Оценка санитарного состояния антропогенно измененных почв (урбаноземов) промышленных городов Иркутской области

Реферат

Дипломная работа на тему «Оценка санитарного состояния антропогенно измененных почв (урбаноземов) промышленных городов Иркутской области» выполнены по актуальной проблеме охраны почв городских территорий.

В данной работе приводятся результаты по исследованию количественного и качественного состава гетеротрофных сапрофитных бактерий и санитарно-показательных бактерий микробных сообществ урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

Полученные результаты представляют ценность своей научной новизной и имеют практическую направленность для научных разработок в сфере охраны городских почв.

Работа изложена на ___ страницах машинописного текста, который иллюстрирован 10 таблицами, 3 рисунками. Список использованной литературы включает 52 работ отечественных и зарубежных авторов.

Содержание

Введение

Обзор литературы
1. Роль почвы в городских экосистемах
2. Краткая характеристика урбаноземов
3. Особенности состояния микробиоценозов городских почв под действием техногенеза и урбанизации
4. Бактерии группы кишечной палочки (БГКП), как показатели санитарного состояния почв
5. Классификация бактерий группы кишечной палочки (БГКП)
Состояние промышленных городов Иркутской области в связи с экологической ситуацией в регионе
Объекты и методы исследования
1. Объекты исследования
2. Методы исследования
Результаты исследований
1. Количественный состав гетеротрофных сапрофитных бактерий, как показатель санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области
2. Качественный состав бактериального комплекса урбаноземов промышленных городов Иркутской области
3. Санитарно-показательные бактерии урбаноземов промышленных городов Иркутской области
4. Видовой состав санитарно-показательных бактерий в урбаноземах промышленных городов Иркутской области

Выводы

Список использованных источников

ВВЕДЕНИЕ

При социальной оценке окружающей среды, наряду с различными характеристиками, исследуются санитарно-гигиенические условия (24).

Обнаружение санитарно-показательных микроорганизмов во внешней среде свидетельствует о загрязнении ее выделениями человека и животных. Так как с этими же выделениями во внешнюю среду могут поступать патогенные микроорганизмы – возбудители заболеваний, обнаружение того или иного санитарно-показательного микроорганизма, специфического для данного объекта или для данного экскрета, косвенно указывает на возможность поступления в исследуемый объект и патогенных микроорганизмов (Калина, 1969).

В задачи моей работы входило:

Исследование качественной и количественного состава бактериальных сообществ урбаноземов промышленных городов Иркутской области.
Дифференциация бактерий, доминирующих в исследуемых объектах.
Количественное определение в исследуемых почвах бактерий группы кишечной палочки.
Идентификация бактерий группы кишечной палочки и оценка санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

Работа выполнена на базе кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета Иркутского Государственного Университета под руководством доцента кафедры микробиологии, кандидата биологических наук Макаровой Альбины Павловны.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Роль почв в городских экосистемах

Экосистема (как и человек) может функционировать лишь при определенном качестве окружающей среды (Хавина, 2001).

На рубеже тысячелетий проблема совершенствования оценки состояния земель, почв и процессов их изменения (как правило, ухудшения) обретает новое значение. На первый план выходят те почвы, изучение которых ранее не считалось приоритетной задачей, в частности, почвы городов и близлежащих населенных пунктов (Сизов, 2001).

Рост городов-гигантов приводит к интенсивному воздействию человека на окружающую среду, как самого мегаполиса, так и обширных пространств вокруг него (Строганова, 1998).

Городские почвы формируются при совместном воздействии зонально-климатических факторов и средообразующего антропогенного фактора, который воздействует на почвы как прямо в виде способа землепользования, так и косвенно – изменяя факторы почвообразования (Прокофьева, 2001, Берджи, 1994).

В широком понимании городская почва – это любая почва или почвоподобное тело, функционирующее в окружающей среде города. В узком смысле этот термин подразумевает почвы и почвоподобные тела, находящиеся по «прессом» города (Строганова, 1992).

Специфические особенности городских почв обусловлены чрезвычайно сильным воздействием антропо-техногенных процессов: загрязнение разнообразными химическими веществами и обломками строительных материалов, интенсивная рекреационная нагрузка, накопление культурного слоя, использование почвы в качестве основания для строительства домов, промышленных объектов, прокладки автомагистралей и энергосистем (Прокофьева, 2001).

Возникает проблема необеспеченности городов природно-ресурсным потенциалом, что выражается в недостаточных площадях зеленых насаждения, развитии опасных геодинамических процессов. Происходит изменение уровня грунтовых вод. Идет постепенное подтопление некоторых частей города, поскольку нарушается естественный круговорот воды. В местах интенсивно застройки осушаются болота, засыпаются русла рек. Также происходит изменение форм рельефа. С одной стороны, наблюдается нивелирование форм рельефа: засыпание оврагов, заключение мелких речек в трубы и подземные коммуникации, засыпание пойм, срезание холмов и склонов. С другой стороны, в центрах городов рельеф приподнят за счет накопления культурного слоя. Все это приводит к потере устойчивости территорий, увеличивая абиотичности системы, повышении степени экологического риска для всех компонентов окружающей среды: воздуха, почвы, воды и грунтов (Осипов, 1994, Строганова, 1992, Строганова, 1997).

Таким образом, изменения качества среды обитания человека в городе ведет к снижению комфортности жизни населения, подтверждением чего являются медико-демографические показатели городов, в частности, высокий уровень заболеваемости, рост генетических болезней, появление новых и, как результат, - снижение продолжительности жизни. По прогнозам ученых эти тенденции будут усиливаться, особенно в мега- и мегалополисах (Строганова, 1998, Сизов, 2001).

Рассматривая городские почвы, мы исходим из того, что вся территория города представлена: 1 - открытыми, частично озелененными территориями; 2 - закрытыми – застроенными и заасфальтированными участками. Поверхностные тела территорий первого типа разделяются на группы естественных нарушенных почв, поверхностно преобразованных урбопочв, антропогенных глубокопреобразованных – урбаноземов и искусственно созданных – техноземов. Также на открытых поверхностях город могут залегать непочвенные образования – техногенные и насыпные, намывные, перемешанные природные грунты. На заасфальтированных территориях второго типа под асфальтобетоном или другими дорожными покрытиями формируется особая группа тел – запечатанные почвы «экраноземы» и запечатанные грунты (Добровольский, 1997, Прокофьева, 2001, Строганова, 1998).

В крупных городах и промышленных центрах до 70-90% поверхности почвы запечатано асфальтобетоном или жилыми и промышленными постройками, следствием чего большая доля загрязненных осадков минует почвенное тело и непосредственно уходит через канализацию в водоемы и речную сеть. Таким образом, асфальтобетонное покрытие защищает почву от основной массы загрязнителей и препятствует проникновению в нее дождевых осадков, изменяет водно-воздушный режим; в ней продолжается жизнедеятельность микроорганизмов, что свидетельствует о газообмене почвы с воздухом атмосферы. Еще одним негативным последствием является парниковый эффект, создающийся в результате запечатывания почвы. Без естественной аэрации почва переувлажняется, что способствует повышению влажности в подвалах и разрушению фундаментов. В результате страдает здоровье жителей нижних этажей: наблюдается повышенная влажность помещения, развитие патогенной и грибковой микрофлоры, борьба с которой практически невозможна. Излишнее покрытие почвы асфальтом в лесопарках, скверах, на бульварах и прочих территориях также неблагоприятно: корни, распространяющиеся под асфальт, гибнут в анаэробных условиях. Поэтому необходимо заменять непроницаемое покрытие экологически чистой брусчаткой или другими проницаемыми материалами.

Почвы или почвоподобные тела, формирующиеся в урбоэкосистеме, аналогично природным почвам выполняют роль базисной составляющей: в них замыкаются биогеохимическое преобразование культурного насыпного слоя, трансформация поверхностных вод в грунтовые, они являются питательным субстратом для растений. Почва служит банком семян, регулятором газового обмена и т.д. (Бабьева, 1989, Сараев, 1998)

Городские почвы выполняют в городе разнообразные экологические функции (Добровольский, 1997). Главными их характеристиками являются плодородие, пригодность для произрастания зеленых насаждений, способность сорбировать в толще загрязняющие вещества и удерживать их от проникновения в почвенно-грунтовые воды, а также от поступления пыли в городской воздух. Роль почвы в городе существенна и разнообразна. Выполняя важные средообразующие функции, почва изменяет химический состав атмосферных осадков и подземных вод, она является универсальным биологическим адсорбентом, поставщиком и регулятором содержания СО2, О2, N2 в воздухе. Почва является хорошим поглотительным барьером газовых примесей, в том числе она также регулирует газовый состав атмосферы путем выделения и поглощения газов (метана, аммиака, и др.).

Благодаря определенным биогеохимическим свойствам и огромной активной поверхности тонкодисперсной части почва превращается в «депо» токсических соединений и одновременно становится одним из важнейших биогеохимических барьеров для большинства соединений (минеральных удобрений, пестицидов, нефтепродуктов и т.д.) на пути их миграции из атмосферы города в грунтовые воды и речную сеть. Почва переводит поверхностные сточные воды в грунтовые и очищает их, а также выполняет функцию защитного сорбционного барьера от загрязнения пресных вод и водоемов (Звягинцев, 1987, Строганова, 1997).

Почва – одно из необходимых условий произрастания зеленых насаждений. Экологически неорганизованные, неозелененные городские территории являются дополнительным источником твердого вещества, поступающего в атмосферу и усиливающего эффект запыленности воздуха токсическими веществами. Одно из основных требований к почвам в городах – обеспечение оптимальных условий произрастания зеленой растительности в системах урбанофитоценозов (Bullock, 1991).

Современные проблемы городской экологии разнообразны и включают в себя изучение роли почв в городских экосистемах. Изменение городских ландшафтов в результате землепользования приводит к трансформации почвенных свойств и, в результате, - к смене почвенно-экологического ядра. Для разрешения данных проблем должны быть изучены свойства почв и степень их загрязнения (Строганова, 1997).

Для сохранения и восстановления городских экосистем необходимо систематическое санитарно-микробиологическое изучение урбаноземов, как одно из направлений экологического контроля окружающей среды. Это позволит в комплексе с другими интегральными показателями санитарной функции почв выработать соответствующие подходы к санации городских почв.

Становится очевидным, что в условиях городов, а тем более крупных городских агломераций, жизненно необходимо принимать особые меры по обеспечению охраны почв (Сизов, 2001).

Краткая характеристика урбаноземов

Одной из проблем современности является урбанизация стран с высокой долей городского населения. Эта проблема затрагивает и РФ, где в городах и населенных пунктах проживает около населения, т.е. более 100 млн. человек на территории, равной 0,65% от общей площади. Быстро растущая урбанизация и прогрессивное увеличение площадей под городами и населенными пунктами приводит к тому, что городская среда постоянно развивается, подвергаясь воздействию внутренних и внешних факторов.

Современная урбанизация сопровождается значительным отчуждением продуктивных земель под городские застройки и промышленные объекты, и площадь таких земель повсеместно увеличивается. По данным Организации экономического сотрудничества и развития, за последние 20 лет площадь под застройки росла в два раза быстрее, чем население. Численность населения, проживающего в городах в 90 гг. 20 в. Составляла 2,3 млрд. человек, а урбанизированные земли, по оценке Исполкома ЮНЕП, составляют 60 млн. га, или 0,46% всей площади земель мира. К 2001 г. в городах проживало 3,2 млрд. человек, а площадь урбанизированных земель превысила 100 млн. га. К 2005 г. 50% населения планеты жили в урбанизированном мире (Строганова, 1997, Сизов, 2001).

