ВЛИЯНИЕ КОМЕНАТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЦНС В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ С ГИПЕРКАПНИЕЙ У КРЫС
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)
Кафедра биохимии и физиологии
ДОПУСТИТЬ К ЗАЩИТЕ В ГАК
Заведующий кафедрой – канд. биол.
наук, доцент ________ В. В. Хаблюк
«___»______________ 2015 г.
Руководитель магистерской
программы – канд. биол.
наук, доцент ________ В. В. Хаблюк
«___»______________ 2015 г.
ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА
(МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ)
ВЛИЯНИЕ КОМЕНАТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЦНС В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ С ГИПЕРКАПНИЕЙ У КРЫС
Работу выполнила ____________________________________З. М. Шхалахова
(подпись, дата)
Факультет биологический
Направление 06.04.01 Биология
Научный руководитель,
доцент, канд. биол. наук,
доцент _____________________________________________М. Л. Золотавина
(подпись, дата)
Нормоконтролёр,
доцент, канд. биол.
наук _________________________________________________ Н. Н. Улитина
(подпись, дата)
Краснодар 2015
РЕФЕРАТ
Магистерская диссертация выполнена на 41 страницах машинописного текста. Содержит три главы, заключение с выводами, библиографический список, содержащий 00 источников. Работа содержит 5 таблиц.
Ключевые слова: ГИПОКСИЯ, КРЫСЫ, КОМЕНАТ КАЛИЯ.
Целью данной рабты являлось изучение протекторного действия калиевой соли коменовой кислоты на поведенческие реакции крыс в обычных условиях и при гипоксии с гиперкапнией.
Объектом исследования были крысы линии «Вистар» в возрасте трёх месяцев. Материалом для исследований служили поведенческие реакции. Сбор материала осуществлялся при использовании двух тестов, позволяющих оценить поведение животных: «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт».
На основании проведённого исследования нами была показана необходимость использования соли коменовой кислоты комената калия в качестве нейропротекторного средства
Таким образом, нами было доказано, что применение такого вещества как коменат калия позволяет уменьшить негативные последствия острой гипоксии.
СОДЕРЖАНИЕ
Введение………………………………………………………………………….4
1 Аналитический обзор…………………………………………………………6
1. 1 Общая характеристика гипоксии………………………………………….6
1. 1. 1 Стадии гипоксии…………………………………………………………6
1.1. 2 Классификация гипоксий………………………………………………..9
1. 1. 3 Защитно-приспособительные реакции при гипоксии………………..12
1. 1. 4 Нарушения основных физиологических функций и обмена веществ...13
1. 1. 5 Механизмы гипоксического некробиоза………………………………..14
1. 2. Использование препаратов с антигипоксическим действием…………...17
2 Материалы и методы исследования………………………………………….21
2. 1 Методика тестирования животных в тесте «открытое поле»……………21
2. 3 Методика тестирования животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт…………………………………………………………………………24
3 Результаты и обсуждение……………………………………………………..28
3. 1. Исследование влияния комената калия на горизонтальную двигательную активность крыс в тесте «открытое поле» в норме и в условиях гипоксии с гиперкапнией …..............................................................................................28
3. 2 Исследование влияния комената калия на вертикальную двигательную активность крыс в тесте «открытое поле» в норме и в условиях гипоксии с гиперкапнией…………………………………………………………………….30
3. 3 Исследование влияния комената калия на поведенческие реакции крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт в норме и в условиях гипоксии с гиперкапнией………………………………………………………..33
Заключение………………………………………………………………………36
Список использованных источников…………………………………………37
ВВЕДЕНИЕ
Нарушение кислородного снабжения мозга - важнейший патологический фактор и ключевое звено большинства тяжелых заболеваний. Структуры головного мозга обладают наибольшей чувствительностью к дефициту кислорода, что объясняется чрезвычайной интенсивностью пластического и энергетического обмена в нейронах и клетках нейроглии. Гипоксия вызывает каскад метаболических изменений в мозговых структурах, нарушая целый ряд процессов. Даже непродолжительные периоды ишемии или тяжелой гипоксии могут приводить к повреждениям областей мозга с сопутствующим неврологическим дефицитом и поведенческой дисфункцией [Шахмарданова С. А., Шахмарданов А. З., 2014].
Повреждение и гибель нейронов при ишемии - многофакторный процесс, включающий множество взаимозависимых звеньев, таких как дефицит кислорода (гипоксию), энергетический дефицит, деполяризацию мембраны, нарушение ионного гомеостаза, гиперактивацию рецепторов возбуждающих аминокислот, поступление кальция в нейрон, избыточное образование АФК, тканевой ацидоз [Беленичев И .Ф., Бухтиярова Н. В., Середа Д.А., 2010].
В настоящее время цереброваскулярные патологии (геморрагический инсульт, ишемический инсульт, окклюзии и стенозы сосудов головного мозга, аневризмы и пр.) занимают второе после заболеваний сердечно-сосудистой системы место среди причин смерти людей во всем мире и в России в том числе [Гусев Е. И., Скворцова В. И., 2001]. По данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируется 15-20 млн новых случаев инсультов, более 80 % выживших остаются инвалидами. В России ежегодно регистрируется около 450–500 тыс новых случаев инсульта [Исайкин А. И., 2010].
Известно, что большинство наиболее сильных препаратов первичной нейропротектции имеют грубые побочные эффекты, а менее токсичные не всегда являются эффективными. Средства вторичной нейропротекции, тормозящие отсроченные механизмы гибели клеток, также не оказывают выраженного защитного действия при ишемии/гипоксии [Бэр К. М., 2011].
В виду этого одной из центральных задач нейробиологии и медицины является поиск путей повышения устойчивости мозга к ишемии/гипоксии.
В соответствии с уже имеющимися результатами изучения нейропроекторных свойств коменовой кислоты и комената калия (Заявка на патент РФ на изобретение № 2012135362, 16.08.2012) представляется актуальным исследование механизмов нейропроекторного действия комената калия на функциональное состояние ЦНС при гипоксии.
Целью данной работы было изучение протекторного действия калиевой соли коменовой кислоты на поведенческие реакции крыс в обычных условиях и при гипоксии с гиперкапнией.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Исследовать влияние комената калия на поведенческие реакции крыс в тесте «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт в норме
2. Исследовать влияние комената калия на поведенческие реакции крыс в тесте «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт в условиях гипоксии с гиперкапнией
1. Аналитический обзор
1. 1 Общая характеристика гипоксии
Гипоксия (кислородное голодание, кислородная недостаточность) - типовой патологический процесс, возникающий в результате недостаточности биологического окисления и обусловленной ею энергетической необеспеченности жизненных процессов. Поскольку в обеспечении тканей кислородом участвует ряд органов и систем (органы дыхания, сердечно-сосудистая система, кровь и др.) нарушения функции каждой из этих систем может привести к развитию гипоксии. Деятельность указанных систем регулируется и координируется центральной нервной системой, в первую очередь, корой головного мозга. Поэтому нарушение центральной регуляции этих систем также приводит к развитию кислородного голодания [Леонова Е. В., Висмонт Ф.И., 2002].
1. 1. 1 Стадии гипоксии
Различают несколько стадий гипоксии, наиболее четко выявляющихся при острой гипоксической гипоксии. Первая стадия - скрытая гипоксия, когда действие гипоксического фактора на организм невелико, но уже начинают включаться компенсаторные механизмы, обеспечивающие нормальную доставку кислородов к тканям, благодаря чему последние не испытывают кислородного голодания. Сохраняется вне- и внутриклеточный гомеостаз, отсутствуют недоокисленые продукты распада в жидких средах, в условиях неполного насыщения кислородом крови, оттекающей от легких. Изменения самочувствия нет, настроение приподнято, быстрые движения, усилена жестикуляция, но имеются начальные нарушения внутреннего торможения; ускоряется темп речи. нарушается тонкая координация движений.
Вторая стадия - компенсируемая гипоксия, дефицит кислорода приводит к возбуждению рецепторов, активации ретикулярной формации, усилению ее активирующего влияния на жизненно важные центры ствола мозга, кору головного мозга, спинного мозга, включению дополнительных механизмов компенсации. Возрастает не только вентиляция, но и частота сердечных сокращений, увеличивается МОК, количество эритроцитов и гемоглобина; снижается рН, изменяется сродство гемоглобина кислороду; повышается активность цитохромоксидазы, увеличивается извлечение кислорода тканями из крови; повышается кровоснабжение жизненно важных органов. Благодаря деятельности компенсаторных механизмов ткани получают еще значительное количество кислорода. Субъективно: снижение работоспособности, ухудшение самочувствия, ощущение тяжести в голове, во всем теле, тошнота, усиление сердцебиения; движения замедленны, умственная и физическая работы требуют усилий, нарушаются все виды внутреннего торможения, темп речи замедляется; учащается ритм и увеличивается амплитуда биотоков коры головного мозга.
Третья стадия - выраженной гипоксии с наступающей декомпенсацией. Разобщение нарушенного клеточного метаболизма с функцией мембран; повышение их проницаемости, автоматическое включение защитного механизма в виде снижения плотности ионоселективных каналов (для К+ и Na+) при сохранении функции К+/Na+ насоса, предотвращение дальнейшего повышения проницаемости мембран, снижения их чувствительности к действию регулирующих систем, длительное поддержание обменных и функциональных нарушений. Однако, несмотря на напряженную деятельность многих механизмов компенсации скорость доставки кислорода и его потребления падает, проявляется тканевая гипоксия, сопровождающаяся появлением недоокисленных продуктов обмена в крови, значительной потерей работоспособности, головной болью, тошнотой, рвотой, предобморочным состоянием, побледнением кожных покровов; возможны подергивания век, лицевых мышц.
Четвертая стадия - тяжелая некомпенсируемая гипоксия. Значительная недостаточность оксигенация крови (менее 90 %), постоянное содержание в крови высокой концентрации недоокисленных продуктов распада; выраженный вне - и внутриклеточный ацидоз; ослабление эффективности антиоксидантных систем клетки, активности антиоксидантных ферментов, активация свободно-радикального окисления, повреждение мембранных структур, развитие клеточно-дистрофических процессов, особенно в паренхиматозных органах. Нарушается деятельность приспособительных механизмов, дыхание и пульс становятся реже, кровоток уменьшается, резко снижается скорость доставки кислорода к тканям и его потребление, содержание недоокисленных продуктов метаболизма в крови нарастает, возможны судороги, потеря сознания, непроизвольное мочеиспускание, дефекация.
Пятая стадия - терминальная гипоксия. Выраженная недостаточность оксигенации крови, содержание в крови массивных количеств недоокисленных продуктов распада; угнетение антиоксидантных систем клеток, резко выраженная активация свободно-радикального окисления; резкое повреждение цитоплазматических мембран; накопление внутри клетки Na+, Ca2+, возникновение отека, развитие несовместимых с жизнью клетки обменных нарушений (необратимые повреждения митохондрий, активация автолиза, угнетение активного транспорта ионов и др.).
Резко замедлено дыхание, одиночные глубокие вдохи, падение сердечной деятельности.
Минимальное напряжение кислорода, при котором еще может осуществляться тканевое дыхание называется критическим. Для артериальной крови оно соответствует 27-33 мм рт. ст., для венозной - 19 мм рт. ст.
Хронические формы гипоксии возникают при длительной недостаточности кровообращения, дыхания, болезнях крови и др. При этом наблюдается стойкое нарушение окислительных процессов в тканях. Отмечается общий дискомфорт, повышение утомляемости, одышка, сердцебиение при репродуктивной способности и др. расстройства, связанные с постепенно развивающимися дистрофическими изменениями в различных органах и тканях.
1.1. 2 Классификация типов гипоксии
В соответствии с общепринятыми классическими описаниями происхождения и классификации гипоксических состояний различают ги-поксии экзогенного и эндогенного характера [Чеснокова Н. П., 2004].
Гипоксии экзогенного характера могут возникать вследствие уменьшения парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе при нормальном общем барометрическом давлении (нормобарическая) и при общем снижении барометрического давления (гипербарическая гипоксия). Патогенетической основой развития гипоксии экзогенного типа является артериальная гипоксемия, а в ряде случаев и гипокапния, развивающаяся в результате компенсаторной гипервентиляции лёгких, приводящая к нарушениям кислотно-основного состояния и развитию газового алкалоза.
Для оценки закономерностей развития метаболических сдвигов при различных формах патологии более важны представления о современных принципах классификации гипоксий эндогенного типа по этиологическому фактору. В соответствии с этим различают дыхательную гипоксию, сердечно-сосудистую (циркуляторную гипоксию), гемическую или кровяную гипоксию и тканевую гипоксию [Литвицкий П. Ф., 2003].
Дыхательная (респираторная гипоксия носит системный характер, связана с недостаточностью газообмена в лёгких при обструктивных, рестриктивных формах патологии, обусловленных нарушением нервной и гуморальной регуляции дыхания, патологией грудной клетки и дыхательной мускулатуры.
Ограничение, затруднение внешнего дыхания при гипоксической гипоксии приводят в ряде случаев к развитию гипоксемии и гиперкапнии, т.е. формирование газового ацидоза, а затеми метаболического [Леонова Е.В, Висмонт Ф. И., 2002].
Циркуляторная гипоксия может носить системный характер и развиваться при недостаточности сердечно-сосудистой системы, при ДВС – синдроме, при шоке различного генеза (кардиогенном, вазогенном, гиповолемическом), коллаптоидных состояниях [Окороков А. И., 2002].
Локальная циркуляторная гипоксия возникает при различных местных нарушениях переферического кровообращения: тромбозе, эмболии сосудов в зоне ишемии, воспаления, стаза и др. формах патологии [Окороков А. И., 2002].
В основе гемической гипоксии лежит уменьшение кислородной емкости крови в связи со снижением содержания гемоглобина в крови или его качественными сдвигами, например, при образовании карбоксигемоглобина, метгемоглобина и других врожденных или приобретенных аномалиях этого кислород-транспортирующего белка.
К настоящему моменту детально описаны механизмы развития следующего варианта патологии дыхания – тканевой гипоксии. Последняя возникает в связи с нарушением экстракции кислорода тканями из притекающей крови и неспособностью клеток утилизировать кислород [Чеснокова Н. П., 2004].
Однако пусковые механизмы развития тканевой гипоксии чрезвычайно разнообразны и могут быть связаны со следующими патогенетическими факторами:
- ингибированием ферментов в процессеспецифического и аллостерического связывания его активных центров, конкурентного торможения псевдосубстратами.
- недостаточностью синтеза ферментов тканевого дыхания при дефиците специфических компонентов, изменениях физико-химических параметров внутренней среды, дефиците макроэргов при гипоксических состояниях любого генеза, поскольку все этапы синтеза ферментных, а также структурных белков в клетке являются энергозависимыми.
Одним из важнейших патогенетических факторов развития тканевой гипоксии является дезинтеграция структуры митохондриальных мембран, возникающая под влиянием различных этиологических факторов бактериально - токсической, иммуноаллергической природы, гормонального дисбаланса, нарушений электролитного баланса, при старении организма [Скулачев В. П., 2001].
Тканевая гипоксия, безусловно, возникает вторично при различных видах гипоксий – дыхательной, циркуляторной, гемической, инициирующих развитие ацидоза, активацию процессов липопероксидации, дестабилизацию всех биологических мембран, в том числе и митохондриальных.
