БИОСИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ

ТЕХНОЛОГИЯ

БИОСИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ.

1.Аминокислоты, способы получения.

2. Биосинтез аминокислот клетками микроорганизмов.

3. Пути биосинтеза и методы селекции продуцентов отдельных аминокислот.

Производству аминокислот после кормового белка уделяется наибольшее внимание. Это обусловлено высокой питательной ценностью получаемых на их основе кормов и отдельных продуктов питания. Недостаток в рационе (дефицит) отдельных аминокислот, особенно незаменимых, которые не синтезируются в достаточном количестве и с необходимой скоростью в организме животного или человека, отрицательно сказывается на росте и развитии, может привести к различного рода заболеваниям. (К незаменимым аминокислотам относятся валин, аргинин, гистидин, лизин, лейцин, изолейцин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин.).

способы получения аминокислот:

1.микробиологический

2.химический

3. производство аминокислот из белковых гидролизатов

В результате химического синтеза всегда образуются рацематы — равновесные смеси L- и D-форм аминокислоты, требующие в дальнейшем достаточно сложной и (или) дорогостоящей очистки, присутствие D-формы в готовом продукте всегда нежелательно не только потому, что она представляет собой балласт, поскольку не усваивается организмом человека и животного, но у некоторых аминокислот она обладает токсичными свойствами.

Производство аминокислот методом органического синтеза предполагает осуществление большого количества технологических операций. Технология такого производства в большинстве случаев направлена на использование достаточно токсичных соединений, высокоочищенных реагентов и осуществление стадии разделения образующихся рацематов.

Производство аминокислот из белковых гидролизатов.

Другим возможным способом получения аминокислот является гидролиз (кислотный, щелочной, ферментативный) некоторых наиболее доступных природных белков. К их числу относят отходы мясной промышленности, казеин молока, клейковину пшеницы и др. Однако такой способ имеет ряд существенных недостатков, которые не позволяют использовать его для организации крупнотоннажного промышленного производства. Наиболее существенные из них — это ограниченность и нестандартность источников сырья, многоступенчатая химическая обработка, связанная с выделением аминокислот и их очисткой. Кроме того, гидролиз под действием минеральных агентов приводит к частичному разрушению таких ценных аминокислот, как триптофан, треонин, цистеин, серин, а применение существующих протеолитических ферментов не обеспечивает полноты гидролиза всех пептидных связей.

Производство L-аминокислот микробиологическим синтезом.

Из всex возможных способов получения аминокислот микробиологическому синтезу в настоящее время отдается явное предпочтение.

Его очевидное преимущество состоит в том, что используемые микроорганизмы образуют аминокислоты в биологически активной L-форме. Последнее обеспечивает их выделение и очистку, выпуск технических препаратов для обогащения кормов с доступной для животноводства ценой.

Организацию промышленного производства L-аминокислот с помощью микроорганизмов возможно осуществить по двум технологическим схемам. Они различаются, в основном, стадией получения культуральной жидкости. В первой предполагается производство культуральной жидкости в две ступени (двухступенчатый способ), во второй — в одну ступень (одноступенчатый способ).

Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью микроорганизмов получил наибольшее распространение. Он основан на культивировании строго определенного штамма — продуцента целевой аминокислоты на среде заданного состава при соответствующих параметрах процесса ферментации.

Используемый штамм обладает способностью к сверхсинтезу необходимой аминокислоты. Для этой цели, как правило, выбирают полиауксотрофные мутанты, т. е. те клетки микроорганизма, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для роста и развития различные аминокислоты, а с другой — приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты.

2. Биосинтез аминокислот клетками микроорганизмов.

В состав белка микробных клеток входят все 20 аминокислот, биосинтез которых у прототрофных культур осуществляется из углерод-, азот- и серо содержащих компонентов среды. В качестве источников углерода могут быть углеводы, углеводороды и продукты их неполного окисления.

Несмотря на многообразие источников углерода в результате функционирования таких метаболитных последовательностей, как гликолиз, пути Энтнера-Дударова и пентозофосфатный, а также цикл трикарбоновых кислот, почти всегда образуются одни и те же углеродные предшественники аминокислот.

Для некоторых микроорганизмов, однако, возможны исключения, когда одна и та же аминокислота образуется из разных предшественников. В зависимости от таксономической принадлежности микроорганизмов к той или другой физиологической группе источниками азота для аминирования углеродного скелета могут быть аммонийные соли, нитраты или молекулярный азот. Ассимиляция NНз, приводящая к образованию аминогруппы глутаминовой кислоты, может осуществляться как путем восстановительного аминирования а-кетоглутаровой кислоты, так и через глутаматный цикл. (р-ция аминирования).

Глутаминовая кислота — основной донор аминогрупп для других, синтезируемых клеткой аминокислот: с помощью трансаминаз возможно образование более чем 10 аминокислот из соответствующих кетокислот.

3.Пути биосинтеза и методы селекции продуцентов отдельных аминокислот.

Микроорганизмы обычно синтезируют каждую из аминокислот в определенных количествах, обеспечивая тем самым синтез специфических белков. Это объясняется тем, что контроль за скоростью биосинтеза каждой аминокислоты осуществляется по принципу обратной связи как на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих ферментов (репрессия), так и на уровне самих ферментов, способных под действием избытка образующихся аминокислот изменять свою активность (ретроингибирование). Такой контроль исключает, перепроизводство аминокислот, и выделение их из клетки возможно лишь у микроорганизмов с нарушенной системой регуляции. Такие культуры иногда выделяют из природных источников.

Основной путь селекции продуцентов аминокислот — получение ауксотрофных и регуляторных мутантов. Ауксотрофные мутанты отбирают на селективных средах после воздействия на суспензии бактериальных культур физическими (например, ультрафиолетовое или рентгеновское излучение) и химическими (этиленимин, диэтилсульфат, нитрозоэтил-мочевина и т. д.) факторами. У таких мутантов появляется дефектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Получение ауксотрофных мутантов — продуцентов аминокислот — возможно только для микроорганизмов, имеющих разветвленный путь биосинтеза, по крайней мере, двух аминокислот, образующихся из одного предшественника. Их биосинтез контролируется на уровне первого фермента общего участка согласованным ингибированием конечными продуктами (ретроингибирование). У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Аминокислота, биосинтез которой блокирован в результате мутагенного воздействия, должна добавляться в ограниченном количестве.

Регуляторные мутанты отбирают среди культур, устойчивых к аналогу целевой аминокислоты. Этот метод позволяет отобрать мутанты, у которых имеются нарушения в системе регуляции образования целевой аминокислоты, а некоторые из них оказываются способными к ее повышенному синтезу и выделению из клетки.

L-Глутаминовая кислота — первая аминокислота, полученная на основе промышленного микробиологического синтеза. В качестве продуцентов брали дикие штаммы глутаматпродуцирующих коринебактерий. В условиях, обеспечивающих нормальный рост этих культур, сверхсинтеза этой аминокислоты не происходит. «Перепроизводство» этого продукта дикими штаммами коринебактерий вызывается особыми физиологическими условиями, когда рост клеток тормозится, а в клеточной мембране происходят структурные и функциональные изменения, приводящие к проницаемости ее для глутаминовой кислоты. Такие условия создаются при лимите в среде биотина (1-5 мкг/л). В результете интенсивного выделения из клетки образуемой глутаминовой кислоты ее внутриклеточная концентрация резко снижается и регуляция синтеза конечным продуктом ослабевает. В таких условиях даже дикие штаммы способны превращать в глутаминовую кислоту до 50% используемого источника углерода.

Селекционная работа с продуцентами этой аминокислоты идет главным образом в направлении получения ауксотрофных мутантов, отличающихся слабой активностью а-кетоглутаратдегидрогеназы (фермента, включающего предшественник глутаминовой кислоты в цикл трикарбоновых кислот), Основной селекционный прием — ступенчатый отбор после мутагенного воздействия и оценка мутантов на средах с повышенным содержанием биотина (до 30 мкг/л). Такие штаммы необходимы в связи с применением в производстве мелассных сред, содержащих высокие концентрации биотина.

L-Лизин синтезируется микроорганизмами двумя принципиально различными путями. Микроводоросли, грибы, дрожжи синтез лизина осуществляют из а-кетоглутаровой кислоты через -аминоадипиновую кислоту (АА путь). Для бактериальных культур, высших растений, некоторых водорослей характерен другой путь биосинтеза лизина — через а-диаминопимелиновую кислоту (ДАП-путь), начинающийся с аспарагиновой кислоты. Кроме лизина по разветвленной схеме биосинтеза из аспартата образуются метионин, треонин и изолейцин. Установлено, что контроль биосинтеза аминокислот семейства аспартата осуществляется на уровне первого фермента -аспартокиназы (АК). Продуценты лизина — глутаматпродуцирующие коринебактерии Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum — имеют единственную АК, активность которой регулируется путем согласованного ингибирования по принципу обратной связи треонином и лизином. Синтез треонина зависит от активности гомосериндегидрогеназы (ГД), синтез лизина катализируется первым ферментом лизиновой ветви пути — дигидродипиколинат синтетазой (ДДПС). Общий предшественник в синтезе лизина и треонина — полуальдегид аспарагиновой кислоты – у диких штаммов коринебактерий расходуется преимущественно на синтез треонина, так как активность ГД в 15 раз выше, чем ДДПС-активность, т. е. фактически биосинтез лизина начинается после насыщения клетки треонином, метионином и изолейцином. В связи с этим для получения сверхпродукции лизина необходимо заблокировать биосинтез этих метаболитов, что возможно путем подавления активности ГД или гомосеринкиназы (ГК). У глутаматпродуцирующих культур это достигается воздействием мутагенных факторов на прототрофные штаммы. Известны три класса лизинпродуцирующих мутантов:

Ароматические аминокислоты.

За последние годы нее большее практическое значение приобретает селекция штаммов микроорганизмов — продуцентов ароматических аминокислот — триптофана, фенилаланина и тирозина. В микробной клетке синтез этих соединений идет по общему пути до хоризмовой кислоты, а дальше разветвляется на две ветви, одна из которых ведет к синтезу триптофана, а вторая, через префеновую кислоту — к тирозину и фенилаланину .

Селекционная работа по выделению мутантов -- продуцентов ароматических аминокислот — проводится с представителями трех семейств: коринебактерий (Brev. flavum, Coryn. glutamicum), бацилл (Вас. subtilis) и энтеробактерий (Е. coli).

При селекции продуцентов ароматических аминокислот на первом этапе должны быть выделены штаммы-ауксотрофы, у которых общий предшественник — хоризмовая кислота — расходовалась бы в основном на синтез целевого продукта. Селекционная работа по поиску продуцентов аминокислот базируется в настоящее время в основном на получении регуляторных мутантов, штаммов с множественными мутациями, обеспечивающими сверхсинтез целевых аминокислот представителями трех семейств — коринебактерий, энтеробактерий и бацилл.

Производство L-аминокислот микробиологическим синтезом.

Производство аминокислот в виде высокоочищенных кристаллических препаратов строится по схеме, типичной для получения и выделения вторичных метаболитов. Наиболее распространенный одноступенчатый микробиологический синтез любой аминокислоты предполагает размножение в несколько стадий исходной культуры продуцента на агаризованной среде, выращивание в маточных колбах, размножение культуры в системе инокуляторов и посевных аппаратах. В дальнейшем осуществляют культивирование культуры в производственных ферментерах. После завершения ферментации проводят, обработку культуральной жидкости с целью улучшения фильтруемости,а затем отделение клеток продуцента. Полученный таким образом нативный раствор подвергают предварительной очистке от окрашенных примесей с использованием сорбционных методов. Целевую аминокислоту выделяют с помощью ионного обмена или методом осаждения. Элюаты, или маточные растворы концентрируют вакуум-выпаркой, образующиеся технические кристаллы готового продукта очищают путем перекристаллизации из насыщенного раствора. Завершается процесс получения кристаллического препарата, как правило, вакуум-сушкой очищенных кристаллов и их упаковкой.

БИОСИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