Урбаноземы – генетически самостоятельные почвы, обладающие как чертами зональных почв, так и специфическими свойствами (Строганова, 1997).

Согласно классификации Агарковой (Агаркова, 1991), урбаноземы предлагается подразделять на:

1) собственно урбаноземы, которые характеризуются отсутствием генетических горизонтов до глубины 0,5 см. обычно они представлены культурными отложениями, состоящими из своеобразного пылевато-гумусного субстрата разной мощности и качества с примесью городского мусор; могут подпираться какой-либо преградой;

2) культуроземы – городские почвы фруктовых и ботанических садов, старых парков или бывших хорошо окультуренных пашен; отличаются большой мощностью гумусного горизонта и перегнойно-торфокомпостного слоя разной мощности, развиваются на нижней иллювиальной части почвенного профиля исходной природной почвы;

3) индустриоземы – почвы промышленных зон, сильно техногенно загрязенные и уплотненные;

4) некроземы – почвы, входящие в комплекс почв городских кладбищ.

Наряду с искусственно созданными урбаноземами в городе выделяются и естественные почвы разной степени нарушенности. Они сочетают в себе ненарушенную нижнюю часть профиля и антропогенно нарушенные верхние слои. В слабонарушенных почвах нарушения затрагивают гумусово-аккумулятивные горизонты (до глубины 10-25 см). К подгруппе погребенных относятся почвы, сохранившие под антропогенной толщей весь почвенный профиль или какую-либо его верхнюю часть (Строганова, 1992).

Несмотря на нарушенность или искусственное создание почвенного профиля, большую засоренность его разного рода включениями и изменения общих экологический условий функционирования, в урбаноземах протекают процессы гумусообразования,, выноса и перераспределения минерального вещества (Агаркова, 1991).

Между тем основные трансформации почв и почвенного покрова так или иначе связанные с человеком, вызваны, строго говоря, его производственной деятельностью – теми или иными орудиями труда (примитивными или современными), т.е. техникой в ее широком понимании. К таким почвам относятся индустриоземы, т.е. почвы промышленных зон, находящиеся под действием техногенеза.

Техногенез стал в настоящее время мощным фактором почвообразования, воздействие которого на почвы приобретает глобальный масштаб.

Техногенно измененные почвы целесообразно определить как почвы, являющиеся в той или иной степени продуктом технопедогенеза – такого почвообразовательного процесса, который испытывает на себе влияние деятельности человека. Техногенно измененные почвы отражают это влияние на своих свойствах (Геннадиев, 1992).

По прогнозным оценкам экологов состояние урбаноземов будет ухудшаться под действием растущих негативных процессов. Поэтому необходимо применять меры по санитарной охране почв:

Охрана зональных, естественных почв, борьба с эрозией, предотвращение вырубок деревьев и кустарников.
Содержание в порядке канализационной системы.
Очистка населенных пунктов и захоронение отходов в строго определенном месте.
Охрана водоемов от проникновения в них сточных вод и предотвращение выбросов канцерогенных веществ (Агаркова, 1991, Строганова, 1998).
1. Особенности состояния микробиоценозов городских почв под влиянием техногенеза и урбанизации

В настоящее время почва рассматривается как банк, котором хранятся самые разнообразные виды микроорганизмов (Звягинцев, 1994).

Населенность почвы микроорганизмами – показатель ее биогенности (Барыкова, 1992).

Почва благодаря своей трехфазности способна обеспечивать условия для существования в ней разнообразных микроорганизмов, одни из которых находятся на почвенных частицах, другие – в водных пленках, капиллярах или почвенном растворе. Для адсорбции на почвенных частицах у бактерий существуют специальные приспособления: капсулы, простеки, фимбрии и др. Большая часть микроорганизмов в естественных условиях адгезированы на твердофазном субстрате (Звягинцев, 1991).

Микрозональность распределения микроорганизмов в почве с адгезией клеток на твердых поверхностях имеет принципиальное значение, так как в адсорбированном состоянии у микроорганизмов меняются морфология клеток, циклы развития, продолжительность лаг-фазы, скорость размножения. В отдельных микрозонах создаются совершенно различные условия и появляется возможность развития в почве – чрезвычайно структурированном биотопе – самых различных по своим свойствам групп микроорганизмов (Головченко, 1993).

Почва является средой обитания бактерий, актиномицетов, грибов, простейших, микроскопических водорослей, вирусов. Все эти организмы составляют сложные и весьма изменчивые ассоциации. Преобладают при этом аэробные, анаэробные бактерии и грибы (Барыкова, 1992, Добровольская, 1997).

Считается, что микробный компонент, биомасса которого в почвах может достигать 3-9 т/га, выполняет одну из важнейших в наземных экосистемах функцию стабилизации, так как полифункциональность микробиоты позволяет участвовать ей в реакциях, определяющих метаболическое равновесие в природе (Красильников, 1966).

Все возможные органические соединения растительного и животного происхождения, попадая в почву, аккумулируются в верхних ее слоях (0-25 см), где обуславливают более высокий показатель микробного населения. Количество сапрофитных бактерий в загрязненных органическими веществами почве достигает иногда 10-15 млн. в 1 г. В относительно чистых почвах оно не превышает 1,5-2 млн. в 1 г. (Геннадиев, 1992, Макарова, 1999)

Хорошо известно, что микроорганизмы относительно устойчивы к воздействию окружающей среды по сравнению с другими представителями живой природы. Однако исследования последних лет показали, что данный компонент любой экосистемы при усиленно возрастающем техногенезе и урбанизации уязвим. Иными словами, в микробиоценозах происходит изменение количественного и качественного состава микроорганизмов, меняется их разнообразие и энзиматическая активность. Нарушения могут быть столь серьезными, что микроорганизмы окажутся не в состоянии осуществлять деструкцию органических остатков и высвобождать минеральные вещества для растений (Барыкова, 1992, Напрасникова, 1999).

Анализ работ Х.А.Джувеликяна, В.П.Рохмистрова с соавт., по влиянию тяжелых металлов на микробные комплексы позволяет сказать, что длительное загрязнение почв вызывает изменение в численности основных групп почвенной микрофлоры (Джувеликян, 1995). Уменьшается содержание бактерий и актиномицетов. Более устойчивы к загрязнению микроскопические грибы (Рохмистров, 1995).

Интересные данные находим в работе С.А.Алексеевой, где при изучении микробных сообществ с различным содержанием меди цинка, марганца было установлено, что наибольшей устойчивостью к ним характеризуются микроскопические грибы, наименьшей – бактерии (Алексеева, 1986).

Структура сапрофитного бактериального комплекса (СБК) городской экосистемы изучена недостаточно. Известно, например, что в наземном ярусе и опаде доминируют грамотрицательные бактерии, а в почвенном ярусе на первый план выходят грамположительные бактерии родов Bacillus, Artrobacter и актиномицеты рода Streptomyces. Это характерно как для нарушенных экосистем, так и для городских урбанизированных территорий.

На современном этапе урбанизации жизни населения особое значение имеет санитарное состояние почв. В настоящее время, когда внимание экологов направлено на глубокие исследования экологических функций почв, показано, что санитарная функция и есть одна из экологических (Добровольский, 1990).

В урбанизированных экосистемах сохраняются закономерности пространственной организации бактериальных комплексов, характерные для естественных экосистем, однако, при этом выявляется и некоторая перестройка в таксономической структуре сапрофитного бактериального комплекса. В условиях города происходит перераспределение таксонов в пользу увеличения удельного веса бактерий, тесно связанных с человеком (род Micrococcus), а также приспособленных к существованию в условиях города (пигментированные родококки) (Куличева, 1995).

В работах Е.Н.Мишустина с соавт. показано существенное превышение показателей численности сапрофитных бактерий в городских почвах, как свидетельство об их загрязненности теми или иными органическими веществами. Снижение количества сапрофитных бактерий говорит о высокой токсичности и загрязнении ядовитыми промышленными выбросами (Мишустин, 1979).

В работах указанных выше авторов приводятся данные об индикационном показателе на загрязненность городских почв спорообразующих бактерий – Bacillus mesentericus subtilis (Напрасникова, 1998).

Индикаторами загрязнения можно считать и энтерококки. Они несвойственны почве, поэтому могут служить показателями фекального загрязнения окружающей среды. Энтерококки не обнаруживаются в незагрязненных почвах и в почвах, удаленных от жилья (30).

В фекальных массах могут находиться и болезнетворные микробы – возбудители дизентерии, холеры, сибирской язвы и др. они обладают ограниченной способностью к размножению в почве и могут использоваться как индикаторы на загрязнение окружающей среды (21).

В условиях города практически везде возрастает значимость представителей группы кишечной палочки (БГКП). Возрастание численности БГКП в городских экосистемах вполне закономерно, поскольку высокая плотность населения как основного источника микробного загрязнения сочетается с наличием городских отходов, в которых бактерии группы кишечной палочки (БГКП) могут выживать и накапливаться.

Кроме способности участвовать в самоочищении почвы, БГКП являются санитарно-показательными микроорганизмами. По их количественному и качественному составу судят о санитарном состоянии почвы. Резкое увеличение их численности в почвах косвенно может свидетельствовать об эпидемиологическом неблагополучии (36).

1.4. Бактерии группы кишечной палочки (БГКП), как показатели санитарного состояния почв

Бактерии группы кишечной палочки (БГКП), населяющие фекальные массы, не свойственны незагрязненным (чистым) почвам, вследствие чего их удобно использовать для оценки санитарного состояния почвы (Лоранский, 1972, Мишустин, 1979).

Санитарно-показательное значение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) обусловлено тем, что по своим свойствам они близки к тифозно-паратифозной группе. Это позволяет распространять выводы, получаемые при работе с кишечной палочкой на патогенную и дизентерийную микрофлору, выявление которой в почве представляет значительные трудности (Билетова, 1980).

Связь между загрязнением почвы и содержанием в ней БГКП отмечена давно. Проникновение кишечной палочки на глубину зависит от структуры почвы и состояния поверхностного слоя. В сильно загрязненных, нарушенных почвах кишечная палочка обнаруживается даже на глубине 1 м, хотя в основном, как и другие бактерии, она может быть сосредоточена в поверхностном слое (до 30-40 см). Однако долго существовать в условиях почвы БГКП не могут, и со временем количество их уменьшается через несколько месяцев, т.е. даже сильно загрязненные почвы самоочищаются от бактерий группы кишечной палочки (Калина, 1969).

К бактериям группы кишечной палочки (БГКП) относятся микроорганизмы, входящие в семейство Enterobacteriaceae. Это подвижные грамположительные, неспороносные палочковидные бактерии, факультативные анаэробы, сбраживающие углеводы при 35-37 градусах Цельсия с образованием кислоты и газа, растущие на фуксинсульфитном агаре (агар Эндо) с образованием красных с металлическим блеском, темно-красных или розовых колоний. На мясо-пептонном агаре через сутки образуются прозрачные с серовато-голубым отливом (рис. 1), сочные колонии, при росте на мясо-пептонном бульоне происходит образование осадка. Биохимические свойства непостоянны в отношении сбраживания углеводов, поэтому при дифференциации их учитывают не самостоятельно, а в комплексе с другими тестами.

РИС.1

Основными санитарно-показательными микроорганизмами являются представители родов Esherichia, Citrobacter, Enterobacter, которые удовлетворяют требованиям, предъявляемым к санитарно-показательным микроорганизмам:

могут выделяться во внешнюю среду из организма хозяина в количествах больших, чем соответствующие патогенные бактерии;
обладают довольно ограниченной способностью к активному размножению во внешней среде;
сохраняют жизнеспособность в среде такой же период времени, как и патогенные бактерии;
устойчивость их к естественным и искусственным воздействиям не ниже, чем у соответствующих патогенных микроорганизмов;
легко и просто, в отличие от возбудителей дизентерии, тифа, паратифа, сальмонеллеза, обнаруживаются и дифференцируются;
присутствие других микроорганизмов в исследуемом объекте не влияет на их рост в элективных средах.

При оценке санитарного состояния почв учитывается общее количество БГКП (бродильный титр) и отдельно количество сапрофитных хемоорганотрофных бактерий. Чистыми считаются почвы, бродильных титр которых 1,0; слабо загрязненными – 0,1-0,01;умеренно загрязненными – 0,01-0,001; сильно загрязненными – 0,001 и более. Однако данная оценка санитарного состояния почв не является официальной. В отличие от воды, почва не имеет нормативных актов, жестко регламентирующих содержание в ней БГКП и сапрофитных микроорганизмов (Билетова, 1980).

1.5. Классификация бактерий группы кишечной палочки

Кишечным палочкам присуща изменчивость, в результат которой возникают разнообразные варианты этих бактерий. Эти особенности усложнили таксономию всей группы бактерий кишечной палочки и привели к созданию многочисленных классификаций, основанных на случайных признаках и имеющих в настоящее время лишь исторический интерес (Вольпе, 1990).

Многие ранние классификации Enterobacteriaceae учитывали случайные, не имеющие экологического и эволюционного значения признаки – подвижность, способность к сбраживанию большого числа углеводов и т.п. Многочисленные варианты бактерий, образующиеся в этой мало стабильной группе, считали самостоятельными видами и давали им особое название. Позднее были выдвинуты принципы классификации бактерий кишечной группы, основанные на экологических представлениях. Комплекс признаков был выражен формулой ЛИМАЦ (сбраживание лактозы при 44С; образование индола; интенсивность сбраживания глюкозы, определяемая реакцией с метиленовым красным; образование ацетилметилкарбинола, использование цитратных солей как единственного источника углеродного питания), которая позволяла дифференцировать фекальные типы кишечной палочки от «почвенных» (таблица 1).

Таблица 1.

Дифференциальные признаки видов санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки.

Названия родов

Названия видов

Дифференциальные признаки

Сбраживание лактозы

Образование индола

Реакции с метиленовым красным

Образование ацетилметилкарбинола

Использование цитратов

Образование H2S

Разжижение желатина

Esherichia

E. coli

E. coli var coli forne

E. coli var aurens

+/-

Citrobacter

C. freundii

C. freundii var parafreundii

C. freundii var intermedium

+/-

Enterobacter

Ent. aerogenes

Ent. aerogenes var aerogenoides

Ent. cloacae

Ent. alginlyticus

+/-

Наиболее ярко экологический подход был выражен в классификации И.Е.Мицкевича, оказавшей заметное влияние на последующее развитие таксономии бактерий группы кишечной палочки.

В 1960 г. Международным номенклатурным комитетом учреждена новая классификация семейства Enterobacteriaceae, разработанная Эвингом и Эдвардсом (Ewing&Edwards).

По классификации Эвинга и Эдвардса (Ewing&Edwards) семейство Enterobacteriaceae разделено на 4 трибы: Escherichiae, Salmonellae, Klebsielleae, Proteae. Каждая триба включает по 2-3 рода, которые в свою очередь делятся на виды. Достоинство данной классификации – распространение на семейство Enterobacteriaceae широко используемого в санитарной бактериологии комплекса ТИМАЦ с учетом некоторых дополнительных биохимических показателей (Калина, 1969).

Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечных палочек сбраживать лактозу. Этот признак был дифференцирующим при определении санитарно-показательного значения изучаемых микроорганизмов. Считалось, что лактозоотрицательные варианты отличаются от лактозоположительных тем, что средой обитания их является почва, вода, растения.

Особенностью новой классификации является игнорирование лактозного признака при дифференциации триб и ограниченное значение, придаваемому ему при межродовой дифференциации. Авторы этой классификации исходили из лабильности этого признака и целесообразности объединения микробов в один ряд на основании только отношения к лактозе (Калина, 1969).

В предложенной системе классификации предусматривается комплекс признаков, выраженный формулой ТИМАЦ, где:

Т – температурный тест. Он основан на способности сбраживать глюкозу при 44-46 градусах Цельсия;

И – тест индолообразования. Суть метода сводится к тому, что некоторые кишечные палочки способны расщеплять аминокислоту триптофан, водящую в состав белков и пептонов, с выделением ряда продуктов, в том числе индола;

М – реакция с метиленовым красным (реакция Кларка). Она служит для определения интенсивности кислотообразования при сбраживании глюкозы в питательной среде;

А – реакция на ацетилметилкарбинол. С помощью этой реакции определяют способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол;

Ц – цитратный тест. Он основан на способности некоторых видов микробов, усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде, на другие виды эти вещества действуют угнетающе.

Позже для дифференциации были положены дополнительные признаки – уреазная активность (способность расщеплять мочевину), образование сероводорода, оксидазная активность.

Наиболее распространенные культуры БГКП можно дифференцировать, используя Таблицу 2.

Таблица 2.

Основные дифференциальные признаки родов санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки.

Признак	Escherichia	Citrobacter	Enterobacter
Температурный	-	+	+
Образование индола	+	+/-	+
Реакция с метиленовым красным	+	+	-
Образование ацетилметилкарбинола	+/-	-	+
Цитратный	-	+	+
Образование H2S	-	+	-
Уреазная активность	+	-	-

Определитель бактерий Берджи девятое издание (38, 1997), содержит сведения по идентификации бактерий, в частности бактерий группы кишечной палочки.

Определитель бактерий Берджи предназначен для идентификации бактерий по фенотипическим признакам. Это издание создается в практических целях и не претендует на эволюционизм и формально таксономические построения.

Девятое издание Определителя бактерий Берджи, по-видимому, завершает период определения бактерий на основании морфологических и физиологических признаков. Сейчас идентификация бактерий развивается на основе использования молекулярно-генетических методов (нуклеотидный состав ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот и т.д.) и анализ фрагмента гена 16S рРНК.

рРНК – древняя молекула, консервативная по своей структуре и имеющая строго определенные размеры 1400-1500 н.п. Нуклеиновые последовательности также консервативны и неизменны в пределах царства прокариот. рРНК легко выделяются, ее содержание в клетке значительно. Ген представлен несколькими копиями. Например, у E. coli 7 копий. Число генов, кодируемых высокомолекулярной рРНК от 7 у E. сoli до 200 у низших эукариот (микроскопических грибов) и нескольких сотен у высших эукариот. Гены рРНК устойчивы к антибиотикам, что также используется при идентификации. Таким образом, метод анализа гена 16S рРНК в определенной мере отражает эволюционные отношения между организмами. В девятом издании Определителя бактерий Берджи, завершающего определение бактерий на основании морфологических и физиологических признаков, бактерии группы кишечной палочки помещают в группу 5, подгруппу 1, семейство Enterobacteriaceae.

Эта группа грамотрицательных бактерий включает традиционные семейства Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae. Бактерии имеют вид прямых палочек, кроме представителей рода Vibrio, для которых характерна изогнутая или вибриоидная форма. Организмы данной группы могут встречаться как свободноживущие или в ассоциациях с хозяевами – животными или растениями. Многие виды патогенны для человека и животных, а некоторые для насекомых и растений.

Подгруппа 1. Семейство Enterobacteriaceae.

Прямые палочки, обычно 0,3-1,8 нм. По Граму окрашиваются отрицательно (рис. 2). Подвижные за счет перитрихиальных жгутиков или неподвижные. Факультативные анаэробы, хеморорганотрофы, обладающие и дыхательными, и бродильными типами метаболизма. Оптимальная температура 30-37 градусов Цельсия. D-глюкозу и другие углеводы катаболизируют с образованием кислоты, а многие видв, кроме того, и газа. Оксидазоотрицательные и кталазоположительные, за исключением Shigella dysenteriae. Все представители восстанавливают нитраты в нитриты, за исключением Arsenophorus, ряда видов Erwinia, большинства видов Xenirhabdus и некоторых штаммов Klebsiella pneumonia sub ep ozaenae, Pantoea, Yersinia. Распространены повсеместно. Присутствуют в почве, воде, на фруктах, овощах, зерне, цветковых растениях и деревьях, у животных (от червей и насекомых до млекопитающих) и человека.

РИС. 2. Семейство Enterobacteriaceae.

Входящие в эту группу микроорганизмы весьма разнообразны по особенностям экологии, кругу хозяев, а также патогенности для человека и животных, насекомых и растений. Ряд видов вызывает желудочно-кишечные заболевания, включая тиф и бактериальную дизентерию. Большинство видов может вызывать разнообразные внекишечные инфекции, такие как бактеремия, менингит, а также инфекции мочевыводящих путей, дыхательных путей и раневые инфекции. Бактерии семейства Enterobacteriaceae служат причиной 50% случаев внутрибольничных инфекций, наиболее часто их вызывает Escherichia coli, представители родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Providencia,Serratia marcescens.

Семейство Еnterobacteriaceae включает в себя 30 родов (таблица 3).

Таблица 3

Классификация семейства Enterobacteriaceae (по Определителю бактерий Берджи, 1997)

Род	Типовой вид	Примечание
Arsenophonus	Arsenophonus nasoniae	Встречается у самок ос
Budvicia	Budvicia aquatia	Выделены из пресной воды, кала человека и животных
Buttiauxella	Buttiauxella agrestis	Выделены из пресной воды
Cedecea	Cedecea davisae	Источник выделения клинический материал, причем более 50% штаммов выделено из дыхательных путей
Citrobacter	Citrobacter freundii	Встречаются в фекалиях человека и животных, в почве, воде, сточных водах и пищевых продуктах. Выделяют из клинического материала как возбудителей оппортунистических инфекций
Edwardsiella	Edwardsiella tarda	Встречаются в кишечнике пойкилотермных животных и в их среде обитания, особенно в пресной воде, но обнаружены также и у гомойотермных животных и человека
Enterobacter	Enterobacter cloaceae	Широко распространены в природе, встречаются в почве, воде, сточных водах, на растениях, овощах, а также в фекалиях человека и животных.
Edwinia	Edwinia amylovora	Ассоциированы с растениями, очень редки у человека
Escherichia	Escherichia coli	Встречается в нижнем отделе кишечника у гомойотермных животных, а в случае E. Blatte – у тараканов
Ewingella	Ewingella americana	Источник выделения – клинический материал, наиболее часто в мокроте, ранах и крови
Hafnia	Hafnia alvi	Встречаются в фекалиях человека и животных, в т.ч. птиц, сточных водах, почве, воде и молочных продуктах
Klebsiella	Klebsiella pneumoniae	Встречаются в фекалиях человека и клиническом материале, почве, воде, зерне, на фруктах, овощах
Kluyvera	Kluyvera ascorbata	Встречаются на пищевых продуктах, в сточных водах и клиническом материале (мокрота, фекалии, реже в крови)
Leclercia	Leclercia adecarboxylata	Встречаются в клиническом материале, чаще всего в мокроте и крови, а также на пищевых продуктах, воде и других природных источниках
Moellerella	Moellerella wisconsensis	Встречаются в кале человека и в воде
Morganella	Morganella morganii	Встречаются в фекалиях человека, собак, других млекопитающих и рептилий
Obesumbacterium	Obesumbacterium proteus	Встречаются как примесь в пиве
Pantoea	Pantoea agglomerans	Выделены с поверхности растений, семян, из почвы, а также из ран, крови и мочи человека и животных
Pragia	Pragia fontium	Встречаются в питьевой воде, один штамм выделен из кала человека
Proteus	Proteus vulgaris	Встречаются в кишечнике человека и разнообразных животных, а также в навозе, почве и загрязненных водах
Providensia	Providensia al califaciens	Выделены при желудочно-кишечных расстройствах из кала; при инфекциях мочевых путей; из ран и ожогов, при бактеремии, а также из пингвинов
Rahnella	Rahnella aquatilis	Встречаются в пресной воде. Иногда источников выделения служит клинический материал. Встречаются у человека, гомойотермных и пойкилотермных животных, пищевых продуктах
Salmonella	Salmonella cholerarsuis	Встречаются в пресной воде. Иногда источником выделения служит клинический материал
Serratia	Serratia marcescens	Встречается в клиническом материале, почве, воде, на поверхности растений и других природных источниках, а также в пищевом тракте грызунов и насекомых
Shigella	Shigella dysenteriae	Возбудители кишечных инфекций у человека и приматов
Tatumella	Tatumella ptyseon	Источники выделения – клинический материал (в основном, из дыхательных путей), иногда кровь
Xenorhabdus	Xenorhabdus nematophilus	Естественные места обитания – просвет кишечника у энтомопатогенных нематод и внутренние полости тела у насекомых, инфицированных этими нематодами
Yersinia	Yersinia pestis	Встречаются в разных местах, включая человека, животных, грызунов, и птиц, а также в почве, воде, в молочных и других пищевых продуктах
Yokenella	Yokenella regensburgei	Источники выделения раны, моча, мокрота и кал человека, а также кишечник насекомых

2. СОСТОЯНИЕ ПОЧВЕННОГОПОКРОВЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ ГОРОДОВ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ В СВЯЗИ С ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СИТУАЦИЕЙ В РЕГИОНЕ

В системе взаимоотношений природа и человек городам всегда уделялось большое внимание. Однако в последнее время их техногенное давление на природную среду неизмеримо усилилось, и экологические проблемы приобрели социальное значение, поскольку они связаны с образом жизни человека и тем или иным видом производственной деятельности.

Загрязняющее влияние города столь велико, что не кончается на границе практически видимого воздействия. Города по степени детериорирующего влияния на среду далеко не одинаковы. Особенно сильное загрязнение вызывают промышленные города, в том числе и небольшие, в которых расположены химические, металлургические и нефтеперерабатывающие предприятия (Хавина, 2001).

Существуют весьма важное обстоятельство; многие города Иркутской области расположены и вблизи крупных химических комплексов (Ангарск, Саянск, Усолье-Сибирское) и алюминиевых заводов (Шелехов, Братск). В данной ситуации изменение свойств почвенного покрова неизбежно, что делает актуальным и своевременным его всестороннее изучение (Напрасникова, 2001).

Одной из важнейших экологических функций почвы является санитарная, которая может выражаться в деструкции органических остатков, подавлении развития болезнетворных бактерий, разрушении продуктов обмена живых организмов и дезинтоксикации техногенных загрязнителей (Добровольская, 1996).

Осуществление санитарной функции почвой зависит от ее механического состава, физико-химических свойств, водно-воздушного режима и жизнедеятельности почвенной биоты (Евдокимова, 1992).

Для оценки санитарной функции наиболее распространенных в городах, антропогенно измененных почв - урбаноземов, могут быть использованы количественные и качественные показатели структуры микробных сообществ (Макарова, 1999).

Как известно, в почвах наряду с природными токсическими продуктами в промышленных районах содержатся и техногенные загрязнители, разные по составу и свойствам, прямое определение каоторых весьма затруднительно. Трудности диагностики не позволяют четко их дифференцировать, показать степень и долю влияния каждого (Хазиев, 1982).

Общими наиболее значительными загрязнителями воздушной и почвенной сред промышленных городов Иркутской области являются золоотвалы, выбросы автотранспорта, и различных промышленных предприятий, продукты жизнедеятельности человека и домашних животных.

Большое количество выбросов городов Ангарск, Саянск, Усолье-Сибирское, Шелехов дает негативный эффект в районном, региональном и зачастую глобальном масштабах.

Воздушная миграция загрязнителей продолжается в других звеньях круговорота – биогенном, водном и конечно почвенном. Большинство выбросов городов проходит многозвеньевой цикл миграции. Загрязняются воздух и воды рек, разрушаются почвы. Многие растения и животные организмы, в том числе относящиеся к пищевым ресурсам, становятся накопителями металлов и стойких химических соединений, вредных для живой природы и человека.

Современный Шелехов – город с высокой концентрацией промышленных предприятий. Такие предприятия, как ИркАЗ, ТЭЦ-5, ЖБИ, кабельный, известковый, трактороремонтный завод, ухудшают экологическую ситуацию и в городе, и в его окрестностях. К тому же промышленные предприятия расположены чрезвычайно близко к жилым массивам, и, таким образом, к производственным выбросам добавляются выбросы от печей частных домов и автотранспорта, создающего на основных магистралях недопустимо высокое загрязнение воздуха выхлопными газами.

Географическое положение Шелехова оценивается экологами как крайне неблагоприятное для рассеивания выбросов. Город расположен в котловине, откуда очень трудно удаляются выбросы предприятий, как его самого, так и близлежащих Ангарска и Иркутска.

Город Шелехов входит в число наиболее загрязненных городов России, а в области по этому показателю он занимает треть место. В образцах почвы Шелехова присутствуют практически все элементы таблицы Д. И. Менделеева (Хавина, 2001).

Из химических элементов в почвах больше всего накапливается фтор – элемент первого класса опасности. Однако, в г. Шелехов в составе фторсодержащих эмиссий в большем количестве выявлены растворимые фториды и фтористый водород. Способность поглощать фтор даже у сформировавшихся здесь загрязненных почв очень высока (Макарова, 1999, Сараев, 1998).

Похожая картина наблюдается и в остальных городах Иркутской области. На территории Саянска распространены дерновоподзолистые и серые лесные почвы, в которых формируется гумусовый горизонт мощностью 5-10 см (Напрасникова, 2001).

Химическое предприятие АО «Саянскхимпром», поставляющее основной объем промышленных отходов, дает сильную техногенную нагрузку на природные комплексы. Наиболее распространенными загрязнителями на урбанизированных территориях являются: пыль поливинилхлоридов, диоксид серы, оксид углерода, окислы азота, дихлорэтан, этилен, винилхлорид. Количество выбросов в атмосферу только предприятиями Саянско-Зиминского промышленного узла достигает 45 тысяч тонн в год.

На современном этапе изучение воздействия городов на окружающую среду представляет научно-практическую проблему. При этом особенно актуально изучение влияния конкретных городов, поскольку масштабы, спектр загрязняющих эмиссий и их влияния на среду различны, а, следовательно, неодинаков и характер мероприятий по уменьшению их вредного воздействия. Отсутствие рационального подхода к сохранению окружающей среды постоянно приводит к обострению экологических проблем, затрагивающих жизненно важные интересы населения.

Таким образом, способом сохранения общества становится ориентация не столько на изменение природной среды, благоприятной для всего живого, сколько на обеспечение совместимости среды и всех направлений человеческой деятельности. Другими словами, в истории человечества наступил момент, когда решение любой социальной проблемы обусловлено задачей сохранения биосферы и ее компонентов (Марфенина, 1994).

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследования

Объектами исследования явились образцы почв урбанизированных территорий городов Иркутской области. В частности, были исследованы урбаноземы городов Ангарска, Саянска, Усолье-Сибирское и города Шелехова.

Отбор материалов проводился студентами кафедры микробиологии, проживающими в различных городах Иркутской области, в летний период 2006 г., потому что в это время года особенно интенсивно техногенное воздействие на почвенный покров города.

Пробные площадки выбирались с учетом антропогенной нагрузки, характера застройки, плотности жилых массивов, воздействия промышленных предприятий, автотранспорта. С каждой площадки размером 25 м2 отбиралось 10 проб, которые освобождались от мусора, включений; перемешивались, т.е. формировался средний образец, характеризующий территорию площадью в 10 га. Контролем служили почвы, взятые вдали от населенным пунктов в Усть-Ордынском округе.

Всего было исследовано 52 пробы урбаноземов промышленных городов Иркутской области. Выделено в чистую культуру 40 штаммов бактерий группы кишечной палочки и 75 штаммов гетеротрофных сапрофитных микроорганизмов.

Учет и идентификация микроорганизмов проводились общепринятыми микробиологическими методами (Егоров, 1976, Теппер, 2004).

3.2. Методы исследования.

Методы идентификации бактерий.

Для определения культуральных, морфологических и физиолого-биохимических признаков использовались методы, описанные в «Практикуме по микробиологии» под редакцией Егорова Н.С. (Егоров,1976).

Систематическое положение микроорганизмов устанавливали по Определителям бактерий Берджи (Хоуптон, 1980, 38).

Изучение морфологических признаков.

Форму и соединение клеток определяют при микроскопировании препаратов живых и окрашенных клеток: первые просматривались с фазово-контрастным устройством, вторые с иммерсионной системой.

Выявление подвижности клеток.

Подвижность клеток лучше всего наблюдается в препарате «раздавленная капля». Если клетки подвижны, то они оживленно перемещаются в разных направлениях в поле зрения микроскопа. С возрастом даже хорошо подвижные клетки теряют подвижность, поэтому необходимо посмотреть клетки более молодого возраста (24-часовая культура).

Следует отличать подвижность клеток от броуновского движения. Броуновское движение – это пассивное перемещение клеток в довольно узких пределах, оно особенно заметно в густых суспензиях. Если движение клеток напоминает броуновское, то, чтобы убедиться в собственной подвижности клеток, в каплю исследуемых организмов , в каплю исследуемых организмов добавляют каплю 5%-ного водного раствора фенола.

Окраска по Граму.

Все бактерии по способности окрашиваться красителями трифенилметанового ряда с йодом делятся на две большие группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый генциановым фиолетовым и йодом, удерживается при обработке их спиртом. Такие бактерии называются грамположительными. К другой группе относятся бактерии, не обладающие свойством удерживать комплекс и обесцвечивающиеся при обработке их спиртом. Их называют грамотрицательные.

На обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Их высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Мазки окрашивают в течение 1-2 минут карболовым генциановым фиолетовым, затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, обрабатывают его 1-2 минуты раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат до обесцвечивания 1 минуту 96%-ным этиловым спиртом. Затем препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 1-2 минуты фуксином. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При окрашивании грамположительные бактерии имеют сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные – красный.

Изучение культуральных признаков.

Рост на плотной среде.

Микроорганизмы, развиваясь на поверхности плотных сред, образуют характерные для данного вида колонии. Поэтому описание колоний – один из признаков, который необходим для идентификации исследуемого микроорганизма. При описании колоний отмечают следующие признаки: форму, размеры, цвет, поверхность, профиль, край колонии, структура колонии, консистенцию. В качестве плотной питательной среды обычно используют МПА.

Рост на картофеле.

Многие микроорганизмы растут на ломтиках картофеля и образуют налеты, характерные для представителей данного вида. Ломтики готовят следующим образом: картофель очищают, разрезают на дольки, погружают на час в 1%-ный раствор NaHCO3. После этого кусочки картофеля помещают в пробирки, на дно которых предварительно положена вата, смоченная водой. Стерилизуют картофель при 1,5 атм. Посев производят петлей. Отмечают рост или его отсутствие.

Рост в жидкой среде.

Для характеристики роста в жидкой среде мною был использован мясо-пептонный бульон. Рост микроорганизмов сопровождался помутнением среды, образованием пленки или осадка.

Изучение физико-химических признаков.

Использование углеводов и сахаро-спиртов.

Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы и спирты в качестве единственных источников углерода и энергии. Для идентификации большинства гетеротрофных микроорганизмов, необходимо определить какие углеводы и спирты обеспечивают рост изучаемого организма, и какими изменениями среды сопровождается его рост.

Как правило, используют следующие углеводы: арабинозу, глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу, и спирты – глицерин и маннит. Углеводы и спирты добавляют к основному фону среды в количестве 1 г основной фон готовят на водопроводной воде; он включает 0,5 г пептона и 0,1 г K2HPO4. Чтобы обнаружить изменения рН, к среде добавляют индикатор – бромтимолблау – из расчета 2 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л среды. При рН 6,0 индикатор имеет желтый цвет, а при рН 7,6 синий. Чтобы обнаружить образование газа, в среду опускают поплавки. Пробирки с поплавками стерилизуют при 1 атм. Все среды с углеводами и спиртами засеивают одновременно 1 мл суспензии клеток и ставят в термостат. Если изучаемый микроорганизм развивается быстро, то результат можно регистрировать через 48-96 часов, а если медленно – через 7-10 суток.

Визуально по помутнению среды, образованию пленки, осадка отмечают рост или его отсутствие на всех используемых средах. Отмечают изменение цвета индикатора и делают заключение о том, чем сопровождается использование субстратов: подкислением или подщелачиванием среды, или изменение рН среды не происходит. О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.

Образование ацетилметилкарбинола.

Этой способностью обладают микроорганизмы, сбраживающие глюкозу с образованием кислот, которые в дальнейшем участвуют в биосинтезе нейтральных продуктов – ацетилметилкарбинола, диацетила, 2,3-бутиленгликоля.

Используя среду состава: глюкозу 1,0 г, пептон 0,5 г, K2HPO4 0,1 г, вода. Среду разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 0,5 атм и засевают культурами микроорганизмов. Продолжительность культивирования 7-10 дней. После окончания культивирования к 2 мл культуры добавляют 1 мл 10%-ного раствора КОН и энергично встряхивают на воздухе. Если организм образует ацетоин, то начинает медленно развиваться окраска; через 18-24 ч наблюдается интенсивное красное окрашивание.

Гидролиз крахмала.

Гидролиз крахмала осуществляется микроорганизмами, образующими амилазу и использующими пролукты гидролиза крахмала как источник углерода и энергии. Для выявления этой способности используют среду следующего состава: пептон 1,0 г, K2HPO4 0,5 г, растворимый крахмал 0,2 г, агар-агар 1,5 г; рН среды 6,8-7,0. Среду стерилизуют при 1 атм и разливают по чашкам Петри. Когда среда застынет, делают посев штрихом по диаметру чашки. Продолжительность культивирования 7-10 дней. Гидролиз крахмала обнаруживают по зоне просветления среды вдоль штриха. Особенно четко она видна после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Так как йод – индикатор на крахмал, то вся среда окрашивается в синий цвет, за исключением зоны гидролиза крахмала, которая остается бесцветной или может приобрести красно-бурую окраску, если крахмал гидролизуется до декстрина.

Разжижение желатина.

Разжижать желатину способны микроорганизмы, выделяющие в среду протеолитические ферменты. Для выявления этой способности, исследуемый организм высевают на мясо-пептонную желатину (МПЖ), приготовленную следующим образом: к мясо-пептонному бульону (МПБ), состоящему из мясной воды, NaCl 0,5г, пептон 1,0 г, добавляют 10-15 г желатины. Оставляют на 20-30 мин, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на водной бане до полного растворения желатины и разливают полученную МПЖ в пробирки по 8-10 мл. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования 7-10 дней при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально.

Образование аммиака.

Образование аммиака свойственно микроорганизмами, дезаминирующим аминокислоты. Эту способность микроорганизмов выявляют при их росте в МПБ. Для этого МПБ разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 1 атм и засевают клетками изучаемого организма. Образование аммиака обнаруживают по изменению лакмусовой бумаги. Для этого после посева помещают в пробирку над средой стерильную полоску красного лакмуса, зажимая ее между пробкой и горлышком пробирки, пробку пробирки заворачивают целлофаном. При образовании аммиака полоска красного лакмуса синеет.

Образование индола.

Многие микроорганизмы в процессе развития образуют из триптофана индол, тогда как другие этой способностью не обладают. МПБ с 0,01 г триптофана разливают по пробиркам, стерилизуют при 0,5 атм и засевают клетками изучаемого организма. Через 5-7 суток после посева на поверхность среды, не перемешивая, вносят 1-3 мл реактива Эрлиха; появление красной окраски свидетельствует о наличии индола.

Образование сероводорода.

Образование сероводорода свойственно микроорганизмам, использующим в процессе метаболизма серосодержащие аминокислоты (цистеин, цистин, метионин). Эту способность выявляют при выращивании микроорганизмов в МПБ, разливают в пробирки по 8-10 мл в каждую, стерилизуют при 1 атм и засеивают клетками изучаемого организма. После посева над средой помещают полоску бумаги, пропитанную раствором уксусного свинца, зажав ее между пробкой и горлышком пробирки. Пробку пробирку заворачивают целлофаном, чтобы затруднить улетучивание сероводорода. Продолжительность культивирования 7-10 дней. Выявление сероводорода при развитии микроорганизмов в МПБ обнаруживают по почернению бумаги вследствие образования сульфида свинца.

Восстановление нитратов.

Восстанавливать нитраты до нитритов способны микроорганизмы, образующие ферменты нитратредуктазу и использующие нитраты в качестве источника азота. Способность к восстановлению нитратов выявляют на среде, состоящей из МПБ и 0,2 г KNO3. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Среду засеивают клетками изучаемого организма, выдерживают в термостате 7-10 дней. Нитриты обнаруживают реактивом Грисса, т.к. в кислой среде в присутствие нитритов и ароматических аминов образуется азотсоединение, окрашенное в красно-розовый цвет. Для выполнения реакций к капле реактива Грисса добавляют каплю культуры. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

Рост на синтетической среде.

На синтетической среде растут микроорганизмы, которые в качестве источника азота используют азот минеральных солей и не требуют внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста. Эту способность выявляют на среде состава: глюкоза 3,0 г, NH4NO3 0,3 г, KH2PO4 0,1 г, K2HPO4 0,1 г, MgSO4 0,05 г, NaCl 0,05 г, CaCO3 0,5 г, FeSO4 следы, агар-агар 15 г, вода. Разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм и после стерилизации скашивают. Посев проводят штрихом, продолжительность культивирования 7-10 дней. После этого визуально отмечают рост или его отсутствие.

Воздействие на молоко.

Молоко содержит углеводы (лактозу), белки (казеин), витамины, минеральные соли, поэтому многие микроорганизмы хорошо растут на молоке. Рост микроорганизмов в молоке может быть связан со сбраживанием лактозы, протеолизом казеина или с двумя этими процессами одновременно. Для определения воздействия микроорганизмов на молоко поступают следующим образом молоко обезжиривают сепарированием или центрифугированием в течение 15 мин при 2-3 тыс. об/мин. Обезжиренное молоко разводят водой в соотношении: 4 части молока + 1 часть воды, добавляют индикатор бромкрезолпурпур (2 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л молока), разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм. Результаты воздействия микроорганизмов на молоко регистрируют спустя 6-14 суток после посева.

Использование лактозы с образованием кислот отмечают по изменению цвета индикатора. Если степень подкисления достаточно велика, наблюдается коагуляция казеина (образование сгустка), часто сопровождаемая отделением сыворотки. Образование углекислоты хорошо видны по сгустку, который в этом случае пронизан пузырьками. Воздействие микроорганизмов на казеин молока тоже вызывает коагуляцию, но она имеет место при нейтральной или слабощелочной реакции среды и является результатом образования микроорганизмами казеинолитических ферментов. При высокой активности этих ферментов отмечается просветление молока, называемое пептонизацией, что связано с протеолизом казеина.

Отношение к кислороду.

Потребности микроорганизмов в свободном кислороде достаточно разнообразны. По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на 4 большие группы: облигатные анаэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации ограничиваются наблюдением роста изучаемого организма после посева уколом в агаризованную среду или после посева в расплавленную агаризованную среду. Строгие аэробы растут на поверхности среды и в самом верхнем его слое, микроаэрофилы – на некотором расстоянии от поверхности среды, факультативные анаэробы развиваются во всей толще среды, облигатные анаэробы развиваются во всей толще среды, облигатные анаэробы только в глубине среды.

Каталазная активность.

Она свойственна большинству аэробных микроорганизмов. Облигатные анаэробы и микроаэрофилы каталазу не образуют. Каталаза разлагает перекись водорода с образованием кислорода в соответствии с реакцией:

Н2О2 = Н2О + О2.

Каталазную активность выявляют следующим образом. Исследуемый микроорганизм выращивают на поверхности плотной среды. Наносят каплю 10%-ного раствора Н2О2 на колонию или суспензируют клетки исследуемого микроорганизма в небольшом объеме этого раствора. Выделение кислорода хорошо заметно по образованию пузырьков газа, свидентельствует о наличии в клетках каталазы.

Отношение к концентрации хлористого натрия.

Большинство бактерий чувствительны к концентрации солей в среде. Однако устойчивость различных видов бактерий к этому фактору заметно варьирует. Большую или меньшую чувствительность бактерий к концентрации соли в среде оценивают по их способности расти в МПБ с 2,5% и 6,5% NaCl. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1,0 атм. Через 6-10 суток после посева регистрируют рост микроорганизмов и его интенсивность или отсутствие роста.

Оксидазная активность.

Этот тест используют обычно для дифференциации представителей рода Pseudomonas от других палочковидных бактерий, не окрашивающихся по Граму.

Для определения оксидазной активности наносят несколько капель 1%-ного раствора тетраметил-р-фенилендиамина на колонию в чашки Петри. Колонии организмов, обладающих оксидазной активностью, приобретают красную окраску, которая через 10-30 мин переходит в черную.

Методы выделения и идентификации бактерий группы кишечной палочки.

Для учета бактерий группы кишечной палочки различные разведения почвы по 1 мл засеивают в среду Кесслер (определяет бродильный титр). В состав среды Кесслер входит: пептон 10г, желчь 50 мл, лактоза 10 г, 1%-ный водный раствор генциана фиолетового 4 мл, вода. Среду разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют. Посев проводят из разведений 1:10, 1:100, 1:1000, и исходную почву (1 г). Пробирки с засеянной средой Кесслер помещают в термостат при 37С, ингибируют 24 часа. По истечению срока культивирования учитывают результаты посевов. Помутнение среды с образованием кислоты и газа является положительным результатом на наличие БГКП. Из пробирок, в которых наблюдается брожение, делаем высев на среду Эндо.

Среда Эндо состоит из: МПА 100 мл, лактоза 1 г, вода, фуксин 1 мл, раствор сульфида натрия. Посев проводят с таким расчетом, чтобы получились отдельные колонии. Чашки с посевом помещают в термостат при 37С на 18-24 часа. При наличии на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных с металлическим блеском, розовых, бледно-розовых) их описывают и изучают.

Из суточной культуры микроорганизмов готовят препараты: «раздавленная капля» для определения подвижности клетки, фиксированный препарат окрашивают по Граму, для описания морфологических признаков. Для изучения физиолого-биохимических признаков используют тесты ТИМАЦ и некоторые дополнительные тесты.

ТИМАЦ:

Температурный тест (рост на среде с глюкозой при температуре 44С). Среда состоит из: ПЕПТОН 10 Г, NaCl 5 г, глюкоза 10 г, вода. Разливают среду в пробирки с поплавками, стерилизуют. Вносят одну петля культуры с изолированной колонии в среду с глюкозой. Посевы поставить в термостат при указанной температуре на 48 часов. Рост на этой среде может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов, газа. Образование кислот регистрируют по изменению активной кислотности (рН) среды, образование газа – вытеснению среды из поплавков. Термотолерантные колиформные бактерии, свидетельствующие о свежем фекальном загрязнении, дают положительную реакцию.
Образование индола (способность расщеплять триптофан). В приготовленную среду внести 1 каплю БГКП и поставить в термостат при 37С на 48 часов.
Реакция с метиленовым красным (реакция Кларка). Реакция показывает интенсивность кислотообразования при сбраживании глюкозы. Среда Кларка следующего состава: пептон 0,2 г, K2HPO4 0,03 г, агар-агар 0,3 г, 1%-ный водный раствор бромтимолблау 0,3 мл, глюкоза 1 г, вода. В приготовленную среду Кларка внести 1 петлю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37С на 48 часов. После культивирования к среде добавить несколько капель индикатора метиленового красного. При рН 5,0 и ниже индикатор изменяет цвет на красный.
Образование ацетилметилкарбинола. В приготовленную среду внести 1 каплю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37С 48 часов.
Цитратный тест. Основан на способности некоторых микроорганизмов усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде, в то время как на другие микроорганизмы эти вещества действуют угнетающе. Для цитратотрицательных разновидностей характерно отсутствие роста и изменения цвета среды. В приготовленную среду Козера (K2HPO4 1 г, MgSO4 0,2 г, натрий аммоний фосфорнокислый 1,5 г, лимоннокислый натрий 2,5-3,0 г, бромтимоловый синий 10 мл) внести 1 каплю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37С 48 часов.

Дополнительный тесты:

Уреазная активность (способность расщеплять мочевину). В приготовленную среду (МПБ +2 г мочевины) внести 1 каплю изучаемых микроорганизмов и выдержать в термостате при 37С 48 часов. Способность расщеплять мочевину обнаруживают при добавлении фенолфталеина, при положительной реакции среда окрашивается в ярко-оранжевый цвет.
Образование сероводорода БГКП изучают при посеве в пробирки с 2%-ной пептонной водой и полосками фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. Культивируют в термостате 3 суток при 37С.
Оксидазная активность.

К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу и манит (или глюкозу), при 37С в течение 24 часов.

Для учета лактозоположительных форм можно использовать среды Эндо и Кесслер, содержащие лактозу. Прописи сред приведены выше. Можно использовать подтверждающую жидкую среду, содержащую лактозу, приготовленную также как среды с глюкозой.

При идентификации бактерий группы кишечной палочки, кроме определителей бактерий Берджи (Хоуптон, 1980, 38) нами использовались другие литературные источники: «Санитарная микробиология» (21), «Санитарная микробиология почвы» (Мишустин, 1979).

Из-за отсутствия в настоящее время нормативной документации по методам санитарно-микробиологического анализа почвы, использованы рекомендации, изложенные в «Руководстве по санитарной охране почвы» (Лоранский, 1972) и «Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы» (МУК, 1999).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Количественный состав гетеротрофных сапрофитных бактерий, как показатель санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

Количественный и качественный состав микробного сообщества урбаноземов изучался сразу после взятия образцов в асептических условиях. Образцы отбирались студентами-микробиологами, проживающими на территории Иркутской области во время летней учебно-производственной практики в период 2006 г., а также же лично старшим научным сотрудником Института географии СО РАН Напрасниковой Е.В., за что выражаем им глубокую признательность.

Результаты определения количественного состава гетеротрофных сапрофитных бактерий, как показателя санитарного состояния урбаноземов промышленных городов Иркутской области, приведенеы в таблице 4.

Результаты количественного анализа параллельных высевов обработаны математически, согласно указаниям Гречушкиной Н.Н. с соавторами, приведенным в «Практикуме по микробиологии» (Егоров, 1976).

Таблица 4.

Количественный состав гетеротрофных сапрофитных бактерий в урбаноземах промышленных городов Иркутской области.

№ образца	Место взятия образца	МПА, млн. КОЕ/г почвы
	г. Ангарск
1а	ж/д вокзал, рядом с тропинкой. Травянистый покров, тополь, сосна.	1,0±0,06
2а	Центральный парк имени Ленина, скошенная лужайка. Скошенный травянистый покров.	0,9±0,06
3а	Швейная фабрика; остановка трамвая; много мусора; газон. Разнотравье.	1,56±0,06
4а	29 м/н; открытая местность, жилой квартал из девятиэтажных домов, замусорено. Разнотравье.	1,8±0,1
6а	Жилой массив у трамвайной линии. Полынь, тысячелистник, мятник.	0,7±0,09
8а	Трамвайное кольцо. Клён, тополь, доминирует полынь.	1,2±0,06
Продолжение таблицы 4
10а	12 м/н; жилой квартал пятиэтажных домов, много гравия. Разнотравье.	0,19±0,01
14а	Частный сектор; гаражи. Доминирует полынь, подорожник.	0,95±0,06
20а	Химический комбинат; 12 км от автотрассы, грунтовая дорога. Разнотравье.	0,7±0,09
23а	Старая АЗС. Клён, мощный травяной покров, люцерна. Злаки. полынь.	0,6±0,09
г. Усолье-Сибирское
1у	Московский тракт; АЗС на въезде в Усолье-Сибирское со стороны Черемхово.	0,03±0,006
2у	Картофельное поле, напротив Т1.	0,04±0,006
3у	Придорожный лес; 30 метров от тракта, 100 м от трубы химпрома.	0,8±0,09
4у	Торговая точка; магазин, отдельный жилой дом.	0,75±0,09
5у	Частный сектор; от дороги 8 м.	1,0±0,06
6у	Жилой массив; напротив стадион, около подъезда дома.	0,5±0,02
7у	Стадион. Вокруг территории асфальт, проба взята с газона, 18 м от дороги. Почва сухая.	0,73±0,09
9у	Недалеко от АЗС, 15 км от тракта. Почва задернована, пронизана корнями.	3,6±0,06
10у	Жилой массив, старые двухэтажные дома, строительный мусор.	0,5±0,02
14у	Остановка трамвая. Сквер, травянистый покров, много песка.	0,94±0,06
15у	Гаражи, мусор.	1,2±0,06
16у	Склон оврага, 100 м от частного чектора.	1,9±0,1
17у	Парковая зона (центр города).	1,4±0,06
18у	Больница, 12 м от дороги, замусорено.	0,66±0,09
19у	Промышленная зона, клевер, донник.	0,5±0,02
20у	Жилой массив двухэтажных домов, внутри квартала.	0,2±0,01
21у	Перекресток, светофор. Торговый комплекс, мусор.	0,2±0,01
22у	Частный сектор, водоколонка	1,7±0,1
г. Саянск
Ic	Въезд в город, газон.	0,16±0,01
IIc	Жилой массив, мало растений.	0,14±0,01
IIIc	Химпром, мало растений.	0,12±0,003
1c	Автовокзал.	0,1±0,003
2c	Около мэрии города.	0,06±0,003
3c	Приусадебные участки, деревянный сектор.	0,19±0,01
4c	Сквер, тропа.	0,2±0,01
5c	Теплорасса.	0,11±0,003
6c	ТЭЦ.	0,1±0,003
7c	Дачный участок.	0,16±0,01
8c	Химпром, столовая.	0,09±0,003
9c	Химпром, цех №22 «Каустик».	0,084±0,003
10c	Химпром, цех №21 «Ртуть».	0,09±0,003
г. Шелехов
1ш	Квартал №3.	0,43±0,02
Продолжение таблицы 4
2ш	Пос. Ленина, разнотравье.	0,94±0,06
3ш	ИрКАЗ	0,069±0,003
4ш	Детский сад	0,06±0,003
5ш	Автобусная остановка.	0,8±0,09
7ш	Улица Ленина	0,1±0,003
8ш	Место выгула собак.	0,02±0,006
9ш	Автомагистраль	0,18±0,01
12ш	Посев овса	0,1±0,003

Результаты таблицы 4 свидетельствуют о том, что наибольшее количество гетеротрофных сапрофитных бактерий обнаружено в урбаноземах городов Усолье-Сибирское и Ангарск. В отдельных пробах (жилые массивы, а особенно частный сектор, трамвайные и автобусные остановки, парковые зоны) количество бактерий образующих колонии на МПА достигало 1,6-1,9 млн. КОЕ/г почвы. Эти показатели превышали количество гетеротрофных сапрофитных бактерий в контрольных зональных почвах. В пробах из Усть-Ордынского округа количество бактерий было 1,5 млн. КОЕ/г почвы. Этот факт мы объясняем тем, что в урабноземах Ангарска и Усолье-Сибирское достаточный привнос органических веществ за счет бытовых выбросов и фекальных загрязнений. По количественному составу бактериального комплекса урбаноземы можно оценить как умеренно загрязненные.

В урбаноземах Саянска и Шелехова наблюдается совершенно иная картина. Количество сапрофитных гетеротрофных бактерий даже в наиболее загрязненных участках (жилые массива, автобусные остановки, места выгула собак, посевы культурных растений) не превышали в основном 0,1-0,2 млн. КОЕ/г почвы. Этот факт мы объясняем не только более высокой санитарной культурой населения или более высоким уровнем санитарно-гигиенических мероприятий в этих городах, но и ингибирующим воздействием токсических выбросов расположенных в городе Шелехове алюминиевого завода и химпрома в городе Саянске. Это подтверждается цифрами, приведенными в таблице 4. Урбаноземы, прилежащие к Саянскому ХимПрому, содержат 0,09±0,08 млн. КОЕ/г почвы, т.е. в сотни раз меньше, чем в урбаноземах Усолья-Сибирского и Ангарска.

4.2. Качественный состав бактериального комплекса урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

Микробиоценозы различных почв, т.е. сообщества микроорганизмов, состоящие из функционально взаимосвязанных, немногих или многих видов, характеризуются определенным не только количественным, но и качественным составом.

Для проведения научной классификации (таксономии) бактерий мы пользовались Определителем бактерий Берджи (23, 38).

После изучения морфологических, тинкториальных, культуральных и некоторых физиолого-биохимических признаков была установлена родовая принадлежность доминирующих форм бактерий.

Доминирующие формы бактерий отсевали на косяки МПА. Для идентификации были отобраны культуры хемоорганотрофных бактерий, доминирующих на мясо-пептонном агаре.

В результате проведенных исследований доминировали представители родов Bacillus, Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus, принадлежащие к царству прокариот и согласно Определителю бактерий Берджи (38) категории I «Грамотрицательные бактерии, имеющие клеточную стенку» (род Pseudomonas); категории II «Грамположительные бактерии, имеющие клеточную стенку» (род Bacillus, Mycobacterium, Micrococcus). Представителей III категории «Бактерий, лишенных клеточной стенки (микоплазм)» и IV категории «Архебактерий», обнаружить нашими методами исследований не удалось, хотя известно широкое распространение архебактерий в почве.

Бактерии рода Bacillus, относящиеся к группе 18 «Грамположительные палочки и кокки», образующие эндоспоры, характеризовались следующими признаками: по морфологии – это прямые палочки с закругленными концами в парах или коротких цепочка. Подвижные. Эндоспоры овальные, не более одной в клетке. Бактерии каталазо- и оксидазоположительные. Факультативные анаэробы, мезофиллы. Нитраты в нитриты восстанавливали, желатину разжижали, молоко пептонизировали. После 10-минутного прогревания при 80С культуры давали рост на мясо-пептонном агаре, благодаря терморезистентности эндоспор.

Бактерии рода Pseudomonas, относящиеся к группе 4 «грамотрицательные аэробные палочки и кокки», представляли собой прямые, подвижные палочковидные клетки. Бактерии каталазо- и оксидазоположительные. На мясо-пептонном агаре росли в виде голубоватых, флюоресцирующих колоний с диффундирующим пигментом. Факультативные анаэробы. Нитраты в нитриты восстанавливали, желатину разжижали, молоко пептонизировали.

Для представителей рода Mycobacterium, относящихся к группе 21 «Микобактерии», было характерно наличие в микроскопических препаратах слегка изогнутых, слабо грамположительных палочек, неподвижных, неспоробразующих. По Граму клетки окрашивались с трудом. Видимые глазом колонии (желтые, белые, рыжевато-коричневые, редко розовые появились лишь через 10 суток из-за медленного роста бактерий. Пигмент не диффундировал в питательную среду. Поверхность колоний была шероховатая, складчатая, матовая. Проба на каталазу и оксидазу положительная. Аэробы. Нитраты в нитриты восстанавливали, желатину разжижали, молоко подщелачивали, придавая ему грязноватый, жето-коричневый цвет.

Бактерии рода Micrococcus, относящиеся к группе 17 «Грамположительные кокки», обладали сферической формой клеток, не образовывали спор, были неподвижными, клетки в пространстве располагались в виде скоплений неправильной формы. Культуры давали положительную реакцию на каталазу и оксидазу. На мясо-пептонном агаре вырастали в виду сочных, круглых, приподнятых блестящих колоний белого, реже оранжевого цвета. Желатину не разжижали или разжижали медленно и поверхностно, нитраты не редуцировали. По отношению к кислороду вели себя как факультативные аэробы.

В результате идентификации гетеротрофных сапрофитных бактерий к роду Bacillus отнесены 52 штаммы. Бациллы доминировали в бактериоценозах Ангарска, Саянска, Шелехова и Усолья-Сибирского.

К роду Pseudomonas отнесено 10 штаммов, к роду Mycobacterium – 8 штаммов, выделены они, в основном, из урбаноземов Усолья-Сибирского и Ангарска.

Бактерии рода Micrococcus обнаружены лишь в 5 штаммах в городе Усолье-Сибирское.

В урбаноземах городов Шелехова и Саянска микрококки встречались спорадически. Это свидетельствует о том, что наиболее устойчивыми к техногенным воздействиям оказались бакетрии рода Bacillus, так как они обладают способностью образовывать стойкие к экстремальным условиям эндоспоры.

Санитарно-показательные бактерии урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Идея использования кишечной палочки, постоянно обитающей в кишечнике человека, для характеристики санитарно-гигиенического состояния внешней среды принадлежит Массе.

До настоящего времени санитарно-показательные бактерии группы кишечной палочки (БГКП) используются, как косвенные показатели возможного обсеменения исследуемых объектов патогенными микробами кишечного происхождения.

В фекальных массах, поступающих в городские и прилегающие к ним почвы, могут содержаться болезнетворные микробы – возбудители дизентерии, сальмонеллеза, холеры и другие. Одним из направлений санитарно-микробиологического контроля за состоянием почвы является определение титра санитарно-показательных бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Являясь типичным обитателем кишечника человека и домашних животных, указанные микроорганизмы выделяются с фекальными массами во внешнюю среду и обладают ограниченной способностью к размножению в почве. Длительность сохранения цитратотрицательной кишечной палочки в почве совпадает с такими же свойствами патогенных бактерий. Они легко дифференцируются, встречаются в организме хозяина и в почве значительно большем количестве, чем патогенные бактерии. Чистым зональным почвам, удаленным от населенных пунктов, БГКП, свидетельствующие о свежем фекальном загрязнении, как правило, не свойственны. Резкое увеличение их численности в урбаноземах и прилегающих к ним территорий косвенно может свидетельствовать о санитарно-гигиеническом и эпидемиологическом неблагополучии территории.

Краткий санитарно-микробиологический анализ почвы, кроме определения общего количества сапрофитных бактерий, включает определение титра бактерий группы кишечной палочки.

Титром кишечной палочки принято называть то наименьшее весовое количество почвы, в котором находят кишечную палочку.

При анализе суспензии мы использовали суспензии ее в разведении от 1:101 до 1:105, которые высевали по 1 мл в 9 мл среды Кесслер с глюкозой и поплавками (первичная бродильная проба). После культивирования при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов при наличии помутнения и газообразования проводили высев на среду Эндо с лактозой с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии (рис. 3).

РИС. 3. Колонии БГКП на среде Эндо.

Типичные для кишечной палочки розовые с красным центром или красные с металлическим блеском колонии отсевали на глюкозо-пептонную среду с поплавками и культивировали при 44 градусах Цельсия 24 часа (вторичная бродильная проба), позволяющая выявить свежие фекальные загрязнения, типичные для кишечной палочки, на косяки мясо-пептонного агара для последующей идентификации бактерий.

Оценку санитарного состояния по титру кишечной палочки проводили по схеме Мишустина Е.Н., Перцовской М.И. (Мишустин, 1979), т.к. утвержденных нормативов, которые служили бы критерием для оценки санитарно-микробиологического состояния почвы, в доступной нам литературе не обнаружено.

В результате проведенных исследований установлено, что урбаноземы городов Ангарск, Шелехов, Саянск в большей степени соответствуют санитарно-гигиеническим нормам и являются слабо или практически незагрязненными БГКП. В большинстве случаев кишечная палочка не обнаруживалась. В местах традиционного загрязнения объектов окружающей среды продуктами метаболизма человека и домашних животных титр БГКП был незначительным. Он не превышал 0,1 в районах детских площадок, автобусных остановок, в местах выгула собак.

Иная картина наблюдалась в Усолье-Сибирском. Титр кишечной палочки колебался от 0,01-0,001 в зависимости от места отбора проб. Скорость роста кишечной палочки в среде Кесслер – 18-24 часа, т.е. в два раза быстрее, чем в пробах урбаноземов других городов.

Этот факт мы объясняем, как и в случае с гетеротрофными сапрофитными бактериями, не только более высокой санитарной культурой населения или более высоким уровнем санитарно-гигиенических мероприятий в гг. Шелехов, Саянск, Усолье-Сибирское, но и ингибирующим воздействием токсических выбросов расположенных в этих городах химических предприятий на кишечную палочку – основной санитарно-показательный микроорганизм (МУК, 1999).

Таблица 5.

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Ангарска.

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
1а	ж/д вокзал , рядом с тропинкой. Травянистый покров	0,1	-	Слабое загрязнение
2а	Центральный парк имени Ленина; скошенная лужайка. Скошенный травянистый покров	0,01	-	Умеренное загрязнение
3а	Швейная фабрика; остановка трамвая, много мусора; газон. Разнотравье	0,01	-	Умеренное загрязнение
4а	29 м/н; открытая местность; жилой квартал из девятиэтажных домов; замусорено. Разнотравье	0,1	-	Слабое загрязнение
6а	Жилой массив у трамвайной линии. Полынь. Тысячелистник, мятник	0,1	-	Слабое загрязнение
8а	Трамвайное кольцо. Клен, тополь, доминирует полынь.	0,001	+	Слабое загрязнение
10а	12 м/н; жилой квартал пятиэтажных домов; много гравия. Разнотравье.	0,1	-	Слабое загрязнение
14а	Частный сектор; гаражи. Доминирует полынь, подорожник	0,1	-	Слабое загрязнение
Продолжение таблицы 5
20а	Химический комбинат; 12 км от автотрассы; грунтовая дорога. Разнотравье	0,1	-	Слабое загрязнение
23а	Старая АЗС. Клен, мощный травяной покров, люцерна, злаки, полынь	0,01	-	Умеренное загрязнение

Таблица 6.

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Усолье-Сибирское

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
1у	Московский тракт; АЗС на въезде в Усолье-Сибирское со стороны Черемхово.	0,1	-	Слабое загрязнение
2у	Картофельное поле, напротив Т1.	0,01	-	Умеренное загрязнение
3у	Придорожный лес; 30 метров от тракта, 100 м от трубы химпрома.	0,01	-	Умеренное загрязнение
4у	Торговая точка; магазин, отдельный жилой дом.	0,001	+	Сильное загрязнение
5у	Частный сектор; от дороги 8 м.	0,0001	+	Сильное загрязнение
6у	Жилой массив; напротив стадион, около подъезда дома.	0,001	+	Сильное загрязнение
7у	Стадион. Вокруг территории асфальт, проба взята с газона, 18 м от дороги. Почва сухая.	0,001	+	Сильное загрязнение
9у	Недалеко от АЗС, 15 км от тракта. Почва задернована, пронизана корнями.	0,00001	+	Сильное загрязнение
10у	Жилой массив, старые двухэтажные дома, строительный мусор.	0,001	+	Сильное загрязнение
14у	Остановка трамвая. Сквер, травянистый покров, много песка.	0,001	+	Сильное загрязнение
15у	Гаражи, мусор.	0,001	+	Сильное загрязнение
16у	Склон оврага, 100 м от частного чектора.	0,01	-	Умеренное загрязнение
17у	Парковая зона (центр города).	0,001	+	Сильное загрязнение
18у	Больница, 12 м от дороги, замусорено.	0,01	-	Умеренное загрязнение
19у	Промышленная зона, клевер, донник.	0,01	-	Умеренное загрязнение
20у	Жилой массив двухэтажных домов, внутри квартала.	0,001	+	Сильное загрязнение
21у	Перекресток, светофор. Торговый комплекс, мусор.	0,001	+	Сильное загрязнение
22у	Частный сектор, водоколонка	0,01	-	Умеренное загрязнение

Таблица 7.

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Саянска

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
Ic	Въезд в город, газон.	0,1	-	Слабое загрязнение
IIc	Жилой массив, мало растений.	0,1	-	Слабое загрязнение
IIIc	Химпром, мало растений.	0,1	-	Слабое загрязнение
1c	Автовокзал.	0,01	-
2c	Около мэрии города.	-	-	Нет загрязнения
3c	Приусадебные участки, деревянный сектор.	0,1	-	Слабое загрязнение
4c	Сквер, тропа.	0,1	-	Слабое загрязнение
5c	Теплотрасса.	0,01	-	Нет загрязнения
6c	ТЭЦ.	-	-	Нет загрязнения
7c	Дачный участок.	0,1	-	Слабое загрязнение
8c	Химпром, столовая.	0,1	-	Слабое загрязнение
9c	Химпром, цех №22 «Каустик».	-	-	Нет загрязнения
10c	Химпром, цех №21 «Ртуть».	-	-	Нет загрязнения

Таблица 8.

Оценка санитарного состояния урбаноземов г. Шелехова.

№ образца	Место взятия образца	Титр БГКП	Рост в среде с глюкозой при 44С (свежее фекальное загрязнение	Оценка санитарного состояния почвы
1ш	Квартал №3.	-	-	Нет загрязнения
2ш	Пос. Ленина, разнотравье.	0,1	-	Слабое загрязнение
3ш	ИрКАЗ	-	-	Нет загрязнения
4ш	Детский сад	0,1	-	Слабое загрязнение
5ш	Автобусная остановка.	0,1	-	Слабое загрязнение
7ш	Улица Ленина	-	-	Нет загрязнения
8ш	Место выгула собак.	-	-	Нет загрязнения
9ш	Автомагистраль	-	-	Нет загрязнения
12ш	Посев овса	-	-	Нет загрязнения

Видовой состав санитарно-показательных микроорганизмов в урбаноземах промышленных городов Иркутской области

Таблица 9.

Количество штаммов БГКП, изолированных из урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Город	Число выделенных штаммов	Количество штаммов, принадлежащих к видам:
		E. coli	Ent. cloaceae	C. freundii
Ангарск	10	1	2	7
Усолье-Сибирское	18	4	10	4
Саянск	9	0	2	7
Шелехов	3	0	1	2
Общее количество штук	40	5	15	20

Видовая принадлежность изолированных 40 штаммов бактерий группы кишечной палочки установлена по совокупности морфологических, культуральных, тинкториальных и физиолого-биохимических признаков по Определителю бактерий Берджи (38), «Санитарной микробиологии почвы» (Мишустин, 1979) и «Руководство по санитарной охране почвы» (Лоранский, 1972).

Все изолированные нами грамотрицательные, подвижные, палочковидные бактерии, сбраживающие глюкозу в среде Кесслер и дающие типичный рост на среде Эндо отнесены к семейству Enterobacteriaceae; родам Enterobacter, Citrobacter, Eschericia; видам E. coli (5 штаммов), C.freundii (20 штаммов), E. cloaceae (15 штаммов). В таблице 10 представлены дифференциальные признаки изолированных штаммов бактерий группы кишечной палочки, которые наглядно подтверждают принадлежность их к видам Citrobacter freundii. Enterobacter cloaceae, Escherichia coli.

Таблица 10.

Дифференциальные признаки санитарно-показательных бактерий, изолированных из урбаноземов промышленных городов Иркутской области

Признак	Citrobacter freundii (20 шт.)	Enterobacter cloaceae (15 шт.)	Escherichia coli (5 шт.)
Окраска по Граму	-	-	-
Температурный тест (на среде с глюкозой при 44С)	+	+	-
Образование Индола	+/-	+/-	+/-
Реакция с метиленовым синим	+	-	+
Образование ацетилметилкарбинола	-	+	+/-
Цитратный тест	+	-	-
Образование H2S	+	-	-
Оксидазная активность (24 ч)	-	-	-
Уреазная активность	-	-	+

ВЫВОДЫ

1. Исследование по санитарно-микробиологическим показателям 52 пробы урбаноземов промышленных городов Иркутской области.

2. В урбаноземах городов Ангарск и Усолье-Сибирское численность сапрофитных гетеротрофных бактерий значительно выше, чем в урбаноземах Саянска и Шелехова, на основании чего урбаноземы промышленных городов Иркутской области оценены, в основном, как умеренно и слабо загрязненные.

3. Гетеротрофный бактериальный комплекс урбаноземов промышленных городов Иркутской области представлен родами Bacillus, Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus, при этом во всех образцах доминировали представители рода Bacillus.

4. Санитарно-показательные бактерии группы кишечной палочки в небольшом количестве (титр 0,1) обнаружены в почвах городов Саянск и Шелехов и представлены видами Enterobacter cloaceae, Citrobacter freundii; данные урбаноземы оценены как слабо загрязенные.

5. В урбаноземах г. Ангарска титр бактерий группы кишечной палочки был от 0,1 до 0,001 в зависимости от места отбора проб. Наибольшее количество кишечной палочки выявлено на трамвайно-автобусных остановках и жилом секторе. В связи с этим урбаноземы характеризуются как умеренно и слабо загрязненные.

6. В урбаноземах Усолья- Сибирского титр бактерий группы кишечной палочки был достаточно высоким (0,01-0,00001); кроме видов Enterobacter cloaceae и Citrobacter freundii здесь обнаружены представители вида Escherichia coli. Урбаноземы по санитарно-гигиеническому состоянию оценены как умеренно и сильно загрязненные.

Список использованной литературы

Агаркова М.Г. Особенности городских почв и их систематика., Автореф.дис.канд.биол.наук, - М.: МГУ, 1991, с. 24.
Агаркова М.Г., Целищева Л.К., Строганова М.Н. Морфологические особенности городских почв и их систематика. //Вестн. МГУ, Сер17, Почвоведение, 1991, №2, с. 11-16.
Алексеева С.А. Геохимическая экология микроорганизмов, обитающих в почвах с разным уровнем содержания меди и цинка. – М.: Автореф.канд.дис.; 1986, с. 15-18.
Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. – М.: МГУ, 1989, с. 336.
Барыкова Ю.Н. Микробиологическая характеристика лессированных урбаноземов (Ирк. обл.) //География и природные ресурсы, 1992, №2, с. 72-78.
Барыкова М.Н. Влияние техногенных выбросов БЦБК на почвенные микроорганизмы//География и природные ресурсы, 1992, №2, с. 72-78.
Билетова Н.В. и другие. Санитарная микробиология. – М.: Пищевая промышленность, 1980, с. 123-136.
Вольпе И.М., Кучеренко В.Д. Практическое руководство по санитарной микробиологии. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1990, с. 50-90.
Геннадиев А.Н., Солнцева Н.П., Герасимова М.И. О принципах группировки и номенклатуры техногенно-измененных почв //Почвоведение, 1992, №2, с. 49-60.
Головчченко А.В., Полянская Л.М., Добровольская Т.Г. и др. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем //Почвоведение, 1993, №10, с. 79.
Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды Иркутской области в 1995 г. – Иркутск, 1996.
Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Почвы микробное разнообразие //Почвоведение, 1996, №6, с. 699-704.
Добровольская Т.Г., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. О показателях структуры бактериальных сообществ //Микробиология, 1997, №3, с. 408-414.
Добровольский Т.В., Никитин Е.Д. Функции почв в биосфере и экосистемах. М.: Наука, 1990, с. 261.
Добровольский Т.В. Почва, город, экология. Фонд «За экологическую грамотность», 1997, с. 320.
Джувеликн Х.А. Техногенное загрязнение черноземов тяжелыми металлами //Природные ресурсы Воронежской области, их мониторинг и охрана. – Воронеж, 1995, с. 174-176.
Евдокимова Г.В. Методологические подходы и методы оценки структурно-функционального состояния почвенной микробиоты в естественных и техногенных условиях. – Апатиты, 1992, с. 20.
Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Полянская Л.М. и др. Теоретические основы экологические основы экологической оценки микробных ресурсов почв//Почвоведение, 1994, №4, с. 65-73.
Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Вертикальный континуум бактериальных сообществ в наземных биогеоценозах //Журн. Общей биологии, 1991, Т.52, с. 162-171.
Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во МГУ, 1987, с. 256.
Калина Г.П. Бактерии группы кишечной палочки. Санитарная миробиология. М.: Медицина, 1969, с. 20-40.
Красильников Н.А. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. М.: МГУ, 1966, с. 215.
Краткий определитель бактерий Берджи (под ред. Дж. Хоуптона). М.: Мир, 1980.
Матвеев А.Н., Самусёнок В.П., Юрьев А.Л. Оценка воздействия на окружающую среду. Изд. Иркутского госуниверситета, 2007.
Куличева Н.Н., Лысак Л.В. и др. Бактерии в почве, опаде и фитоплане городской экосистемы. М.: МГУ, 1995, с. 65-72.
Лоранский Д.Н. Руководство по санитарной охране почв. М., 1972, с. 90-94.
Марфенина О.Е. Микробиологический мониторинг почв: возможности и перспективы //Почвоведение, 1994, №1, с. 75-80.
Макарова А.П., Напрасникова Е.В. Сравнительная микробиологическая характеристика урбаноземов гг. Иркутск и Шелехов //Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование: Тез. докл. науч. конф. – Иркутск, 1999, с. 41-42.
Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу почвы. – М.: Федеральный центр госэпиднадзора Минздрава России, 1999, с. 73.
Методы санитарно-микробиологического анализа воды (МУК 4.2.671-97 Минздрав России, 1997).
Мишустин Е.В., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. М., Наука, 1979, с. 304-324.
Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. – М.: МГУ, 1991.
Напрасникова Е.В., Макарова А.П. Санитарно-микробиологическая м биохимическая характеристика почв в условиях техногенеза и урбанизации //Гигиена и санитария, 1999, №3, с. 15-17.
Напрасникова Е.В. Биодиагностика почв антропогенных геосистем //География и природные ресурсы, 2001, №1, с. 55-59.
Напрасникова Е.В. Основные подходы, методы и результаты изучения биогенныз свойств почв Шарыповского промузла (зона КАТЭКа)//Экологические проблемы урбанизированных территорий. Иркутск, 1998, с. 105-113.
Напрасникова Е.В., Макарова А.П. Санитарно-экологическое состояние почвенного покрова рекреационных зон г. Иркутска, 2002.
Напрасникова Е.В., Снытко В.А. Щелочно-кислотные условия и биохимическая активность как показатели антропогенной изменчивости почв Прибайкалья//География и природные ресурсы, 2001, №3, с. 139-141.
Определитель бактерий Берджи. Том 1. Изд-во Мир, М., 1997.
Осипов В.И. Зоны геологического риска на территории Москвы//Вестн. РАН. 1994, Т.64. №1, с. 32-45.
Практикум по микробиологии /под ред. Егорова Н.С./М., Из-во Моск. Ун-та, 1976, с. 56-118.
Прокофьева Т.В., Седов С.Н. и др. Опыт микроморфологической диагностики городских почв//Почвоведение, 2001, №7, с. 879-890.
Рохмистров В.П., Иванова Т.Г., Жихарева А.М. Оценка загрязнения почвенного покрова крупными промышленными предприятиями//Регион и география: тез. докл. межд. науч. прак. конф., Пермь, 1995, май.
Сараев В.Г. Экологический риск воздействия фтора алюминиевого завода в Прибайкалье//Экологический риск: анализ, оценка, прогноз. – Иркутск, 1998.
Строганова М.Н., Мягкова А.Д., Прокофьева Т.В. роль почв в городских экосистемах//Почвоведение, 1992, №7, с. 16-25.
Строганова М.Н., Агаркова М.Г. Городские почвы: опыт изучения и систематики (на примере почв юго-западной части г. Москвы) //Почвоведение, 1992, №7, с. 16-25.
Строганова М.Н. Городские почвы: генезис, систематика и экологическое значение (на примере г. Москвы). Автореф. дис. канд. биол. наук. М.: МГУ, 1998, с. 71.
Сизов А.П., Медведева О.Е., Клюев Н.Н. и др. о новом подходе к исчислению ущерба, вызываемого захламлением, загрязнением и нарушением городских земель//Почвоведение, 2001, №6, с. 732-740.
Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Изд-во «Дрофа», 2004.
Хавина Л.Н. Экологическая ситуация в городе Шелехове (Ирк. обл.)//География и природные ресурсы, 2001, №3, с. 136-139.
Хазиев Ф.К. Системно-экологический анализ ферментной активности почв. М.: Наука, 1982, с. 202.
Хазиев Ф.К, Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 1990, с. 186.
Soils in the Urban Environments. Ed. By P. Bullock and P.J.Gregory. Oxford^ Blackwell Sci/ Publications, 1991, p. 174.

Оценка санитарного состояния антропогенно измененных почв (урбаноземов) промышленных городов Иркутской области