Общепринятой является точка зрения о том, что в основе развития гипоксии лежат нарушения окислительно-восстановительных реакций в связи с дефицитом кислорода. В то же время высказывается точка зрения о возможности развития субстратного типа гипоксии, обусловленной недостаточностью субстратов окисления, например, глюкозы для нервных клеток, жирных кислот для миокарда [Воложина А. И, Порядина Г. П., 2000].
Как следует из вышеизложенного, гипоксия, начинаясь как циркуляторная, дыхательная или гемическая, достаточно быстро приобретает смешанный характер. В последние годы стали выделять 8 типов гипоксий: наряду с дыхательной, гемической, циркуляторной, тканевой, смешанной гипоксией выделяют так называемые гипероксигемическую и гипербарическую гипоксии [Зайчик А. Ш., Чурилов Л. П.,2000].
В связи с этим, следует отметить, что острая гипоксемия того или иного генеза, а также гипероксия приводят к повреждению мембран митохондрий, пространственной дезорганизации дыхательных ферментативных ансамблей, локализованных на их внутренней мембране и соответственно к развитию тканевой гипоксии. Так что при многих гипоксических состояниях, сопутствующих различным заболеваниям инфекционной и неинфекционной природы, возникает нарушение экстракции кислорода тканями.
1. 1. 3 Защитно-приспособительные реакции при гипоксии
Первые изменения в организме при гипоксии связаны с включением ре-акций, направленных на сохранение гомеостаза (фаза компенсации). Если приспособительные реакции оказываются недостаточными, в организме развиваются структурно-функциональные нарушения (фаза декомпенсации).
Различают реакции, направленные на приспособление к кратковременной острой ги-поксии (срочные) и реакции, обеспечивающие устойчивое приспособление к менее выраженной, но длительно существующей или многократно повторяющейся гипоксии (реакции долговременного приспособления).
Срочные реакции возникают рефлекторно вследствие раздражения рецепторов сосудистой системы и ретикулярной формации ствола мозга изменившимся газовым составом крови. Происходит увеличение альвеолярной вентиляции, ее минутного объема, за счет углубления дыхания, учащения дыхательных экскурсий, мобилизации резервных альвеол (компенсаторная одышка); учащаются сердечные сокращения, увеличиваются масса циркулирующей крови (за счет выброса крови из кровяных депо), венозный приток, ударный и минутный объем сердца, скорость кровотока, кровоснабжение мозга, сердца и других жизненно важных органов и уменьшается кровоснабжение мышц, кожи и др. (централизация крово- обращения); повышается кислородная емкость крови за счет усиленного вымы- вания эритроцитов из костного мозга, а затем и активация эритропоэза, повы- шаются кислородсвязывающие свойства гемоглобина. Оксигемоглобин приоб- ретает способность отдавать тканям большее количество кислорода даже при умеренном снижении рО2 в тканевой жидкости, чему способствует развиваю- щийся в тканях ацидоз (при котором оксигемоглобин легче отдает кислород); ограничивается активность органов и тканей, непосредственно не участвующих в обеспечении транспорта кислорода; повышается сопряженность процессов биологического окисления и фосфорилирования, усиливается анаэробный синтез АТФ за счет активации гликолиза; в различных тканях увеличивается про- дукция оксида азота, что ведет к расширению прекапиллярных сосудов, сниже- нию адгезии и агрегации тромбоцитов, активации синтеза стресс-белков, за- щищающих клетку от повреждения [Шевченко Ю. Л., 2000].
Важной приспособительной реакцией при гипоксии является активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (стресс – синдром), гормоны которой (глюкокортикоиды), стабилизируя мембраны лизосом, снижают тем самым повреждающее действие гипоксического фактора, и препятствуют развитию гипоксического некробиоза, повышая устойчивость тканей к недостатку кислорода.
Компенсаторные реакции при гипероксической гипоксии направлены на предупреждение возрастания напряжения кислорода в артериальной крови и в тканях ослабление легочной вентиляции и центрального кровообращения, снижение минутного объема дыхания и кровообращения, частоты сердечных сокращений, ударного объема сердца, уменьшение объема циркулирующей крови, ее депонирование в паренхиматозных органах; понижение артериально- го давления; сужение мелких артерий и артериол мозга, сетчатки глаза и почек, наиболее чувствительных как к недостатку, так и к избытку кислорода. Эти ре- акции в целом обеспечивают соответствие потребности тканей в кислороде.
1. 1. 4 Нарушения основных физиологических функций и обмена веществ
Наиболее чувствительна к кислородному голоданию нервная ткань. При полном прекращении снабжения кислородом признаки нарушения в коре больших полушарий обнаруживаются уже через 2,5-3 мин. При острой гипок- сии первые расстройства (особенно четко проявляющиеся при гипоксической ее форме) наблюдаются со стороны высшей нервной деятельности (эйфория, эмоциональные расстройства, изменения почерка и пропуски букв, притупле- ние и потеря самокритики, которые затем сменяются депрессией, угрюмостью, сварливостью, драчливостью).
С нарастанием острой гипоксии вслед за активацией дыхания возникают различные нарушения ритма, неравномерность амплитуды дыхательных движений, редкие, короткие дыхательные экскурсии постепенно ослабевающие до полного прекращения дыхания. Возникает тахикардия, усиливающаяся параллельно ослаблению деятельности сердца, затем – нитевидный пульс, фибрилляция предсердий и желудочков. Систолическое давление постепенно понижается. Нарушаются пищеварение и функция почек. Снижается температура тела. Универсальный, хотя и неспецифический признак гипоксических состояний, гипоксического повреждения клеток и тканей – повышение пассивной проницаемости биологических мембран, их дезорганизация, что ведет к выходу ферментов в межтканевую жидкость и кровь, вызывая нарушения обмена веществ и вторичную гипоксическую альтерацию тканей. Изменения в углеводном и энергетическом обмене приводят к дефициту макроэргов, уменьшению содержания АТФ в клетках, усилению гликолиза, снижению содержания гликогена в печени, угнетению процессов его ресинтеза; в результате в организме повышается содержание молочной и др. органических кислот. Развивается метаболический ацидоз. Недостаточность окислительных процессов приводит к нарушению обмена липидов и белков. Снижается концентрация в крови основных аминокислот, возрастает содержание в тканях аммиака, возникает отрицательный азотистый баланс, развивается гиперкетонемия, резко активируются процессы перекисного окисления липидов. Нарушение обменных процессов приводит к структурно-функциональным изменениям и повреждению клеток и далее к образованию свободных радикалов и пероксинитритов, что ведет к некрозу и апоптозу нейронов .
1. 1. 5 Механизмы гипоксического некробиоза
Некробиоз – процесс отмирания клетки, глубокая, частично необратимая стадия повреждения клетки, непосредственно предшествующая ее смерти. По биохимическим критериям клетка считается погибшей с момента полного пре-кращения ею производства свободной энергии. Любое воздействие, вызывающее более или менее продолжительное кислородное голодание ведет к гипок-сическому повреждению клетки. На начальном этапе этого процесса снижается скорость аэробного окисления и окислительного фосфорилирования в митохондриях. Это приводит к понижению количества АТФ, возрастанию содержа-ния аденозиндифосфата (АДФ), и аденозинмонофосфата (АМФ). Уменьшается коэффициент АТФ/АДФ+АМФ, снижаются функциональные возможности клетки. При низком соотношении АТФ/АДФ+АМФ активируется фермент фосфорфруктокиназа (ФФК), что приводит к усилению реакции анаэробного гликолиза, клетка расходует гликоген, обеспечивая себя энергией за счет бес- кислородного распада глюкозы; Запасы гликогена в клетке истощаются. Акти- вация анаэробного гликолиза ведет к снижению рН цитоплазмы. Прогрессирующий ацидоз вызывает денатурацию белков и помутнение цитоплазмы. Поскольку ФФК кислотоугнетаемый фермент, то в условиях гипоксии ослабляется 17 гликолиз, формируется дефицит АТФ. При значительном дефиците АТФ процессы клеточного повреждения усугубляются.
Наиболее энергоемкий фермент в клетке – калий-натриевая АТФ-аза. При дефиците энергии ограничиваются его возможности, в результате чего утрачивается нормальный калий-натриевый градиент; клетки теряют ионы калия, а вне клеток возникает его избыток – гиперкалиемия.
Утрата калий-натриевого градиента означает для клетки уменьшение потенциала покоя, вследствие чего положительный поверхностный заряд, свойственный нормальным клеткам уменьшается, клетки становятся менее возбудимыми, нарушаются межклеточные взаимодействия, что и происходит при глубокой гипоксии. Последствие повреждения калий-натриевого насоса – проникновение избытка натрия в клетки, гипергидратация и набухание их, расширение цистерн эндоплазматического ретикулума. Гипергидратации способствует и накопление осмотически активных продуктов разрушения и усиленного катаболизма полимерных клеточных молекул.
В механизме гипоксического некробиоза, особенно на глубоких стадиях, ключевую роль играет увеличение содержания ионизированного внутриклеточного кальция, избыток которого токсичен для клетки. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция вначале обусловлено нехваткой энергии для работы кальций-магниевого насоса. При углублении гипоксии кальций попадает в клетку уже через входные кальциевые каналы наружной мембраны, а также массивным потоком из митохондрий, цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума и через поврежденные клеточные мембраны. Это приводит к критическому нарастанию его 18 концентрации. Длительный избыток кальция в цитоплазме ведет к активации Са++ зависимых протеиназ, прогрессирующему цитоплазматическому протеоли- зу. При необратимом повреждении клетки в митохиндрии поступают значи- тельные количества кальция, что приводит к инактивации их ферментов, дена- турации белка, стойкой утрате способности к продукции АТФ даже при восстановлении притока кислорода или реперфузии.
Таким образом, центральным звеном клеточной гибели является длительное повышение цитоплазматической концентрации ионизированного кальция. Гибели клеток способствуют и активные кислородсодержащие радикалы, образующиеся в большом количестве липоперекиси и гидроперекиси липидов мембран, а также гиперпродукция оксида азота, оказывающие на этом этапе повреждающее, цитотоксическое действие.
При этом даже непродолжительные периоды ишемии или тяжелой гипоксии могут приводить к повреждениям областей мозга с сопутствующим неврологическим дефицитом и поведенческой дисфункцией [Хитрова Н. К., Саркисова Д. С., Пальцева М.А., 1999].
Многие патологии ЦНС, при которых наблюдаются деструктивные процессы нейронов головного мозга, связаны с активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ). Окислительный стресс, ведущий к гиперпродукции свободных радикалов (СР) и деструкции мембран, связанной с активацией фосфолипазного гидролиза, играет главную роль в патогенетических механизмах ишемии мозга.
Антиоксидантная защита организма при оксидативном стрессе неспособна полностью нейтрализовать образующийся избыток АФК. В этих условиях очевидна целесообразность использования антиоксидантных препаратов, способных защитить мозговую ткань от повреждения [Nonaka Sh., Katsube N.,Chuang D.,1998].
1. 2 Использование препаратов с антигипоксическим действием
В настоящее время для профилактики и лечения дегенеративных заболеваний с ишемическим повреждением применяют антиоксиданты, которые по своему происхождению подразделяют на две основные группы: природные и синтетические.
Природные антиоксиданты: ферменты, белки, низкомолекулярные соединения (витамины Е и С, каротиноиды, убихинон и др.).
Группу синтетических антиоксидантов представляют синтетические аналоги витамина Е, ароматические фенолы и полифенолы (ионол, пробукол), эмоксипин и мексидол, некоторые производные барбитуровой кислоты и фенотиазина, препараты железа и цинка, органические кислоты и их производные, некоторые аминокислоты и производные аминостероидов [http://old.consilium-medicum.com/media/refer/06_08/76.shtml]. При этом интоксикация некоторыми лекарственными препаратами, в том числе барбитуратами может вызвать обратимые когнитивные расстройства - дисметаболические деменции [Чухловина М.Л., 2010].
Известно применение в качестве лекарственных средств различных соединений калия. Главным образом, органические соли калия (калия оротат, калия аспарагинат, калия ацетат) и неорганические соли калия (калия хлорид). [Меньшиков В.В., 1987].
Известно применение калия хлорида (Kalii chloridum). Калий участвует в процессе проведения нервных импульсов и передачи их на иннервируемые органы. Введение в организм калия сопровождается повышением содержания ацетилхолина и возбуждением симпатического отдела нервной системы. При внутривенном введении отмечается увеличение выделения надпочечниками адреналина. Однако, этот препарат имеет противопоказания.
Так при неосторожном внутривенном введении препарат может вызвать интоксикацию (парестезии). В редких случаях может наблюдаться парадоксальная реакция - увеличение числа экстрасистол. При приеме внутрь могут появиться тошнота, рвота, диарея. Применение калия хлорида противопоказано при нарушениях атриовентрикулярной проводимости, при полной блокаде сердца, выделительной функции почек. В этих случаях калий накапливается в плазме крови, что может привести к интоксикации. Имеются данные о тяжелых осложнениях, имевших место после приема плохо растворимых лекарственных форм калия хлорида. Во избежание возможных осложнений, не рекомендуется применять калия хлорид в виде обычных таблеток
Известно также применение лекарственного средства аспаркам, содержащего калия аспарагинат и др. Этот препарат обладает свойствами, аналогичными свойствам калия хлорида. Однако в отличие от него оказывает значительно менее выраженное местное раздражающее действие на пищеварительный тракт и лучше переносится больными.
В качестве антиоксидантного нейропротекторного средства нами была исследована коменовая кислота и её производные соль – коменат калия.
Калий - основной катион внутриклеточной жидкости, важен для самых различных биологических процессов. Он важен для нервной и мышечной деятельности, поскольку образует электролитическую среду, необходим для поддержания осмотического давления и кислотно-щелочного равновесия, для нормальной работы нервных окончаний и мышечных клеток в проведении нервных импульсов в нервной и мышечной ткани. Главной функцией калия является формирование трансмембранного потенциала и распространение изменения потенциала по клеточной мембране путем обмена с ионами натрия по градиенту концентраций. Калий участвует в поддержании электрической активности мозга, функционировании нервной ткани, сокращении скелетных и сердечных мышц, замедляет ритм сердечных сокращений и, действуя аналогично блуждающему нерву, участвует в регулировании деятельности сердца, участвует в нормализации артериального давления. Известно, что снижение соотношения натрий/калий путем добавки в пищу калия снижает давление у гипертоников. Добавки калия могут снизить риск заболеваний сосудов мозга, а также почек и сердца [Скальный А.В., Рудаков И.А., 2004].
Коменовая кислота обладает антиоксидантным и нейротропным свойствами [Шурыгин А.Я., 2000].
Установлен ее выраженный ростстимулирующий эффект на культуры нейронов коры головного мозга пренатально стрессированных животных [Шурыгин А.Я., 2002]. Коменовая кислота обладает мягким седативным действием, не вызывающим привыкания, является высокоэффективным ненаркотическим анальгетическим средством, не имеющим негативных побочных эффектов, не вызывающих зависимости и привыкания, приводящий к долговременному снятию болевого синдрома. Обладает антиабстинентным, анксиолитическим и антидепрессантными свойствами. [Панова Т.И., 2005].
В связи с этим представлялось важным изучить влияние комената калия – биологически активного соединения включающего в себя катион калия и анион коменовой кислоты на функциональное состояние ЦНС в обычных условиях и после воздействия гипоксии [Шурыгин А.Я., 2014]. Ранее было показано, что коменат калия оказывает выраженное нейропротективное действие при глутаматной цитотоксичности, проявляет антиоксидантное действие in vitro в модельной системе ЦФЛ и in vivo в головном мозге стрессированных животных [Шурыгина Л. В., 2014].
2 Материалы и методы
2. 1 Методика тестирования животных в тесте «открытое поле»
Данный тест имеет множество интерпретаций, но строго говоря тест "открытое поле" был предложен (Hall, 1936) для регистрации поведения животных в ответ на "новые, потенциально опасные стимулы" [Буреш, Бурешова, Хьюстон, 1991].
Процедура включает подготовительный период и собственно тестирование.
Не менее чем за 60 минут до тестирования животных необходимо поместить в тихое, слабо освещенное помещение. В этот период исключаются перегруппировка животных, кормление, взятие в руки и другие активные манипуляции. Инъекции фармакологических веществ, проводимые в подготовительный период, должны быть выполнены максимально стандартным способом, так, чтобы погрешность опыта имела систематический характер.
Такие процедуры, как метка, перемещение из домашней клетки в другую, формирование новых групп (перегруппировка) и т.д нужно провести c животными не менее чем за 24 часа до тестирования.
Помещение животного внутрь арены.
Существуют несколько способов помещения животного в открытое поле (ОП): в центр арены или у ее стенки. Считается, что помещение животного в центр арены не влияет на его последующее поведение в 4-5-минутный тестовый период (относительно поведения животного, помещенного в арену у ее стенки).
Также распространен способ помещения животного в ОП вместе с боксом, где оно находилось в подготовительный период. Животное само выходит в освещенное пространство через открытую дверцу бокса. По сути, это является комбинацией тестов "Темная камера с отверстием" или "Темно-светлая камера" и ОП. С одной стороны, такие комбинации могут давать крайне интересные результаты и быть полезны для решения ряда задач. С другой стороны, в отличие от посадки в боксе, помещение животного непосредственно на пол арены создает условия для регистрации реакции животного на эмоциогенный фактор "неожиданность" (в ответ на неожиданный стимул крысы демонстрируют реакцию замирания (freezing)).
Регистрируемы параметры (формы поведения)
В тесте "Открытое поле" регистрируют горизонтальную и вертикальную двигательную активность, груминг, дефекацию. Кроме того, в ОП удобно наблюдать за отклонениями в моторной сфере, такими как шаткость походки, тремор и т.п.
Горизонтальная двигательная активность (ГДА) животных в ОП включает побежки по разным траекториям, вплоть до кружения вокруг одного места. Основным критерием для идентификации данной формы поведения является участие в перемещении животного всех четырех лап.
Пол арены расчерчен на три ряда секторов одинаковой площади, поэтому за единицу перемещения при визуальной регистрации поведения удобно принять один пересеченный сектор. Так как животное имеет длину, иногда даже равную длине основания сектора, то проблема регистрации перемещения решается следующим образом. Если животное находилось в пределах одного сектора (всеми четырьмя лапами), а затем перешло в смежный с ним (задние лапы пересекли разделяющую их линию), то считается, что пересечен один сектор.
Регистрируют ГДА на периферии, в 2/3 и в центре арены. Обсчет результатов целесообразно вести как по общей ГДА, так и по ГДА в различных зонах арены.
Вертикальная двигательная активность (ВДА) животных в ОП представлена двумя видами стоек: задние лапы животного остаются на полу арены, а передние упираются в стенку поля (Climbing) или остаются на весу (Rearing). Обсчет результатов можно вести как по общей ВДА, так и разделяя на Climbing и Rearing.
Груминг животных в ОП можно условно разделить на две категории: короткий и длительный. Короткий груминг характеризуется 1-2 быстрыми круговыми движениями лап вокруг носа и небольшой области около него, а длительный - умыванием области глаз, заведением лап за уши и переходом на умывание всей головы, лап, боков, туловища, ано-генитальной области, хвоста. Целесообразно раздельно обсчитывать число актов короткого и длительного груминга за тестовый период.
Обследование отверстий (находящихся в полу арены) представляет собой обнюхивание краев отверстий или засовывание головы внутрь отверстий "по глаза". Чаще всего "обследованием отверстий" называют вторую форму поведения.
Уровень дефекации считается индексом "эмоциональности" животного. Для определения уровня дефекации (и, соответственно, эмоциональности) многие исследователи подсчитывают число болюсов, оставленных животным во время пребывания в экспериментальной установке. Однако следует учесть, что вид корма, степень наполненности кишечника, а также различные фармакологические агенты могут существенно влиять на активность желудочно-кишечного тракта животного. Поэтому мы рекомендуем подсчитывать не число болюсов, а число актов дефекации.
Длительность эксперимента.
Данный параметр определяется исходя из целей конкретного эксперимента. Необходимо лишь учитывать, что поведение животных в первые 2-4 минуты тестирования связано с такими эмоциогенными факторами, как внезапность, необычность и новизна. В дальнейшем оно переходит в поведение патрулирования, которое внешне не отличается от первоначального, но имеет иные нейрохимические механизмы. Эти различия особенно важны для фармакологических исследований.
Арену протирают влажной губкой после тестирования каждого животного.
2. 3 Методика тестирования животных в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт
Автором данного теста является Handley S.L., Mithani S. [1984], но как и тест «открытое поле» он имеет различные вариации в зависимости от целей экспериментаторов.
Приподнятый крестообразный лабиринт широко применяется для изучения состояния тревожности грызунов путем оценки времени, потраченного животным на двух закрытых и двух открытых дорожках поднятого над уровнем пола лабиринта. Этот тест основан на конфликте между врожденным страхом, который животное испытывает перед открытым пространством, и одновременным стремлением исследовать незнакомое окружение.
Установка представляет собой крестообразную платформу с четырьмя длинными, узкими «плечами». Два противоположных «плеча» конструкции имеют высокие, непрозрачные стенки, два других являются открытыми. Вся установка приподнята над уровнем пола на значительную высоту, призванную вызывать у животного, оказавшегося на открытом плече чувство страха.
Продолжительность теста (на одно животное): 5 минут
Животное помещается в центр установки, в место пересечения «рукавов» платформы. Предполагается, что оно будет стремиться к исследованию незнакомого окружения, при этом вступая в борьбу с врожденным страхом открытого пространства а так же высоты (на открытых плечах)
Фиксируется время, проведенное на открытых плечах, моменты исследовательской активности, такие как свешивания вниз с открытых рукавов, перебежки между закрытыми рукавами.
Показатели:
- латентный период захода в открытый рукав
- время пребывания в закрытых и открытых рукавах
- число заходов в открытые и закрытые рукава
- количество свешиваний с рукава
2. 4 Методика исследования
В работе использована калиевая соль коменовой кислоты, синтезированная в отделе биологически активных веществ им. профессора А.Я. Шурыгина ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный университет». Коменат калия представляет собой кристаллический порошок желтого цвета, растворим в воде и спирте, молекулярная масса – 194,18.
Исследования проводились на крысах, самцах (n=53) массой 200-250 г. в возрасте 3 мес. линии «Вистар». Крысы являются удобной моделью для изучения влияния стресса, вызванного гипоксией, поскольку именно для них разработано большое количество поведенческих и обучающих методик. В период проведения опытов животные содержались в стационарных условиях специализированного вивария при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище (Приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 N 708н «Об утверждении правил лабораторной практики»). Эксперименты проводились с 9.00 до 13.00 в осенне-зимний период. Коменат калия вводили животным натощак, внутрижелудочно через зонд ежедневно в течение 3 дней, в дозе 4 мг/кг до начала экспериментальных манипуляций. Доза комената калия - 4 мг/кг установлена как наиболее фармакологически активная в ранее проведенных исследованиях его антиокислительной эффективности в головном мозге стрессированных животных. Контрольные животные получали воду очищенную в эквивалентном объёме. Влияние соединения оценивали в условиях нормоксии (без воздействия гипоксии) через сутки и 14 суток после гипоксического воздействия. Острую гипоксию с гиперкапнией моделировали у крыс, помещая их в герметичные сосуды, емкостью 1 л. Животные находились в таких условиях до появления первого агонального вздоха. После этого крыс извлекали и помещали в стандартные клетки.
Индивидуальное поведение животных изучали в двух тестах:
- «открытое поле» (установка площадью 1 м2, расчерченная на 100 квадратов, позволяла оценивать исследовательское поведение животных в условиях стресса, вызванного ярким освещением (лампа 200 ватт) и открытым пространством). (Исследования общей двигательной активности, эмоциональности)
- «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), представляет собой установку, имеющую два рукава, в месте пересечения которых находилась открытая площадка. Один из рукавов лабиринта имеет закрытые отсеки. Лабиринт устанавливали на высоте одного метра от пола. (Определяет уровень тревожности.) (Хабриев Р.У. 2005; Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. П. 1991 г.)
Все животные были разделены на 4 группы в соответствии с поставленной задачей: в 1 группу (контроль-интактный) вошли крысы, получавшие в процессе эксперимента воду очищенную и не подвергавшиеся «баночной гипоксии»; во 2 группу (контроль-коменат) – животные, получавшие водный раствор комената калия; 3 группа (контроль-гипоксия) – животные, получавшие воду и подвергшиеся воздействию «баночной» гипоксии с гиперкапнией; 4 группа (гипоксия-коменат) – животные, получавшие водный раствор комената калия и подвергшиеся «баночной» гипоксии с гиперкапнией.
Оценку изменений поведенческих реакций осуществляли через сутки и 14 суток после гипоксии.
Наблюдение за животными в «открытом поле» проводили в течение четырёх минут, учитывая число вертикальных стоек (вертикальная двигательная активность) и число пересечённых квадратов (горизонтальная двигательная активность)
Наблюдение за животными в «приподнятом крестообразном лабиринте» проводили в течении 5 мин, учитывая число ориентировочных реакций (вертикальная двигательная активность), число подходов к дистальному краю открытых рукавов, время в центре и свешивания.
Статистическую обработку данных проводили параметрическим методом. Для оценки достоверности различий выборок применяли t-критерий Стьюдента.
3 Результаты и обсуждение
3. 1 Исследование влияния комената калия на горизонтальную двигательную активность в тесте «открытое поле» в норме и условиях гипоксии с гиперкапнией
Результаты исследования представленные в табл. 1 показывают, что через сутки после гипоксического воздействия у крыс в группе 3 (контроль-гипоксия) отмечается выраженное снижение числа пересечённых квадратов на 36,81% в сравнении с группой 1(контроль-интактный), менее выраженное, на 24,32% наблюдается у негипоксированных крыс (группа 2) принимавших коменат калия. Выявленные нарушения поведенческих реакций у крыс, получавших коменат калия без гипоксии, возможно, связаны с некоторым угнетением функций ЦНС коменатом калия в нормальных условиях. В группе 4(гипокия-коменат) показатели были ниже в сравнении с группой 1(контроль-интактный) на 20,34%, но выше показателей группы 3(контроль-гипоксия) на 20, 67%. Таким образам, в группе 1отмечалось снижение в сравнении с интактным контролем горизонтальной двигательной активности. Однако эти изменения были значительно слабее, чем у животных в группе «гипоксия» и практически не отличались от уровня таковых в группе «коменат калия».
Сравнительный анализ данных горизонтальной двигательной активности крыс (табл. 1) в период с первых по четырнадцатые сутки показал, что к 14-м суткам горизонтальная двигательная активность животных повышается во всех группах, при этом в группе1(контроль-интактный) горизонтальная двигательная активность повысилась на 11,50%. Чуть ниже были показатели группы 3(контроль-гипоксия). (7,43%) (р<0,05). В группе 2 (контроль-коменат) на 14 сутки отмечалось повышение числа пересечённых квадратов на 29,11%, а в группе 4 (гипоксия-коменат) – 12,90%.
Таблица 1. Влияние комената калия на горизонтальную двигательную активность крыс в норме и в условиях гипоксии с гиперкапнией.
|
Показатели
|
Группа 1,
(n=11)
|
Группа 2,
(n=13)
|
Группа 3,
(n=14)
|
Группа 4,
(n=15)
|
|
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
|
Х
|
117,00
|
132,2
|
88,54
|
124,9
|
73,93
|
79,87
|
93,20
|
107,00
|
|
±m
|
11,60
|
20,32
|
7,96
|
14,46
|
10,38**
|
10,22*
|
13,66
|
13,20
|
**- р<0,01 в сравнении с группой «контроль 1» на 1 сутки; *- р<0,05 - в сравнении с группой «контроль 1» на 14 сутки;
Таким образом, значительный рост активности между 1-ми и 14-ми сутками отмечался в группе крыс 2 (контроль-коменат), получавших в процессе эксперимента коменат калия в дозе 4мг/кг и не подвергавшихся «баночной гипоксии», и в группе 4 (гипоксия-коменат), получавших коменат калия в дозе 4 мг/кг и подвергавших «баночной гипоксии».
В результате мы можем сделать вывод о том, что применение комената калия в дозе 4 мг/кг в норме и в условиях гипоксии повышает горизонтальную двигательную активность внутри групп на 14 сутки.
3. 2 Исследование влияния комената калия на вертикальную двигательную активность в тесте «открытое поле» в норме и условиях гипоксии с гиперкапнией
Результаты исследования представленные в табл. 1 показывают, что через сутки после гипоксического воздействия у крыс в группе 3 (контроль-гипоксия) отмечается выраженное снижение числа вертикальных стоек. Снижение вертикальной двигательной активности в сравнении с группой 1 (контроль-интактные), хотя и менее выраженное, наблюдается у негипоксированных крыс (группа 2) принимавших коменат калия и гипоксированных животных, принимавших коменат калия.
Сравнительный анализ данных вертикальной двигательной активности крыс (табл. 3) в период с первых по четырнадцатые сутки показал, что к 14-м суткам вертикальная двигательная активность животных повышается во всех группах, как и в случае с горизонтальной активностью. Так, в группе 1 (контроль-интактный) вертикальная двигательная активность повысилась на 40,79%. В группе 2 (контроль-коменат) на 14 сутки отмечалось повышение числа стоек на 25,43%, а в группе 4 (гипоксия-коменат) – 26,82% (р<0,01), что практически одинаково в этих группах. В в группе 3 (контроль-гипоксия) она повысилась всего на 10,80% (р<0,05).
Таблица 3. Общая вертикальная двигательная активность
|
Показатели
|
Группа 1,
(n=10)
|
Группа 2,
(n=11)
|
Группа 3,
(n=15)
|
Группа 4,
(n=15)
|
|
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
|
Х
|
7,46
|
12,60
|
7,39
|
9,91
|
5,29
|
5,93
|
6,93
|
9,47
|
|
±m
|
1,29
|
1,82
|
1,37
|
1,28
|
1,19
|
0,95 **
|
1,38
|
1,19 #
|
**-р<0,01 - в сравнении с группой 1 (контроль-интактный) на 14 сутки;
#-р<0,05 - в сравнении с группой 3 (гипоксия-контроль) на 14 сутки
Таким образом, значительный рост активности между 1-ми и 14-ми сутками отмечался в 1 группе крыс (контроль-интактный), получавших в процессе эксперимента воду очищенную и не подвергавшихся «баночной гипоксии», и в группах 2 (контроль-коменат) и 4 (гипоксия-коменат). При этом повышение исследовательской активности в группах 2 и 4 примерно одинаковое.
То есть, под влиянием комената калия у гипоксированных крыс отмечается восстановление нарушенной вертикальной двигательной активности.
Сравнивая вертикальную двигательную активность с учётом распределения по времени между поведением группы 1 (контроль-интактный) и группой 3 (контроль-гипоксия), установлено что на первые сутки после гипоксии активность группы 3 (контроль-гипоксия) в сравнении с группой 1 (контроль-интактный) снизилась на 2,17 (2), что соответствует 29,09%, а через 14 суток – на 6,67 (2), что соответствует 52,94% (табл. 4). Что указывает на прогрессирование во времени постгипоксических нарушений вертикальной двигательной активности.
Таблица 4. Разность вертикальной двигательной активности между группами
|
Показатели
|
Группа1/Группа 3
|
Группа 2/Группа 4
|
|
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
|
Х
|
7,46
|
5,29
|
12,60
|
5,93
|
7,39
|
6,93
|
9,91
|
9,47
|
|
1/ %
|
29,09
|
52,94
|
6,22
|
4,44
|
|
2
|
-2,17
|
-6,67
|
-0,46
|
-0,44
|
|
3
|
-4,5
|
0,02
|
Анализируя влияние комената калия с учётом распределения по времени действия на вертикальную двигательную активность группы 4 (гипоксия-коменат) в сравнении с группой 2 (контроль-коменат) оказалось, что вертикальная двигательная активность группы 4 на 1 сутки была меньше чем в группе 2 на 0,46(2), что соответствует 6,22 %. А к 14 суткам на 0,44 (4,44%). Что практически одинаково в этих группах.
В тоже время при сравнении разности 3 между показателями вертикальной двигательной активности (таблица 4) в группах крыс 1 (контроль-интактный)/3 (контроль-гипоксия) наблюдается понижение активности на 4,5 вертикальных стоек а в группах 2 (контроль-коменат)/ 4 (гипоксия-коменат) повышение активности на 0,02 вертикальных стоек.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что предварительное введение раствора комената калия крысам может предотвратить нарушение их поведенческих реакций «вертикальная двигательная активность» в тесте «открытое поле» в условиях гипоксии с гиперкапнией.
3. 3 Исследования влияния комената калия на тревожность крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» в норме и в условиях гипоксии с гиперкапнией.
Результаты изучения влияния комената калия на тревожность крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» в нормальных условиях и после воздействия гипоксии с гиперкапнией в период с первых по 14-е сутки показали, что к 14-м суткам все показатели внутри групп по данному тесту возрастают почти во всех случаях.
Так, в группе 1 (контроль-интактный) подходы к дистальному краю к 14 суткам возросли на 86,3%. В группе 2 (контроль-коменат) на отмечалось повышение подходов на 54%, а в группе 4 (гипоксия-коменат) – 60%, что примерно одинаково в этих группах. В группе 3 (контроль-гипоксия) повышения данного показателя к 14 суткам не было.
Количество свешиваний к 14 суткам в группе 1 (контроль-интактный) было повышено на 35,74%. В группе 2 (контроль-коменат) в сравнении с группой 1 данный показатель был снижен и составил 12,28%, что говорит о негативном влиянии комената на количество свешиваний в данном тесте. Самое высокое возрастание показателя было в группе 4 (гипоксия-коменат), где количество свешиваний к 14 суткам увеличилось на 53,28%. В группе 3 (гипоксия-контроль) показатель вырос на 12,36%.
При оценке влияния комената калия на время нахождения в центре, результаты были следующими: в группе 1(контроль-интактный) время возросло с 1-х по 14-е сутки на 36,78%, а в группе 2 (контроль-коменат) на 44,60%, что примерно одинаково в этих группах. В группе 3 (контроль-интактный) время нахождения в центре было увеличено на 56,52%, а в группе 4 (гипоксия-коменат) на 68,08 %.
Сравнительный анализ данных по вертикальной двигательной активности крыс (табл. 5) в период с первых по четырнадцатые сутки показал, что к 14-м суткам вертикальная двигательная активность животных в группе1(контроль-интактный) повысилась всего на 9,8%, что ниже показателя группы 3 (контроль-гипоксия), где он повысился 19,9% . В группе 2 (контроль-коменат) на 14 сутки отмечалось повышение числа стоек на 32,7%, а в группе 4 (гипоксия-коменат) – 50,1% (р<0,05).
Таблица 5. Влияние комената калия на поведенческие реакции крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»
|
Показатели
|
Группа 1,
(n=11)
Х ± m
|
Группа 2,
(n=13)
Х ± m
|
Группа 3,
(n=14)
Х ± m
|
Группа 4,
(n=15)
Х ± m
|
|
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
1 сутки
|
14 сутки
|
|
Подходы к дистальному краю
|
0,10 ±0,10
|
0,73
±0,38
|
0,23
±0,12
|
0,5
±0,34
|
0,07
±0,07
|
0,07
±0,07
|
0,08
±0,08
|
0,20
±0,14
|
|
Свешивания
|
2,14 ±0,86
|
3,33 ± 0,95
|
1,00 ±0,38
|
1,14 ±0,55
|
0,78 ±0,36
|
0,89 ±0,51
|
0,57±0,43
|
1,22±0,40
|
|
Время в центре
|
28,10±4,53
|
44,45±8,78
|
20,54±5,79
|
37,08± 6,17
|
14,87±3,76
|
34,20±7,36
|
14,3±3,55
|
44,80±8,98
|
|
ОР (ориентировочные реакции)
|
10,90 ±1,80
|
12,09 ±2,09
|
8,54 ±1,56
|
12,17 ±2,23
|
7,47 ±1,99
|
9,33 ±1,84
|
5,92 ±1,29*
|
11,87 ±1,73
|
*- р<0,05 - в сравнении с группой «контроль 1» на 1 сутки;
Таким образом, значительный рост активности между 1-ми и 14-ми сутками отмечался в группе 4 (гипоксия-коменат) и в группе 2(контроль-коменат), причём повышение исследовательской активности в группе 4 максимально высокий в сравнении с другими группами.
Из этого следует, что под влиянием комената калия у гипоксированных крыс отмечается восстановление нарушенной вертикальной двигательной активности.
Полученные нами данные свидетельствуют о возможности предотвращения постстрессорных нарушений ЦНС, благодаря применению комената калия в качестве нейпротекторного средства.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, учитывая, что двигательная активность является одним из объективных показателей возбудимости ЦНС, а поведение – функциональной производной активности мозга и те факты, что антиоксиданты влияют на различные нейродегенеративные патологические процессы, представлялось важным изучить влияние нового фармакологического средства комената калия на функциональное состояние ЦНС в обычных условиях и после воздействия гипоксии. Коменат калия – биологически активное соединение включает катион калия и анион коменовой кислоты.
1. Исследование влияния комената калия на поведенческие реакции крыс в норме показало, что коменат калия незначительно снижает активность поведенческих реакций в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт.
2. Исследования влияния комената калия на поведенческие реакции крыс в условиях гипоксии с гиперкапнией показало, что предварительное введение комената калия в дозе 4 мг/кг в течение трех дней, способствует ослаблению постгипоксических изменений поведенческих реакций у животных
Вывод: Результаты проведённых исследований указывают на возможность предотвращения постстрессорных нарушений ЦНС, благодаря применению комената калия в качестве протекторного средства.
Список используемых источников
1 Шахмарданова С. А., Шахмарданов А. З. Антигипоксическая активность металлокомплексов цинка, кобальта и железа и их влияние на поведение животных/ Вестник ВГУ, серия: биология, фармация, 2014, - №4- С. 142 – 145.
2 Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга, М.: Медицина, 2001. — 328 с.
3 Nonaka Sh., Katsube N. and Chuang D.-M. Lithium Protects Rat Cerebellar Granule Cells against Apoptosis Induced by Anticonvulsants, Phenytoin and Carbamazepine // JPET. 1998. V.286. P.539-547.
4 Карнеев А.Н., Соловьева Э.Ю. и др. Использование препаратов альфа-липоевой кислоты в качестве нейропротективной терапии хронической ишемии мозга. Справочник поликлинического врача. http://old.consilium-medicum.com/media/refer/06_08/76.shtml.
5 Чухловина М.Л. Деменция. Диагностика и лечение. Санкт-Петербург: 2010. С.60
6 Крю Ж. Биохимия, Медицинские и биологические аспекты, пер. с франц. М., 1979. с.46;
7 Меньшикова В.В. Лабораторные методы исследования в клинике, под ред. В.В. Меньшикова. М., 1987. С.261, 263; http://dic.academic.ru/
8 Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М.: 2004. 272 с. http://www.adlshop.ru/node/121.
9 Шурыгин А.Я., Колендо С.В., Югай Г.А. Антиоксидантное действие коменовой кислоты. Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2000. №1. С.100-101,
10 Шурыгин А.Я. Препарат бализ. 2002. 416 с.
11 Панова Т.И. Механизмы влияния коменовой кислоты на интегративную деятельность мозга / Теоретическая и экспериментальная медицина. Медицина сегодня и завтра. 2005. №1. С.28-33.
12 Бэр М. К. Нейропротекция: модели, механизмы, терапия. М. 2011. 436 с.
13 Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М. 2001. 328 с.
14 Исайкин А.И. Патогенетические аспекты терапии ишемического инсульта // Трудный пациент. 2010. Т. 8. № 4. С. 27–30.
15 Беленичев И.Ф., Бухтиярова Н.В., Середа Д.А. Современные направления нейропротекции в терапии острого периода патологии головного мозга различного генеза // Международный неврологический журнал. 2010. № 2(32). С. 76–86.
16 Литвицкий П.Ф., Патофизиология, М., ГЭОТАР-МЕД, 2002
17 Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. Под общ. ред. Ю.Л.Шевченко. –СПб, ООО «Элби-СПБ», 2000, 384 с.
18.Чеснокова Н.П. Типовые патологические процессы : Монография / Издательство Сара-товского медицинского университета. 2004. –400 с.
19. Шевченко Ю. Л. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. Под общ. ред.. –СПб, ООО «Элби-СПБ», 2000, 384 с.
20 Пальцева М.А. – М. Медицина, 1999. – С. 401-442.
21 Almeida R.D., Manadas B.J., Melo C.V., Gomes J.R., et al. Neuroprotection by BDNF against glutamate-induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3-kinase pathways. Cell death and differentiation 2005; 12(10): 1329–1343.
22. Hall C.S Emotional behavior in the rat. III. The relationship between emotionality and ambulatory activity. 1936. J. comp. physiol. Psychol. vol. 22, pp. 345-352.
23 Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. 1991. Москва. 399.
24 Мажитова М.В., Ломтева М.А., Теплый Д.Л., Тризно Н.Н., Кондратенко Е.И. // Известия Самарского научного центра РАН. 2009. Т. 11 № 1 (5). С. 988-990.
25 Новиков В.Е., Дикманов В.В., Марышева В.В. // Экспер. и клин. фармакол. 2012. Т. 75. № 9. С. 7-10.
26 Поварова О.В., Каленикова Е.И., Городецкая Е.И., Медведев О.С. // Экспер. и клин. фармакол. 2003. Т. 66. № 3. C. 69–73.
27 Смирнова И.Н., Фёдорова Т.Н., Танашян М.М., Суслина З.А. // Нервные болезни. 2006. № 1. С. 33–36.
28 Суслина З.А., Максимова М.Ю. // Нервные болезни. 2004. № 3. С. 4–7.
29 Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому ) изучению новых физиологических веществ. Москва. 2005.
30 Шабанов П.Д., Зарубина И.В., Новиков В.Е., Цыган В.Н. Метаболические корректоры гипоксии, Белевитин А.Б. С-П. 2010.
31 Шурыгин А.Я., Злищева Э.И.,. Кравцов А.А, и др., Патент РФ 2 514 632 (2012); Бюл 2014. № 12.
32 Шурыгина Л.В., Кравцов А.А., Злищева Э.И., Немчинова Е.А., Букин Д.Ю. / Бюл. экспер. биол. 2014. Т. 158. № 7. С. 56-59.
33 Шурыгина Л.В., Кравцов А.А., Злищева Э.И., Полещук Л.А., Абрамова Н.О., Кондратова Л.А. / Материалы XIII Международной научно-практической конференции. Проблемы современной биологии: М. 2014. № 13. С. 10-13.
34 Chen K, Suh J, Carr AC, Morrow JD, Zeind J, Frei B. Am J. Physiol Endocrinol. 2000. V. 279. P. 1406 –14 12.
35 Dawson G.R. and Tricklebank M.D. TiPS. 1995. V. 16. P.33-36.
36 Gilgun-Sherki Y., Rosenbaum Z., Melame E., Offen D. // Pharmacological Reviews. 2002. V. 54. №. 2. Р. 271-284.
37 Типовые патологические процессы /Н.П.Чеснокова: Монография /- Издательство Саратовского медицинского университета. 2004. –400 с.
38 Литвицкий П.Ф. Патофизиология. Моск-ва. ГЕОТАР, 2003. – Т. 1. – 752 с.
39 Леонова Е.В.Гипоксия (патофизиологические аспекты): Метод. рекомендации /Е.В. Леонова, Ф.И. Висмонт – Мн.: БГМУ, 2002. – 22 с.
40 Окороков А.И. Диагностика болезнейсердца и сосудов /А.И. Окороков //Диагностикаболезней внутренних органов: Т. 6. - М.: Мед.лит., 2002. – 464 с.: ил. – с. 92-114.
41 Патологическая физиология и биохимия:Учебное пособие для ВУЗов /- М.: Издательство «Экзамен». 2005. – 480с. – с.140-151.
42 Скулачев В.П. Явления запрограммиро-ванной смерти. Митохондрии, клетки и органы:роль активных форм кислорода. //Соросовский Образовательный Журнал, том 7, №6, 2001. – с.4-10.
43 Патологическая физиология //Под. ред.А.И. Воложина, Г.П. Порядина. – Т. 2. – М.:МЕДпресс, 2000. – 527 с.
44 Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы общей патологии. Часть 2. /А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов. – Основы патохимии. – СПб.: ЭЛБИ,2000. – 687с. – с.363-364.
45 Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. Под общ. ред. Ю.Л.Шевченко. – СПб, ООО «Элби-СПБ», 2000, 384 с.
46 Руководство по общей патологии. Под ред. Н.К. Хитрова, Д.С. Саркисова, М.А. Пальцева. – М. Медицина, 1999. – С. 401-442.
47 Nonaka Sh., Katsube N. and Chuang D.-M. Lithium Protects Rat Cerebellar Granule Cells against Apoptosis Induced by Anticonvulsants, Phenytoin and Carbamazepine // JPET. 1998. V.286. P.539-547.
48 Карнеев А.Н., Соловьева Э.Ю. и др. Использование препаратов альфа-липоевой кислоты в качестве нейропротективной терапии хронической ишемии мозга. Справочник поликлинического врача. http://old.consilium-medicum.com/media/refer/06_08/76.shtml.
49 Лабораторные методы исследования в клинике, под ред. В.В. Меньшикова. М., 1987. С.261, 263
50 Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М.: 2004. 272 с.
51 Шурыгин А.Я., Колендо С.В., Югай Г.А. Антиоксидантное действие коменовой кислоты. Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2000. №1. С.100-101
52 Гусарук Л.Р. Влияние перенесенного стресса на морфофункциональные особенности культивируемых нейронов крыс Шурыгин А.Я. Препарат бализ. 2002. 416 с.
ВЛИЯНИЕ КОМЕНАТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЦНС В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ С ГИПЕРКАПНИЕЙ У КРЫС