УЛЬТРАСТРУКТУРА ВИРУСОВ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ. ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ)

1.4: «УЛЬТРАСТРУКТУРА ВИРУСОВ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ. ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ)».

ПЛАН

Природа и гипотезы происхождения вирусов.
Морфология, ультраструктура и биологические особенности вирусов.
Явление бактериофагии. Морфология, структура и биологические свойства фагов.
Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Лизогения.
Выявление фагов в объекте окружающей среды, применение бактериофагов в диагностике, профилактике и терапии инфекционных болезней.

1. Исторические данные

В последние годы мы все чаще и чаще слышим, да и сами произносим это слово «вирус». А между тем, еще несколько десятилетий назад оно совершенно отсутствовало в нашей разговорной речи, встречалось, кстати, довольно редко в специальной литературе.

Слово «вирус» известно было еще в древнем мире. Оно обозначало сок, слизь, семя животных, яд, а в переносном смысле - ядовитость, язвительность. Древние греки словом «вирус» называли змеиный яд. Во 2 веке нашей эры вирусом стали называть слюну бешеной собаки. Это было уже ближе к правильному пониманию природы вирусов. Наши отдаленные предки как бы интуитивно чувствовали, что есть какие-то неизвестные, таинственные и враждебные человеку существа. Недаром в научных трудах 18 века и начала 19 веков словом «вирус» обозначали вещества и предметы, соприкосновение с которыми сулит человеку заболевание, а то и смерть.

Лишь в конце 18 столетия понятие «вирус» конкретизировалось и стало употребляться только для обозначения болезнетворных организмов, которые не видны в обычный микроскоп.

Мир вирусов огромен, необъятен, и роль этих загадочных сверх мельчайших существ в жизни человека, животных, растений очень велика. О той опасности, которую они представляют для человека, позволяют судить такие цифры: к настоящему времени науке известно более 600 болезнетворных вирусов, и ученые продолжают обнаруживать все новые и новые их разновидности … . Более 75% инфекционных болезней вызываются вирусами.

Вирусология - наука о вирусах - наряду с микробиологией и иммунологией входит в обширный комплекс медико-биологических дисциплин. Однако ее значение не ограничивается только медицинскими интересами. Вирусология занимает выдающееся место в биологии и генетике, молекулярной биологии, ветеринарии, фитопатологии.

Честь открытия вирусов принадлежит нашему соотечественнику русскому ученому Дмитрию Иосифовичу Ивановскому.

Как же это произошло?

Таинственное заболевание –мозаика табака - многие годы опустошало табачные плантации юга России. Желая помочь табаководам, Петербургское общество ес-тествоиспытателей направило на юг для изучения этого заболевания наиболее способных студентов –ботаников - Д. И. Ивановского и его товарища В.В. Половцева. Так, за год до окончания университета, Д.И.Ивановский приступил к исследованиям, которым он посвятил впоследствии 15 лет и результаты которых принесли ему мировую известность.

В результате этих опытов по выявлению этиологии табачной мозаики он пришел к выводу, что, по-видимому, существуют какие-то сверх мельчайшие микроорганизмы, не видимые в обычный микроскоп, не размножающиеся на искусственных питательных средах, способные проходить через самые мелкие поры свечей Шамберлена и при всем этом сохраняющие болезнетворные свойства, т. е. он описал основные свойства вирусных частиц.

Свои выводы 28-летний ученый доложил на научном заседании Российской Академии наук 12 февраля 1892 г. Дата эта вошла в историю как день рождения вирусологии. Приоритет русского ученого в открытии вирусов неоспорим и признан повсеместно. Однако, Д. И. Ивановский сделал, если можно так выразиться, «косвенное» открытие. Он описал все свойства открытых им сверх мельчайших существ, высказал суждения об их размерах, субстанции, паразитических наклонностях, доказал способность вирусов вызывать заболевания. Более того, Д. И. Ивановский впервые увидел и описал скопления кристаллов вирусов табачной мозаики. Но самого вируса ни он, ни М.Бейеринк (голландский ученый также проводил эксперименты с соком зараженных табачных растений, но первую публикацию о результатах исследований он сделал в 1898г, т.е. спустя 6 лет после Д.И.Ивановского), ни другие ученые, их современники, увидеть не смогли.

Понадобилось 40 лет для того, чтобы изготовить оптический прибор, который позволил бы преодолеть «барьер невидимости» вирусов. Этим прибором стал электронный микроскоп, изготовленный Кнолем и Руска в 1932г. В 1938 г. электронный микроскоп был использован для изучения и демонстрации вирусных частиц-возбудителей табачной мозаики.

Умозрительное открытие Д. И. Ивановского получило блестящее визуальное подтверждение!

2. Природа вирусов

Долгие годы ученые вели споры: к какому миру следует относить вирусы-живому или неживому? Допускалась и третья возможность, что вирусы лежат где-то посередине между органическим и неорганическим мирами…

Аргументы в пользу живой природы вирусов:

.Универсальная химическая природа: состоят из белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

.Для вирусов характерна наследственность и изменчивость, как для всех живых существ.

.Характерно размножение (репродукция).

.Характерна инфекционность и способность вызывать заболевание.

Аргументы в пользу неживой природы вирусов:

1.Вирусы не имеют клеточного строения.

.Имеют одну нуклеиновую кислоту (или ДНК, или РНК).

.Не имеют собственного обмена веществ.

.Способны выпадать в кристаллы, не отличающиеся от других неживых кристаллов.

.Феномен инфекционности изолированных вирусных нуклеиновых кислот.

И только в последнее время исследователи пришли к мнению, что вирусы –это живые существа. Большинство русских и белорусских вирусологов считает вирусы живыми организмами.

Гипотезы происхождения вирусов:

Вирусы- первичная форма жизни на Земле (проф. Рыжков, Жданов)
Вирусы - результат регрессивной эволюции бактерий (Грин, 1935г.)
Вирусы - продукт эволюции субклеточных структур (Эндрюс, 1966г.)

3. Морфология, ультраструктура,

размеры вирусных частиц.

Вирусы относят к царству Vira.

Это мельчайшие микроорганизмы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только один тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Морфологию и структуру вирусов изучают с помощью электронного микроскопа, т.к. их размеры малы и сравнимы с толщиной оболочки бактерий. Форма вирионов может быть различной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги-вирусы бактерий).

Размеры вирусов определяют с помощью электронной микроскопии, методов ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентри-фугирования. Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15-18 до 300-400нм (1 нанометр-единица длины, равная одной десятимиллионной доли сантиметра). Поэтому их принято делить на три группы:

. крупные - имеют размеры в пределах 200-400 нм (вирусы натуральной оспы);

. средние - 70-120 нм (вирусы гриппа, бешенства);

. мелкие - величина не превышает 22-28 нм (вирусы полиомиелита, ящура, японского энцефалита).

Различают просто устроенные (например, вирус полиомиелита) и сложно устроенные (например, вирусы гриппа, кори) вирусы. Простой вирион состоит из нуклеиновой кислоты - нуклеоид, плотно упакованной в белковую оболочку - капсид, который состоит из повторяющихся морфологических субъединиц - капсомеров. Нуклеиновая кислота и белковая оболочка вместе называются нуклеокапсид. Таким образом, простой вирион по морфологической структуре является нуклеокапсидом.

Сложно устроенные вирионы в отличие от простых, кроме указанных структур, имеют еще внешнюю оболочку, которая окружает капсид и называется суперкапсид. Эта дополнительная липопротеидная оболочка - производное мембранных структур клетки-хозяина, в которой паразитирует вирус. Вирусные капсиды имеют удивительно упорядоченную организацию, в основе которой лежит тип симметрии. Вирионы имеют спиральный, кубический и сложный тип симметрии капсида.

Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида. Кубический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от воздействий окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с определенными клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов.

Строение вирионов отдельных вирусов, вызывающих заболевания у человека, будет рассмотрено в разделе частной вирусологии.

. Классификация вирусов

Временная классификация и таксономия вирусов были приняты на 9 Международном конгрессе микробиологов, который состоялся в Москве в 1966 году. В основу этой классификации положены следующие свойства вирионов: тип нуклеиновой кислоты, ее молекулярная масса, процентное содержание ее в вирионе, форма вириона, тип симметрии белков капсида, число капсомеров, учитывались также данные о типе хозяина и переносчика.

В принятой классификации все вирусы включены в царство Vira, которое подразделено на два подцарства по типу нуклеиновой кислоты –дезоксивирусы (ДНК-содержащие) и рибовирусы (РНК-содержащие). Подцарства делятся на семейства, роды, виды. Вирусы позвоночных объединены в 18 семейств, содержащих 32 рода. Вид вируса биноминального названия, как у бактерий, не получил.

ТАБЛИЦА 2.1

Классификация и некоторые свойства основных вирусов.

Семейство вирусов

Наличие суперкапсида

Размер вириона (нм)

Типовые представители

Аденовирусы	_	70-90	Аденовирусы человека
Гепаднавирусы	+	-50	Вирус гепатита В
Герпесвирусы	+	200	Вирус простого герпеса
Паповавирусы	_	45-55	Вирус папилломы, полиомы
Парвовирусы	_	-26	Аденоассоциированный вирус
Поксвирусы	+	-240	Вирус натуральной оспы

Аренавирусы	+	-300	Вирус Ласса, Мачупо
Буньявирусы	+	-100	Вирус лихорадки с почечным синдромом
Калицивирусы	-	-30	Калицивирус человека
Коронавирусы	+	-130	Коронавирус человека
Ортомиксовирусы	+	-120	Вирус гриппа
Парамиксовирусы	+	-300	Вирус кори, паротита, парагриппа
Пикорнавирусы	-	-30	Вирусы полиомиелита, Коксаки А и В, гепатита А
Рабдовирусы	+	-175	Вирус бешенства
Реовирусы	-	-80	Реовирусы, ротавирусы
Ретровирусы	+	-100	Вирус лейкоза человека, иммунодефицита человека
Тогавирусы	+	-90	Вирус лошадиных энцефалитов
Флавивирусы	+	-90	Вирус клещевого и японского энцефалитов, желтой лихорадки, краснухи.

5. Биологические особенности вирусов.

Взаимодействие вируса с клеткой.

В отличие от про- и эукариотических микроорганизмов вирусы не размножаются бинарным делением. В 50-х годах было установлено, что вирусы размножаются путем репродукции, т.е.воспроизведения их нуклеиновых кислот и синтеза белков «клеткой-хозяином»с последующей сборкой вирионов. Эти процессы происходят в разных частях клетки-хозяина, например в ядре и цитоплазме. Такой разобщенный способ репродукции получил название дизъюнктивного.

Вирусная репродукция, хотя и осуществляется согласно триаде ДНК РНК белок, представляет собой уникальную форму выражения чужеродной (вирусной) информации в клетках человека, животных, насекомых, растений, бактерий. Эта уникальность состоит прежде всего в подчинении клеточных матрично-генетических механизмов вирусной информации.

Поскольку вирусы не имеют собственного метаболизма, они не нуждаются в ферментах, необходимых для многочисленных катаболических и анаболических реакций. Однако у вирусов обнаружено свыше 10 ферментов, разных по своему происхождению и функциональному назначению.

По происхождению вирусные ферменты делятся на три группы:

1. вирионные - входят в состав вирионов;

. вирусиндуцированные - ферменты, структура которых закодирована в геноме вируса, а синтез происходит на рибосомах клетки-хозяина;

. клеточные, модифицированные вирусом - это ферменты клетки-хозяина, которые не являются вирусспецифическими и которые участвуют в репродукции вируса.

По функциональному значению вирусные ферменты можно подразделить на 2 группы:

1) ферменты, участвующие в процессе репликации и транскрипции вирусной нуклеиновой кислоты;

) ферменты, способствующие проникновению вирусной НК в клетку-хозяина и выходу образовавшихся вирионов.

Известны три типа взаимодействия вируса с клеткой:

1) продуктивный тип, завершающийся образованием вирусного потомства;

) абортивный тип, не завершающийся образованием новых вирусных частиц, поскольку инфекционный процесс прерывается на одном из этапов;

) интегративный тип (или вирогения), характеризующийся встраиванием вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.

ПРОДУКТИВНЫЙ ТИП взаимодействия (репродукция вирусов) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга:

. Адсорбция вируса на клетке, т.е. прикрепление вирусов к поверхности клетки. Вирус адсорбируется на клеточных рецепторах разной химической природы (белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды), число которых на поверхности одной клетки колеблется между 104 и 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц. Поверхностные структуры вируса, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из поверхностных белков капсида или суперкапсида. Соответствие (комплементарность) клеточных рецепторов вирусным прикрепительным белкам определяет возможность возникновения инфекционного процесса в клетке; от этого зависят спектр клеток, поражаемых вирусом, или его тропизм, и в ряде случаев, чувствительность организма к данному вирусу.

. Проникновение вируса в клетку: существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной.

При виропексисе, после адсорбции вирусов, происходит инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки.

Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочек.

По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

. «Раздевание» вируса: процесс заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, а конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота.

. Биосинтез компонентов вируса; проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генети-ческой информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.

Синтез компонентов вируса (белков и нуклеиновых кислот) разобщен во времени и пространстве, т.е. протекает в разных структурах ядра и цитоплазмы клетки. Вот почему этот уникальный способ размножения вирусов называется дизъюнктивным (разобщенным).

. Формирование (сборка) вирионов: синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически узнавать друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодейст-вуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа). Формирование вирусов происходит на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки.

. Выход вирусов из клетки: различают 2 основных типа выхода вирусного потомства из клетки:

а) взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой тип выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсида.

б) почкование - он присущ вирусам, имеющим суперкапсид. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.

Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5-6 часов (вирусы гриппа, натуральной оспы) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции.

ИНТЕГРАТИВНЫЙ ТИП ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ (ВИРОГЕНИЯ) характеризуется встраиванием (интеграцией) нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки. При этом вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома.

Интеграция вирусного генетического материала с ДНК клетки характерна для определенных групп вирусов: бактериофагов, онкогенных (опухолеродных) вирусов, вируса гепатита В, вирус герпеса, ВИЧ.

Для интеграции с хромосомой клетки необходима кольцевая форма двунитчатой вирусной ДНК. У ДНК-содержащих вирусов (вирус гепатита В) их ДНК обладает свойством встраиваться в геном клетки при участии ряда ферментов. У некоторых РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, онкогенные вирусы) сначала на матрице РНК с помощью вирусспецифического фермента синтезируется ДНК-копия, которая затем встраивается в ДНК клетки. ДНК вируса, находящаяся в составе хромосомы клетки, называется ДНК-провирусом.

При делении клетки, сохраняющей свои нормальные функции, ДНК-провирус переходит в геном дочерних клеток, т.е. состояние вирогении наследуется. ДНК-провирус несет дополнительную генетическую информацию, в результате чего клетка приобретает ряд новых свойств. Так, интеграция может явиться причиной возникновения ряда аутоиммунных и хронических заболеваний, разнообразных опухолей. Под воздействием ряда физических и химических факторов ДНК-провирус может вырезаться из клеточной хромосомы и переходить в автономное состояние, включаясь в обычный цикл репродукции.

6. Культивирование и индикация вирусов.

Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, получения диагностических и вакцинных препаратов, в научно-исследовательской работе.

Поскольку вирусы являются абсолютными паразитами, то их культивируют или на уровне организма, или на уровне живых клеток, выращиваемых вне организма в искусственных условиях. В качестве биологических моделей для культивирования используются лабораторные эмбрионы и культуры клеток.

Лабораторные животные (белые мыши, хлопковые крысы, кролики, хомяки, обезьяны) в начальный период развития вирусологии были единственной экспериментальной биологической моделью, которую использовали для размножения и изучения свойств вирусов. На основании развития типичных признаков заболевания и патоморфо-логических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, т.е. проводить индикацию вирусов. В настоящее время использования этой модели для диагностики ограничено из-за невосприимчивости животных ко многим вирусам человека.

Куриные эмбрионы предложены в качестве экспериментальной модели для культивирования вирусов в середине 30-х годов Ф.Бернетом. К достоинствам модели относится возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша (демонстрация табл. № ).

Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела эмбриона, а также феномену гемагглютинации - склеиванию эритроцитов. Явление гемагглютинации впервые было обнаружено в 1941г. при культивировании в куриных эмбрионах вирусов гриппа. Позднее было установлено, что гемагглютинирующими свойствами обладают многие вирусы. На основе этого феномена была разработана техника реакции гемагглютинации (РГА) вне организма, которая широко применяется для лабораторной диагностики вирусных инфекций. Куриные эмбрионы не являются универсальной биомоделью для вирусов. Почти неограниченные возможности появились у вирусологов после открытия метода выращивания культур клеток.

Метод культур клеток - выращивание различных клеток и тканей вне организма на искусственных питательных средах –разработан в 50-х годах Дж. Эндерсом. Подавляющее большинство вирусов способно размножаться на культурах клеток. Для приготовления культур клеток используют самые разнообразные ткани человека, животных и птиц. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих по сравнению с нормальной тканью взрослого организма более активной способностью к росту и размножению. В зависимости от техники изготовления и культивирования различают 3 основных типа культур клеток и тканей:

) однослойные культуры клеток;

) культуры суспензированных клеток;

) органные культуры.

Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры, растущие на поверхности стекла лабораторной посуды в виде монослоя клеток (рис. 3.4,а).

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций в свою очередь подразделяют на первичные, или первичнотрипсинизированные (способные размножаться однократно), перевиваемые (способные перевиваться в лабораторных условиях в течение неопределенно длительного срока) и полуперевиваемые (способные размножаться в течение 40-50 пассажей).

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они могут быть использованы для накопления большого количества вирусов.

Некоторые вирусы лучше размножаются в органных культурах, которые представляют собой кусочки органов животного или человека, выращиваемых вне организма и сохраняющих свойственную данному органу структуру.

В зависимости от свойств вируса подбирают наиболее чувствительную к данному вирусу культуру клеток, на которой возможна его репродукция. О размножении вирусов в культуре клеток судят по следующим признакам:

цитопатическому эффекту (ЦПЭ, ЦПД);
образованию в клетках включений;
образованию бляшек;
феномену гемадсорбции;
«цветной» реакции (цветной пробе).

ЦПЭ - видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до их гибели (рис. 3.4,б). Характер ЦПЭ, вызванный разными вирусами, неодинаков, например размножение вируса полиомиелита сопровождается дегенерацией клеток, а вирусы парагриппа репродуцируются в клеточных культурах, вызывая слияние клеток с образованием многоядерных гигантских клеток-синцития.

Включения представляют собой скопления вирусных частиц (тельца Пашена при натуральной оспе), вирусных белков или клеточного материала, которые можно обна-ружить в ядре или цитоплазме клеток при специальных методах окраски (включения Бабеша-Негри при бешенстве, включения Гварниери при натуральной оспе).

Бляшки или «негативные колонии» вирусов - участки разрушенных вирусами клеток –можно обнаружить при культивировании вирусов на однослойных клеточных культурах, покрытых тонким слоем агара (демонстрация табл. № ) бентонитового покрытия (демонстрация флакончиков с бляшками вируса полиомиелита).

Бляшки, образуемые разными вирусами, отличаются по величине, форме, времени появления, поэтому феномен бляшкообразования используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции - способность клеточных культур, зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Механизмы реакций гемадсорбции и гемагглютинации сходны. Многие вирусы обладают гемадсорбирующими свойствами.

«Цветная» реакция (проба) основана на разнице в цвете питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, происходит накопление продуктов метаболизма, что приводит к изменению цвета питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается нормальный метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет (демонстрация ЦП).

Бактериофаги.

Бактериофаги (от. лат. Bacteriophagia - разрушающий бактерии) –вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их растворение (лизис) или вступающие с ними в симбиоз.

8.История открытия явления бактериофагии.

История открытия явления бактериофагии связано с именами Н. Ф. Гамален, наблюдавшего спонтанный лизис бактерий (1898 г.), Ф. Туорта, описавшего феномен «стекловидного» перерождения стафилококка (1915) и с именем канадского исследователя Ф. д' Эрелля (1917), который обнаружил эффект лизиса бактерий, выделенных, из испражнений больного дизентерией. Ф. д' Эрелль первый предположил, что имеет дело с вирусом, выделил этот «литический фактор» с помощью бактериальных фильтров и назвал его бактериофагом, а действие бактериофагов, заканчивающихся лизисом бактерий,- феноменом бактериофагии.

На твердых средах, засеянных смесью бактерий и фагов, в местах лизиса бактериальных клеток образуются стерильные пятна, или негативные колонии, а посев бактерий с бактериофагом в жидкую среду ведет к полному просветлению среды.

Ф. д' Эрелль считал, что все бактериофаги относятся к одному виду, но позднее было установлено, что они образуют группу разнообразных специфических бактериальных вирусов, которые широко распространены в природе. Всюду, где размножаются бактерии, актиномицеты, микоплазмы, удается обнаружить и паразитирующие в них фаги. Их обнаружили в воде, почве, пищевых продуктах, различных выделениях из организма человека и животных, т.е. там, где встречаются бактерии.

Фаги различаются по форме, структурной организации, типу нуклеиновой кислоты и характеру взаимодействия с микробной клеткой.

Морфология, химический состав,

биохимические свойства и структура бактериофагов.

Морфология.

Большинство фагов под электронным микроскопом имеют форму головастика или сперматозоида, некоторые—кубическую и нитевидную форму. Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов.

Наиболее хорошо изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида. Они состоят из вытянутой икосаэндрической головки размером 65-100 нм и хвостового отростка длиной более 100 нм. Внутри хвостового отростка имеется полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, снаружи –чехол, способный к сокращению наподобие мышцы. Хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят нитевидные структуры –фибриллы.

Различают несколько морфологических типов фагов:

к I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют «мужские» клетки, несущие F-плазмиды;
II группу составляют фаги с аналогом отростка, это мелкие РНК –содержащие фаги и фаги с одной спиралью ДНК;
в III тип включены фаги без отростка;
в IV тип –фаги с коротким отростком и двунитчатой ДНК (они отличаются строением отростков);
к V типу относятся ДНК –содержащие фаги с несокращающимся «чехлом» отростка и головкой разной формы и величины:
VI тип –это фаги с сокращающимся «чехлом» отростка и сложной структурой, содержат двунитчатую ДНК.

Химический состав.

Фаги состоят из двух основный химических компонентов - нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белка. У фагов, имеющих форму сперматозоида, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спиралей внутри головки. Белки входят в состав оболочки (капсида), окружающей нуклеиновую кислоту и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и представлены в виде множества идентичных субъединиц, уложенных по спиральному (в отростке) или кубическому (в головке) типу симметрии.

Кроме структурных белков, у некоторых фагов обнаружены внутренние (геномные) белки, связанные с нуклеиновой кислотой, и белки –ферменты (лизоцим АТФаза), участвующие во взаимодействии фага с клеткой.

Резистентность.

Фаги более устойчивы к действию химических и физических факторов, чем бактерии. Ряд дезинфицирующих веществ (фенол, этиловый спирт, эфир и хлороформ) не оказывают существенного влияния на фаги. Высоко чувствительны фаги к формалину и кислотам. Инактивация большинства фагов наступает при t0 65- 700C длительное время они сохраняются при высушивании в запаянных ампулах, замораживание при t0 - 1850C, в глицерине.

Свойства фагов:

Cпецифичность –это способность фага паразитировать только в определённом виде микроорганизмов (видовая специфичность). По названию микроба –хозяина именуют фаги (чумной, стафилококковый, холерный и др.) фаги с более строгой специфичностью, паразитирующие только на определённых представителях данного вида получили название типовых фагов, например: типовые, брюшнотифозные фаги, типовые стафилококковые фаги. Фаги, вызывающие лизис микроорганизмов близких видов, входящих в один род, называются поливалентными, например поливалентный дизентерийный фаг, поливалентный сальмонеллёзный фаг группы ABCDE поливалентный протейный фаг и другие.
Антигенность –это способность фагов при парантеральном введении их в организм вызывать выработку специфических к ним антител, которые нейтрализуют литическую активность фага. Фаги содержат типоспецифические и группоспецифические антигены. По типоспецифическим антигенам их делят на серотипы.

10.Взаимодействие фага с бактериальной клеткой.

Виды фагов, профаг, лизогения.

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой протекает по типу продуктивной инфекции и обычно заканчивается лизисом бактериальной культуры. Но возможна и абортивная инфекция, при которой фаговое потомство не образуется, и бактериальная клетка сохраняет свою жизнедеятельность. Наконец наблюдается лизогенизация бактериальных клеток инфицирующим фагом, в результате чего возникает состояние лизогении (вирогении).

По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактериальной клеткой состоит из последовательной смены отдельных стадий:

.Адсорбция - на клеточной стенке бактерий имеются рецепторы, на которых адсорбируются соответствующие фаги; число их неодинаково; на бактериальной клетке может адсорбироваться несколько сот фаговых частиц, хотя для лизиса достаточно адсорбции одного вириона.

. Проникновение - сокращается «чехол» отростка фага и его дистальный конец разрушает слои клеточной стенки бактерии. В бактерию проникает только нуклеиновая кислота фага, а капсид остается снаружи.

3. Биосинтез фаговой нуклеиновой кислоты и белков капсида - в клетке развиваются процессы, индуцированные фаговым геномом.

4. Морфогенез фага - фаговая НК заполняет пустотелые фаговые капсиды и происходит формирование зрелых вирионов.

5. Выход фаговых частиц из бактериальной клетки - происходит лизис бактериальной клетки и освобождение фагового потомства в окружающую среду; но некоторые фаги освобождаются из клетки путем «просачивания» их ДНК через ЦПМ, а затем клеточную стенку, во время которого они приобретают капсид, а бактериальная клетка при этом сохраняет свою жизнеспособность.

После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц.

Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30-40 минут. Процесс бактериофагии происходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.

Умеренные фаги лизируют не все клетки популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геном фага называют профаг (т.е. ДНК фага в хромосоме бактериальной клетки). Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной.

Это название (от греч lisis - разложение, genea - происхождение) отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда причин (физических или химических факторов) исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т.е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующей бактерии.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они не восприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородст-венным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменения свойств микроорганизма под влиянием фага получило название фаговой конверсии. Последнее имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и других. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, то она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микробов.

Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы, используемые в качестве продуцентов вакцин, антибиотиков, оказываются лизогенными, то существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неминуемо приведет к лизису производственного штамма.

11. Выявление и распространение фагов.

Бактериофаги обнаруживаются во внешней среде (вода, почва, пищевые продукты), в выделениях людей и животных, в популяциях пораженных фагом бактерий. Выделение бактериофага состоит из нескольких этапов. Вначале исследуемый материал освобождают от крупных частиц. Для этого применяют центрифугирование при 1-1,5 тыс. об/мин. в течение 15-20 минут или фильтрование через бумажный фильтр. Затем из фильтрата или надосадка удаляют бактерии, для чего пропускают их через бактериальные фильтры № 2 или 3. надосадок или фильтрат испытывают на присутствие фага накапыванием на газоны чувствительных культур или методом агаровых слоев.

В производственных условиях фаг получает путем добавления в котлы с бульонными культурами специального производственного фага, выдерживают при t0 370 C одни сутки, затем фильтруют. Фильтрат проверяют на чистоту, стерильность, безвредность и активность, т.е. силу действия.

Активность полученного фага определяют путем установления его титра. Титр фага, т.е. количество фаговых частиц в единице объема среды, находят методом агаровых слоев по Грациа.

12.Применение бактериофагов в диагностике,

профилактике и терапии инфекционных заболеваний.

Применение фагов основано на их строгой специфичности действия.

I Фаги используют в диагностике инфекционных болезней:

а) с помощью известных (диагностических) фагов проводят идентификацию выделенных культур микроорганизмов, т.е. фагодиагностику.

Для диагностики материал засевают «газоном», подсушивают в течение 30 мин., и наносят капли стандартных поливалентных или моновалентных диагностических фагов. Инкубируют посевы в термостате при 37C 16-18 час. В случае отсутствия роста на месте населения капли фага («стерильное» пятно) делают вывод о соответствии испытуемой культуры нанесенному фагу. Фагодиагностику используют в диагностике чумы, холеры, кишечных инфекций. Фагодиагностика относится к ускоренным методам диагностики и позволяет дать предварительный положительный ответ, но не исключает проведение основного метода исследования для диагностики данного инфекционного заболевания.

б) с помощью известных типовых бактериофагов можно определить принадлежность выделенной и идентифицированной до вида культуры к тому или иному фаговару внутри вида; этот способ диагностики получил название фаготипирование.

Для фаготипирования молодую (4-6 часовую) чистую культуру засевают «газоном» на чашку с питательной средой, подсушивают и на поверхность посева пастеровской пипеткой наносят капли типовых фагов. На второй день учитывают спектр чувствительности культуры к фагам и сопоставляют со схемой фаготипирования. Результаты фаготипирования используют для эпидемиологического анализа, так как фаготипирование позволяет установить источник инфекции и пути распространения инфекции (при стафилококковых инфекциях, брюшном тифе).

в) с помощью тест-культуры можно определить неизвестный фаг в исследуемом материале, что указывает на присутствие в нем соответствующих возбудителей.

II. Фаги применяют для профилактики и лечения инфекционных заболеваний:

а) фагопрофилактика - метод предупреждения развития некоторых бактериальных инфекций с помощью приема внутрь специфического бактериофага. Применяют для профилактики холеры, дизентерии, брюшного тифа и др.

б) фаготерапия - метод лечения бактериальных инфекций посредством приема внутрь специфического фага.

В России налажено производство брюшнотифозного, сальмонеллезных, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фага и комбинированных препаратов. Их используют в терапии инфекционных заболеваний, вызываемых вышеперечисленными микроорганизмами, а также в терапии раневых и анаэробных инфекций.

Фаги выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей и свечей. Способы введения в организм: местно, энтерально или парентерально.

III. Умеренные фаги используют в генетической инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК, используемых для получения биопрепаратов.

УЛЬТРАСТРУКТУРА ВИРУСОВ, ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ. ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ)