaka, Novaga et al, 2000; Tanaka, 2001).

Фосфорилирование CREB, которое отражает его транскрипционную функцию в ядре клетки, оказывается повышенным в периишемической зоне; и, наоборот, эта реакция быстро замедлялась в зоне ишемии до того, как гистологические признаки поражения становились очевидными. Расстройство цАМФ-сопряженной межклеточной сигнальной трансдукции следует параллельно ишемическому поражению нейронов, и устойчивое сохранение этих процессов оказывается важным фактором выживания нейронов при острой церебральной ишемии. Этот вывод подтверждается также при изучении изменений фосфорилирования CREB в ишемизированном стриатуме крыс. Взаимосвязь увеличенного фосфорилирования CREB в острой

стадии ишемии мозга и обусловленного им повышения концентрации внутриклеточного Са++ (как

результат активации ионных каналов нейрона) была доказана с помощью фенилпиримидинового препарата NS-7, блокатора voltage-sensitive Ca++ - и Na+ -каналов. Нейропротективный эффект этого блокатора сопровождался увеличением фосфорилирования CREB в краевой зоне ишемии (Tanaka, Nogawa, Nagata et al, 2000; Tanaka, 2001).

Усиление экспрессии ранних генов является первичной реакцией генетического аппарата нейрона на экстраклеточные стимулы. Эта экспрессия обеспечивает активацию и рациональное использование ядерной информации согласно потребностям клеток и меняющихся условий жизнедеятельности. В физиологических исследованиях было показано, что индукция гена c-fos наблюдается в ситуациях, которые отличаются высокой степенью новизны и несут элементы обучения (см. Умрюхин, 2000). Усиление экспрессии гена c-fos связано с увеличением тока ионов

по Са++ -чувствительным (voltage sensitive) каналам и, как было многократно продемонстрировано

выше, активация этих потоков стимулируется многими экстраклеточными стимулами, включая те, которые провоцирует ишемия нейрональной клетки.

Роль c-fos в процессах нейродегенерации и нейропротекции служит предметом ряда публикаций, нередко противоречащих друг другу. При исследовании динамики экспрессии c-fos при 10-минутной ишемии переднего мозга крыс было обнаружено снижение иммуно-реактивности фактора во всех пораженных зонах гиппокампа, наиболее выраженное через 6 часов реперфузии. Препарат N-acetyl-O-methyldopamine (NAMDA), защищающий СА1 нейроны от ишемии, увеличивал содержание c-fos в этих клетках.

Таким образом, эти исследования, а также эксперименты in vitro показали, что ишемия ведет к подавлению экспрессии генов c-fos в пораженных нейронах, и нейропротекция с помощью фармакологических воздействий обеспечивает защиту транскрипторной работы генного аппарата (Cho et al, 2001). В исследовании Kinoshita et al. (2001) при использовании гибридизации in situ для

анализа экспрессии c-fos, белка теплового шока HSP70, нейротрофина BDNF и активности циклооксигеназы-2, было подтверждено снижение уровня этих компонентов при развитии ишемического поражения мозга. Выявлена также разнонаправленная динамика содержания мРНК этих белков, свидетельствующая о вовлечении несопряженных механизмов экспрессии системы c-fos/ BDNF/ COX-2 и белка теплового шока 70.

Исследовано участие транскрипторного фактора NF-kB (Nuclear Factor kappa B) в ишемическом поражении клеток мозга. Известно, что NF-kB экспрессируется во многих клетках организма; его функции в мозге предположительно связаны с регуляцией пластичности синаптической связи. При посредстве NF-kB осущест-вляется индукция синтеза ряда ключевых белков, играющих роль в процессах воспаления, иммунном ответе, адгезивных реакциях, среди которых – цитокины, ростовые факторы, металлопротеиназы и другие молекулы, регулирующие продуцирование лейкотриенов, простагландинов и NO в различных клетках организма (см. обзоры: Рожнова и Алесенко, 1999; Carroll et al, 2000). По-видимому, в нейрональной ткани NF-kB может действовать в качестве редокс-контролирующего транскрипционного активатора, что может быть использовано в терапии нейродегенеративных патологий. NF-kB участвует в регуляции экспрессии NO-синтазы, стимулируемой Фактором роста опухоли (TNF) в астроцитах мышей и опосредует экспрессию альфа1-химотрипсина, протеазного ингибитора, активность которого определяется в спинномозговой жидкости пациентов с болезнью Альцгеймера.

Активные формы кислорода (АФК) могут влиять на экспрессию генов и способствовать индукции факторов, ведущих к апоптозу. При глобальной ишемии мозга NF-kB, как правило, экспрессируется в нейронах, “предназначенных” к гибели; активация NF-kB может быть заблокирована антиоксидантами (Clements, 2000). Активация NF-kB может быть спровоцирована многими факторами, причастными к патогенезу церебральной ишемии - глутаматом, интерлейкином-1, TNF. Иммуногистохимическая блотт- техника выявляет увеличение NF-kB- связывающей активности в ишемизированном кортексе; в последующие 6-48 часов реперфузии транслокация в ядре NF-kB возвращается к исходному уровню. Авторы связывают повышенную активность NF-kB с ухудшением провоцируемого ишемией состояния нейронов и их последующей гибелью (Irving et al, 2000). Данные подобного смысла были получены на моделях сублетальной ишемии, вызываемых каинатом или линоленовой кислотой; предобработка животных ингибитором NF-kB диэтилдитиокарбаматом или “ловушкой” NF-kB ДНК блокировали его транслокацию в ядерный материал (Blondeau et al, 2001).

Ослабление нейрональных повреждений в ишемизированном мозге можно получить с помощью трансфекции олигодеоксинуклеотидной “ловушки” NF-kB. Данный подход может оказаться принципиально новым в разработке терапевтической стратегии ослабления нейрональных патологий и защиты ишемизированного мозга (Ueno et al, 2001). Активация NF-kB и транслокация в ядро нейрона связаны с его отделением от ингибиторного белка I kappaB-alpha. Исследования Aronowski et al. (2000) показали, что содержание этой ингибирующей субъединицы заметно снижено в ишемизированной зоне мозга после воспроизведения окклюзионной ишемии крыс. Напротив, в пенумбральной зоне выявлено увеличение иммунореактивности I kappaB-alpha.

Эти данные проясняют новые детали регуляции активности транскрипторного фактора NF-kB,

играющего роль патогенетического агента при ишемии нейронов.

Фактор, индуцируемый гипоксией (Hypoxia inducible factor).

HIF-1 – транскрипторный активатор, который экспрессируется в ответ на гипоксию в огромном множестве различных клеток и который опосредует большое число клеточных и системных реакций. В общем перечне патологических процессов, в которых участвует HIF-1, - легочная гипертензия, ишемия миокарда, онкологические заболевания. Изучение роли HIF-1 при генерализованной и цереброваскулярной ишемии мозга, при ишемических перинатальных явлениях приобретает все больше фактов.

Биохимический анализ показывает, что HIF-1 представляет собой димер, построенный из HIF-1alpha и HIF-1beta субъединиц. Этот транскрипционный фактор участвует в активации эритропоэтина (цитокина, регулирующего гематопоэз), некоторых транспортеров глюкозы и VEGF. Функция HIF-1 состоит в стимуляции транскрипции индуцируемых гипоксией генов транспортера глюкозы-1 и ряда гликолитических ферментов. Установлено, что HIF-1alpha совместно с апоптическим фактором р53 участвуют в механизме патологических реакций, ведущих к смерти ишемизированных нейронов (Halterman et al, 1999).

HIF-1 посвящена большая литература, где активную позицию занимает один из пионеров в исследовании этого фактора - G.L.Semenza.

Фокальная ишемия приводит к увеличению уровня мРНК HIF-1alpha, транспортера-1 глюкозы и ферментов гликолиза в периинфарктной зоне мозга. Этот повышенный уровень сохраняется в течение 7,5-24 часов исследования. Региональный церебральный кровоток умеренно снижается в первые сутки ишемии в зонах, где индуцирован HIF-1. Экспрессия белка HIF-1 в мозге наблюдалась также при системной гипоксии (6% О2, 4.5 часов) (Bergeron et al, 1999). Индукция этого фактора при глобальной ишемии мозга крыс продемонстрирована в работе Jin et al, (2000). Экспрессия HIF-1alpha и VEGF выявлена в церебральном кортексе и гиппокампе; блотт- анализ подтвердил индукцию этих факторов в тех нейронах, которые оказались наиболее уязвимыми к ишемическому воздействию. Аналогичные данные получены при воздействии на крыс гипербарической гипоксии (0.5 атм). Накопление HIF-1alpha в церебральном кортексе быстро увеличивалось с началом гипоксического воздействия и сохранялось в течение 2 недель, нормализуясь к 21 дню (Chavez et al, 2000). В экспериментах на культуре нейронов кортекса было установлено преходящее увеличение HIF-1 ДНК-связывающей активности при кислород/глюкозной депривации. Сниженная связывающая активность фактора выявлялась при «тренирующем» депривационном воздействии (Ruscher et al, 1998).

В ряде работ HIF-1 придается большое значение как фактору, участвующему в перинатальной церебральной патологии. Результаты свидетельствуют об изменениях уровня HIF- 1 мРНК при перинатальной асфиксии (Giappe-Guttierrez et al, 1998); установлена связь HIF-1 с GLUT-транспортерами при гипоксии в период беременности (Royer et al, 2000). Гипоксическая тренировка (“hypoxic preconditioning”) приводит к снижению индукции HIF-1 и защите неонатального мозга в эксперименте (Jones, Bergeron, 2001).

Транскрипторный фактор HIF-1 стимулирует функцию эритропоэтина (ЭПО), индуцируемого гипоксией нейропротективного фактора. Выяснено, что ЭПО защищает нейроны при различных модельных ишемических и дегенеративных воздействиях, вызванных возбуждающими аминокислотами и последующей генерацией свободных радикалов и NO. Активация рецепторов ЭПО предотвращает апоптоз, обусловленный NMDA или NO, при реализации сигнальных путей с участием Jak2 и NF-kappaB и обладает защитной функцией в условиях ишемии мозга (Digicaylioglu, Lipton, 2001).

На основе этих данных эритропоэтину приписывается роль индуцируемого гипоксией протективного компонента. С помощью иммунохимической техники исследовалась экспрессия ЭПО и его рецептора в аутопсийном материале инфарктного мозга человека. На ранних стадиях инфаркта мозга иммунореактивность выявлялась в васкулярном эндотелии и в нейрональных волокнах; поздние гипоксические повреждения характеризовались экспрессией ЭПО в астроцитах. Система ЭПО и его рецептора рассматривается как как потенциальный объект новых терапевтических инициатив предупреждения ишемических поражений мозга (Siren, Ehrenreich, 2001; Siren, Knerlich et al, 2001).

7. ГОРМОНЫ ПРИ ИШЕМИИ МОЗГА

Эстрогенные гормоны играют роль протективных факторов при ишемическом инсульте. Ряд экспериментальных исследований иллюстрирует это положение, конкретизируя молекулярные механизмы и условия защитной функции этой группы гормонов. Установлено, что в условиях повышенного физиологического уровня эстрадиола (проэструс) СА1 нейроны гиппокампа оказываются менее пораженными общей цереброваскулярной ишемией. Эстрадиол, инъецированный оварэктомированным крысам за сутки до ишемического воздействия, значительно улучшал уровень церебральной микроциркуляции в гиппокампе (но не в париетальной коре мозга). Число неповрежденных клеток оказывалось значительно большим у получавших гормон животных. Механизм протективного действия 17бета-эстрадиола, по- видимому, связан с торможением активности каспазы-3, проапоптического фермента (He et al, 2002). Подобный защитный эффект 17бета-эстрадиола обнаруживался как в окклюзионной, так и реперфузионной фазах ишемического воздействия; при этом влияние гормона не относилось к изменениям церебральной гемодинамики (Shi et al, 2001).

У крыс различных возрастных групп 17бета-эстрадиол оказывал защитное действие, которое было преимущественно выражено в церебральной коре. Крысы-самки среднего возраста оказывались защищенными предварительным введением гормона в той же мере, что и молодые, хотя известно, что с возрастом реактивность гипоталамуса к экстрадиолу значительно снижается. Эффект гормона опосредуется через альфа-эстрогенный рецептор, покольку антагонист рецептора эстрогена ICI 182,780 блокировал протективное действие в условиях цереброваскулярной ишемии. Существенно, что для другой формы гормона - 17альфа-эстрадиола,

которая не взаимодействует с данным рецептором, протективное действие не обнаруживается

(Wise et al,2001).

Однако ряд публикаций приводят информацию противоположного рода. Исследования Harukuni et al. (2001) свидетельствуют об отсутствии защитного влияние бета-эстрадиола на модели ишемии переднего мозга. При селективной окклюзии четырех мозговых артерий сосудов изучались нарушения в отдельных регионах гиппокампа у интактных, оварэктомированных и оварэктомированных, получавших эстрадиол, крыс. Полученные данные о повреждениях в СА1 регионе пирамидных клеток различаются не очень существенно и они свидетельствуют об отсутствии выраженного протективного действия экзогенного гормона, инъецированного оварэктомированным животным. В работе Krugers et al. (2000) был использован ингибитор синтеза кортикостерона метирапон (metyrapone), который в условиях унилатеральной ишемии мозга крыс снижал уровень кортикостероида в плазме и предотвращал нарушения симпатической активности клеток гиппокампа. Одновременно метирапон уменьшал дегенеративные изменения в гиппокампе, вызываемые ишемией и введением кортикостерона.

Очевидно, несмотря на убедительные факты, иллюстрирующие протективную активность 17бета-эстрадиола при ишемическом повреждении структур мозга и экспериментальный анализ механизмов защитного действия, специфика регуляторных функций отдельных гормонов должна быть акцентирована с особенным вниманием.

Экспериментальное изучение молекулярных причин защитного действия 17бета-эстрадиола выявило его ингибирующее влияние на вызываемое ишемией резкое увеличение внеклеточного содержания глутамата и аспартата в нейронах гиппокампа (Chen et al, 2001). Логическим продолжением этого исследования явились данные (Jover et al, 2002), свидетельствующие о торможении 17бета-эстрадиолом экспрессии каспазы-3 и проапоптического нейротрофического рецептора р75(NTR) в ишемизированных СА1 нейронах гиппокампа.

Другой защитный механизм 17бета-эстрадиола связывается с потенцированием уровня белков теплового шока. Гормон, вводимый внутрибрюшинно крысам и хомячкам, приводил через 6 часов к 3-5 – кратному увеличению содержания в мозге гемоксигеназы-1, белков теплового шока HSP25/27 и HSP70. Иммуногистохимический анализ показал, что индукция этих белков выражена преимущественно в мышечном слое церебральных артерий. Инъекция 17бета-эстрадиола за 20 минут до воспроизведения окклюзии обеих сонных артерий приводила к увеличению уровня перечисленных белков теплового шока в 1,8-2,4 раза большему, чем то, что вызывалось только окклюзионной ишемией. Индукция гемоксигеназы-1 была выражена преимущественно в олигодендроцитах стриатума и в нейронах гиппокампа, а индукция HSP25/27 и HSP70 – в астроцитах стриатума и в нейронах гиппокампа. Авторы полагают, что стимуляция экспрессии белков теплового шока при ишемическом инсульте является частью протективного механизма, связанного с функцией эстрогенов (Lu, Ran et al, 2002).

Ряд публикаций описывает эксперименты с другими гормонами. Исходя из клинических данных о связи дигидроэпиандростерона и неврологических расстройств, а также сведений о том, что этот гормон защищает нейроны гиппокампа от токсического действия возбуждающих аминокислот, Li et al. (2001) исследовали влияние дигидроэпиандростерона на развитие некротических процессов в

СА1 клетках гиппокампа, обусловленных тяжелой ишемией переднего мозга (10-минутная окклюзия). Предварительное двухнедельное введение различных доз гормона оказывало защитное действие, однако достоверное только для больших доз препарата (100мг).

Несмотря на предшествующую информацию о том, что инсулин увеличивает чувствительность культивируемых нейронов коры в отношении глутаматной токсичности, эксперименты с кратковременной окклюзией четырех сосудов мозга и внутривенной инфузией этого гормона внесли ряд уточнений. С помощью «окна» в коре мозга, которое позволяло определять внеклеточную аккумуляцию ряда аминокислот, было установлено, что инсулин существенно ослаблял исход глюкозы из поврежденных клеток. Повышение уровня аспартата, ГАМК, таурина и фосфоэтаноламина было более выраженным в «инсулиновой» группе животных; влияние инсулина на аккумуляцию глутамата зависело от уровня нарушения гликолитических процессов в ткани (Guyot et al, 2000).

Клиническое исследование содержания в плазме гормонов тироксина, трииодтиронина, тиреотропина, АКТГ (и др.) у 16 пациентов с острым ишемическим инсультом выявило “синдром низкого трииодтиронина”, а также увеличение концентрации тиреотропина, АКТГ и ренина на 2-е сутки инсульта; содержание тироксина оказывалось повышенным на 7-й день заболевания. Установленная корреляция между тяжестью патологического процесса, уровнем гормональной активности и ее снижением к 21 дню исследования может способствовать определению прогностических критериев тяжести и исхода острой фазы ишемического инсульта (Скворцова и др., 2000).

8. ИШЕМИЯ НЕОНАТАЛЬНОГО МОЗГА

Гипоксическая ишемия – нередкий случай патологии фетального и неонатального мозга, которая поражает в мире 0,025-0,01% новорожденных. Хотя системные и цереброваскулярные физиологические факторы играют важную роль в начальной фазе гипоксико-ишемических нарушений мозга, ведущей опять-таки оказывается специфическая уязвимость отдельных групп клеток, определяющая конечную картину повреждения и функциональной дезинтеграции систем. Признаки патофизиологической уязвимости ассоциируются с клиническими синдромами неврологической недостаточности, таких как экстрапирамидальная и спастическая дисплегия и церебральный паралич.

Ведущей молекулярной причиной развития неонатальной ишемии, по-видимому, служит массированный рилизинг глутамата, поражающий некоторые популяции клеток глии (перивентрикулярной олигодендроглии). Данные, полученные в экспериментальных и клинических наблюдениях, свидетельствуют, что нарушение окислительного обмена в клетках мозга и повышенное образование лактата ведут к изменению функции глутаматных синапсов таким образом, что реаптейк медиатора оказывается затрудненным, и постсинаптические мембраны, содержащие глутаматные рецепторы, подвергаются сильной деполяризации. Тяжелая гипоксемия в основном деполяризует мембраны нейрональных клеток, тогда как ишемия имеет более выраженное действие в отношении реаптейка клеток глии. Последующее развитие патологических

процессов на молекулярном уровне связано с активацией цистеиновых протеиназ, таких как каспаза-3, непосредственно запускающих цепочку нейронального апоптоза (см. обзор Johnston, 2001). Более подробно см. также обзоры Соколовой и др., 2002; Ashwal & Pearce, 2001; Johnston,Trescher et al, 2001; Mishra et al, 2001.

Экспериментальные исследования показали, что глиальные транспортеры глутамата GLAST и GLUT-1 и нейрональный транспортер глутамата et al,AC1 по-разному экспрессировались в ишемизированном неокортексе и гиппокампе 7-дневных крыс. Увеличенное образование et al,AC1 в приядерной области нейрона ассоциировалось с экспрессией протеина МАР2 в пограничной повреждению зоне мозга (Fukamachi et al, 2001). Индукцию апоптоза в мозге как активацию прокаспазы-3 наблюдали в экспериментах на 7-дневных крысах, подверженных ишемии. Этот процесс

сопровождался изменениями активности митохондрий: выход цитохрома С и Са++ в цитозоль (Gill

et al, 2002).

Активация центральных никотиновых рецепторов приводила к защите мозга при неонатальной ишемии в эксперименте. При этом значимыми оказывались различия изоформ рецепторов ацетилхолина. Блокирование альфа4/бета2 рецептора селективным антагонистом или опыты на бета2(-/-)-нокаутных мышах показали полное нивелирование протективного эффекта никотина в экспериментах in vivo и in vitro. Указывается, что при разработке стратегии защиты ишемизированного неонатального мозга следует учитывать различную реактивность в этих процессах изоформ никотиновых рецепторов ацетилхолина (Laudenbach et al, 2002).

Эритропоэтин. Хотя рецепторы ЭПО идентифицируются в мозге плода, его роль в эмбриональном развитии остается невыясненной. Исследованиями на трансгенных животных установлено, что при дефиците рецепторов ЭПО развивается тяжелая анемия и дефекты развития миокарда. В исследовании Yu et al. (2002) было установлено, что фактор стимулирует прародительские нейрональные клетки и предотвращает развитие апоптоза в эмбриональном мозге. Отсутствие рецепторов ЭПО в период 12.5 дней эмбриогенеза приводит к снижению числа таких клеток и к увеличению нейронального апоптоза. Соответственно, в культуре кортикальных клеток мышей ЭПОr(-/-) выявляются снижение нейрогенеза и увеличенная чувствительность к низкому напряжению О2 при экспозиции этих животных к гипоксии. Данные свидетельствуют о нейропротективной активности эритропоэтина, обнаруживаемой не ранее 10.5 дней эмбрионального срока, которая способствует защите развивающегося мозга от гипоксии (Yu, Shacka et al, 2002).

9. ИНТРАКРАНИАЛЬНЫЕ ГЕМОРРАГИИ

Патология интракраниальной геморрагии включает комплекс нарушений мозга, в первую очередь, его циркуляторной основы, включающей интрапаренхимные и субарахноидальные нарушения. Спонтанные (нетравматические) интрапаренхимные геморрагии, которые являются обычно следствием разрыва мелких сосудов, возникают преимущественно у пожилых пациентов.

Основной причиной таких нарушений служит стабильно повышенное давление крови; артериальная гипертензия является в 50% случаев причиной интрацеребральных геморрагий.

Другая форма геморрагических нарушений мозга связана с разрывом мозговой аневризмы и развитием субарахноидальных повреждений. Ранняя фаза субарахноидальной геморрагии (САГ) сопровождается острой вазоконстрикцией и последующей ишемией мозга. Понимание патогенеза развивающейся нейродисфункции, соответственно оставленным симптомам, затруднено быстрым включением разнообразных химических механизмов, характерных для ишемических, воспалительных и др. расстройств.

Комплексное исследование 124 пациентов со спонтанной САГ, исследуемой в первые сутки инсульта, диагносцировало прогрессирующее развитие отека и остаточные сосудистые

«каверны», выявляемые при эмиссионно-томографическом обследовании через 3 месяца. Неврологический дефицит, контролируемый по Canadian Stroke Scale, обнаруживался у половины пациентов. Из биохимических показателей характерным явилось значительное увеличение уровня провоспалительных молекул в крови в первые сутки САГ, которое коррелировало с величиной перигематозного отека, когда неврологические и морфологические признаки еще не проявляются. Существенно, однако, что уровень глутамата в крови таких больных оказывается уже повышенным (Castillo et al, 2002).

У другой группы пациентов с тяжелой САГ методом сенсорного микродиализа определяли в коре мозга метаболиты оксида азота, напряжение кислорода и напряжение СО2. Выявилась корреляция между рО2 и уровнем нитратов и нитритов в диализате мозга; такая корреляция, однако, отсутствовала в пробах цереброспинальной жидкости. Не было выявлено также соответствия между величиной, характеризующей NO и рСО2 в ткани мозга, и содержанием лактата и глюкозы в диализате. С точки зрения исследователей позитивная связь изменений уровня метаболитов NO и содержания кислорода отражает патофизиологию вазоспазма у больных с САГ (Khaldi et al, 2001).

Эти сведения могут быть сопоставлены с данными экспериментов на крысах с острой ишемией, вызванной САГ. Ключевым тестирующим средством послужил ингибитор NO-синтазы L- NAME. Этот ингибитор, введенный крысам до и в различные периоды воспроизведения САГ, по- разному влиял на уровень церебрального кровотока. Речь идет, таким образом, о бифазном порядке изменения роли NO после САГ: опосредуемая оксидом азота вазодилатация оказывается слабо выраженной в первые 30 минут САГ и активно равивается спустя 1 час (Schartz et al, 2000).

У 12 пациентов с цереброишемической патологией, вызванной САГ, микродиализом определяли уровень возбуждающих, нейротрансмиттерных и немедиаторных аминокислот. У большинства пациентов ишемия мозга сопровождалась чрезвычайно большим (до 1350-кратного) ростом ГАМК, с параллельным увеличением уровня глутамата и аспартата. Авторы считают эти данные противоречащими той информации, которая получена в экспериментах на различных моделях ишемии мозга, и утверждающей протективный механизм эндогеного увеличения ГАМК (Hutchinson et al, 2002).

Уровень провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-alpha) исследовался в цереброспинальной жидкости 19 пациентов с САГ. У больных со слабо выраженными

неврологическими расстройствами содержание цитокинов было повышенным; у пациентов с ишемическим дефицитом выявлялось высокое содержание IL-6. Таким образом, этот цитокин может рассматриваться в качестве предикторного фактора риска отложенного ишемического дефицита у больных с аневризменной САГ (Kwon & Jeon, 2001). Однако в опытах на собаках с интрацеребральной геморрагией было установлено, что содержание TNF, IL-6 и IL-1 в перигематозной области и в цереброспинальной жидкости в острый период нарушения - через 1 час после операции - не отличалось от контрольной, неоперированной, группы (Quershi et al, 2001). В экспериментах на кроликах с САГ изучено действие рекомбинантного эритропоэтина (rHuEPO), который, как было представлено выше, обладает нейропротективным действием при цереброваскулярной ишемии за счет стимуляции NO. В качестве дополнительного аргумента приводится ссылка на то, что уровень NO, снижающийся при САГ, негативно влияет на цереброваскулярную релаксацию. Эксперименты показали, что введение rHuEPO кроликам после вопроизведения САГ, восстанавливало вазомоторные реакции базилярной артерии; гистологический

анализ также подтвердил существенное снижение числа поврежденных нейронов (Grasso, 2001).

Позитивным действием в отношении обусловленных САГ расстройств обладал 17бета- эстрадиол. Экспериментальная САГ, моделируемая на овариэктомированных крысах, воспроизводилась эндоваскулярным уколом интракраниального сегмента внутренней сонной артерии. Животных забивали через 1 сутки после операции. Введение 17бета-эстрадиола приводило к резкому снижению смертности крыс, уменьшению объема вторичных ишемических повреждений мозга (гистохимическая оценка по хлориду трифенил-теразолиума) и существенно меньшему ограничению кортикального кровотока (измеряемого Допплеровской лазерометрией) в ипси-латеральной и контралатеральной частях мозга. Таким образом, 17бета-эстрадиол существенно уменьшал смертность и развитие вторичных ишемических повреждений, вызываемых САГ в эксперименте (Yang et al, 2001).

10. НЕЙРОПРОТЕКЦИЯ И ТЕРАПИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ МОЗГА

Нейрохимические процессы, разыгрывающиеся при цереброваскулярной ишемии, представляют собой комплекс реакций, включающих эксцессивное накопление экстрацеллюлярного глутамата, нарушения ионного гомеостаза, образованием токсических свободных радикалов и активных форм кислорода, с непреложностью ведущих к некротической или/и апоптической гибели нейронов. Такова «классическая» схема молекулярных процессов, которая лежит в основе различных клинических и экспериментальных форм ишемической патологии мозга. Поэтому можно априори определить, что вещества, блокирующие компоненты этого каскада, антагонисты рецепторов глутамата, блокаторы ионных каналов, нейтрализаторы свободных радикалов могут рассматриваться как потенциальные средства терапии церебральной ишемии. Этот подход проанализирован в обзоре Callaway (2001).

Однако для такого мультипатологического механизма могут оказаться недостаточными средства «одноточечного» воздействия. В качестве принципиально нового подхода предложено

соединение АМ-36[1-(2-(4-chlorophenyl)-2-hydroxy)ethyl-4-(3,5-bis(1,1-dimethyl)-4-hydroxyphenyl) methylpiperazine] из серии гибридных молекул, которое тормозит связывающую функцию полиамидной части глутаматных рецепторов, блокирует натриевые каналы нейрона и обладает сильной антиоксидантной активностью. В нейрональной культуре AM-36 ингибирует токсическое действие, вызываемое NMDA и, кроме того, тормозит вызываемый вератридином апоптоз. Системное введение АМ-36 крысам с окклюзионной ишемией мозга значительно снижало размеры инфаркта в коре и стриатуме; при этом улучшались показатели неврологического дефицита, сенсомоторной активности и др. Препарат обладал протективным действием даже при введении через 3-5 часов после воспроизведения инсульта (Callaway, 2001).

В работе Montoliu et al. (2002) были испытаны синтетические соединения из группы N- алкилглициновых тримеров. Два вещества (6-1-2 и 6-1-10) обладали нейропротективной активностью на культуре нейронов мозжечка в условиях вызываемого глутаматом повреждения; защитный эффект был сопоставим с действием антагонистов рецепторов NMDA. Интраперитонеальное введение этих двух пептидов снижало нейродегенерацию клеток стриатума крыс, вызываемую церебральной ишемией. Нейропротективная активность тестируемых веществ связана с торможением каспазы-3 и предотвращением апоптозной гибели клеток. Таким образом, речь идет о новых соединениях, возможных для использования в терапии нейродегенеративных патологий и обладающих существенно меньшими побочными следствиями в сравнении с антагонистами рецепторов NMDA.

Препарат ГВС-111, дипептид, ноотропный аналог пирацетама, исследованный в НИИ фармакологии РАМН в Москве, обладал протективной активностью при ишемическом повреждении гранулярных клеток мозжечка. Препарат предотвращал вызываемую глутаматом и окислительным стрессом нейродегенерацию, чем отличался, в частности, от своего «прародителя» - пирацетама (Андреева и др., 2000). Другое соединение – гептапептид, синтетическое производное тафцина, в экспериментальных исследованиях восстанавливало когнитивные функции, нарушенные антенальной гипоксией. Исследованы фармакокинетика вещества, метаболизм и психостимулирующие свойства (Семенова и др,1998; Бойко и др, 1998).

В течение последних пятнадцати лет ведутся исследования с пептидными фрагментами адренокортикотропного гормона. На основе структуры АКТГ(4-10) (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) создан препарат «Семакс» (см. Ашмарин и др., 1997). Эти работы, выявившие различную физиологическую активность отдельных фрагментов АКТГ, привели к созданию ноотропного препарата с широким спектром терапевтического действия, успешно используемого в неврологии. Получены доказательства высокой эффективности семакса в острый период ишемического инсульта в клинике (Мясоедов и др., 1999).

Изучение биохимических основ действия семакса показало, что препарат снижает уровень NO в церебральном кортексе и подавляет процессы перекисного окисления при глобальной ишемии мозга (Bashkatova et al, 2001). Установлено избирательное влияние семакса на экспрессию гена c-fos в мозге крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу (Умрюхин и др.,2000). В дополнение к этому комплексу работ были изучены фрагменты АКТГ(5-7) и

АКТГ(5-10), защищавшие клетки мозга от ишемических и деструктивных воздействий (Глазова и др.,1999; Левицкая и др., 2000).

Среди малых пептидов интересны исследования антиишемической активности карнозина. Этот дипептид, более ста лет изучаемый биохимиками, в последние годы получил новые импульсы патофизиологического и клинического применения. Исследование роли нейропептидов в процессах апоптоза, проводимые в МГУ им. М.В.Ломоносова и в НИИ неврологии РАМН, привели к заключению о том, что ряд гистидин-содержащих пептидов регулирует клеточную стабильность, участвуя в защите нейронов от окислительного стресса и программируемой смерти (Болдырев, 2000). Новым аспектом в изучении дипептида карнозина послужило доказательство его антиоксидантной активности. Непосредственное влияние карнозина на процессы перекисного окисления и образование активных форм кислорода определяет защитное действие дипептида при ишемической патологии мозга (Суслина и др., 2000; Stvolinsky et al, 2000).

Отдельный раздел посвящен поиску средств, препятствующих рилизингу или рецепторному связыванию глутамата. На модели фокальной цереброваскулярной ишемии крыс сравнивалось нейропротекторное действие новых соединений - селективного антагониста рецептора глутамата mGluR5, соединения 2-methyl-6-phenylethynylpyridine (MPEP), и селективного агониста этого рецептора, соединения (R,S)-2-chloro-5-hydroxyphenylglycine (CHPG). Интрацеребральное введение веществ, которое следовало через 15 или 135 минут после воспроизведения церебральной ишемии, обнаружило значительное снижение размеров инфаркта мозга и улучшение неврологических показателей. Эффективность защитного действия препаратов зависела от их доз и времени введения после ишемического воздействия. MPEP, помимо блокады глутаматного рецептора, выступал также как неконкурентный антагонист NMDA; препарат CHPG обнаруживал антиапоптическую активность (Bao et al, 2001).

Исследование DOPA-циклогексилового эфира выявило его способность препятствовать рилизингу глутамата, чем объяснялось нейропротективное действие вещества при церебральной ишемии, вызываемой 5-10 минутной окклюзией артерий мозга. Рилизинг глутамата и препятствующее тому действие DOPA-циклогексилового эфира было испытано на наиболее чувствительных к ишемии CA1 пирамидных клетках гиппокампа. Введение препарата в гиппокамп препятствовало эксцессивному высвобождению глутамата при 5-минутной ишемии и предотвращало клеточную гибель через 96 часов реперфузии. При более тяжелой ишемии защитное действие препарата оказывалось слабым. Речь идет, таким образом, о возможном терапевтическом применении DOPA- циклогексилового эфира в уловиях «мягкого» ишемического воздействия на мозг (Arai et al, 2001).

Информацию о веществах, осуществляющих нейропротективное действие за счет торможения рилизинга глутамата, завершает сообщение De Cristobal et al. (2001), которые в экспериментах in vitro установили глутамат-блокирующее действие аспирина. Позднее, на модели фокальной цереброваскулярной ишемии крыс подтвердилось, что внутрибрюшинное введение аспирина в дозе 30 мг/кг за 2 часа до окклюзии обусловливало значительное снижение размеров церебрального инфаркта, которому соответствовало уменьшение содержания глутамата в крови в первые минуты операции. Аспирин также препятствовал снижению уровня АТФ в ткани мозга,

вызываемого ишемией. Речь идет, таким образом, о новой стороне терапевтической эффективности

«старичка» аспирина, используемого в данной работе в концентрации, соответствующей антиагрегационной терапии риска ишемических расстройств.

На модели фокальной ишемии мозга монгольских хомячков исследовалась антиишемическая активность n-ацетилцистеина, вводимого за 30 минут до начала реперфузии. Препарат (20 мг/кг) уменьшал постишемический отек мозга, а также снижал деструкцию СА1 клеток пирамидного слоя гиппокампа. Среди биохимических эффектов следует отметить снижение уровня малонового диальдегида и активности миелопероксидазы в мозге, экспрессируемые ишемией. Гистологический анализ выявил уменьшение прокрашивания мест, характерных для поли(АДФ- рибоза)синтазы, экспрессия которой обычно сопряжена с ишемической деструкцией нейронов. Эти данные свидетельствуют о защитном действии ацетилцистеина при экспериментальной цереброваскулярной ишемии (Cuzzocrea et al, 2000).

Исследование эффектов коэнзима Q(10) на изменения уровня лактата (ацидоз), АТФ и активность супероксиддисмутазы на модели вызываемой инъекцией эндотелина церебральной вазоконстрикции выявили его сильное антиоксидантное и нейропротективное действие. Вводимые icv эндотелины-1 и –3 (20 пикомолей) вызывали гистологически выявляемые поражения нейронов коры и гиппокампа, которые нивелировались при внутрибрюшинном введении коэнзима Q(10). Протективный эффект был особенно заметен в СА1, СА2 и СА3 зонах гиппокампа. Очевидно, защитные свойства коэнзима Q(10) обусловлены его антиоксидантной активностью и препятствием образованию свободно-радикальных соединений (Ostrowski, 2000).

В исследовании Ooboshi et al. (2000) было испытано антиишемическое действие локальной гипотермии мозга. В трех группах взрослых крыс в гиппокампе поддерживалась нормальная (36о С), мягкая (33о С) и умеренная (30о С) температура. Цереброваскулярная ишемия вызвала увеличение концентрации экстраклеточного глутамата и аспартата (соответственно, в 6 и

5 раз), которое было, однако, вдвое ниже в группах с мягкой и умеренной гипотермией. Гипотермия снижала экспрессию таурина. Гистопатологический анализ подтвердил, что возникающие вследствие ишемии повреждения клеток СА1 зоны гиппокампа, были также значительно меньше у крыс с гипотермией. Эти результаты указывают на эффективность и молекулярные причины защитного действия умеренной гипотермии мозга при его ишемическом поражении. Действие гипотермии, очевидно, связано с торможением эксцессивного высвобождения возбуждающих и ингибиторных аминокислот в ишемизированном мозге.

ИШЕМИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА