Генетическая структура бактерий и вирусов

Лекция №8

План

1. История развития генетики.
2. Генетическая структура бактерий и вирусов, внехромосомные факторы наследственности, их роль в детерминировании патогенетических признаков, лекарственной устойчивости.
3. Виды изменчивости (фенотипическая, генотипическая, S-, R-диссоциация).
4. Мутации и генетические рекомбинации.
5. Значение учения об изменчивости для практической медицины.

6.Достижения генной инженерии и их использование в микробиологии.

ГЕНЕТИКА –это наука, изучающая наследственность и изменчивость живых организмов. Еще Ч. Дарвин утверждал, что все живые организмы произошли путем изменчивости последующего естественного отбора. Микроорганизмы являются очень удобным объектом исследования генетики, т.к. имеют короткий жизненный цикл и быстрое размножение. Генетика микроорганизмов как наука берет свое начало со второй половины 19 века. В то время существовало 2 противоположных взгляда по поводу изменчивости бактерий. Плеоморфисты (К. Негели, Р. Бухнер) считали, что микробы безгранично изменчивы и могут принимать различную форму (плеоморфны), превращаясь из одного вида в другой и вызывать в одних случаях брожение, в других –гниение, в третьих –инфекционное заболевание. Сторонники другого течения, мономорфисты (Ф. Кон, Р. Кох), утверждали, что микробы обладают неизменной формой и специфической функцией, стабильными признаками и свойствами.

В 1928 г. Ф. Гриффитсом впервые воспроизведена трансформация –непосредственная передача генетического материала донора реципиенту. Он проводил опыты с авирулентнымбескапсульным штаммом пневмококка, которых приобрел вирулентные свойства при одновременном введении белым мышам с убитыми капсульными вариантами этих же бактерий. В дальнейшем было доказано, что вирулентные свойства передаются invitro при обработке авирулентныхбескапсульных пневмококков экстрактом убитых капсульных пневмококков. А в 1944 г. О. Эвери,К. Мак-Леод и К. Мак-Карти установили, что активным началом, содержащимся в экстракте убитых пневмококков, является ДНК, которая определяет его генетические свойства и являются носителем генетической информации.

В 1951 г. лауреатами Нобелевской премии Н. Циндером и Дж. Ледербергом была открыта трансдукция (transduction –перенос) –это передача наследственного материала от одних бактерий другим с помощью фагов.

В 1946 г. Дж. Ледербергом и Э. Тейтумом открыт процесс конъюгации –перенос генетического материала из клетки-донора в клетку-реципиента при их скрещивании.

В 1978 г. лауреаты нобелевской премии Г. Смит, Д. Натанс, В. Арбер открыли механизм рестрикции (restrictio –разрыв) –выделение (вырезание) генов и их синтез с помощью особых ферментов рестриктаз, рассекающих молекулы ДНК на отдельные фрагменты, к которым легко присоединяются другие фрагменты ДНК. Первые рестриктазы получил Г. Смит, а применил их как «молекулярные частицы» Д. Натанс. Это было огромным вкладом в развитие генной инженерии, раздел генетики, по созданию рекомбинативной ДНК из различных видов организмов и вирусов.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИЙ

Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства всех организмов, в т. ч. Бактерий и вирусов является ДНК. Исключение составляют РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК. Наряду с данной структурой (так называемой бактериальной хромосомой или нуклеоидом), генетический материал у бактерий содержится во внехромосомных генетических элементах –плазмидах, которые могут находиться в автономном состоянии в цитоплазме клетки. Генотип микроорганизмов представлен совокупностью генов, определяющих его потенциальную способность к фенотипическому выражению записанной в них информации в виде определенных признаков. Условия окружающей среды способствуют проявлению генов, или наоборот подавляют их функциональную активность, выраженную в образовании определенных ферментов. У бактерий, имеющих определенный набор генов, функцию каждого из них определяют не прямым, а косвенным путем на основании изменения или утраты соответствующего признака, при утрате какого-либо участка ДНК. Т.о. заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения признака присущего исходному генотипу и штамму с мутировавшим геном. В генетических исследованиях мутировавшие гены служат маркерами, которые дают возможность судить об их передаче и функционировании.

Внехромосомные факторы наследственности

плазмиды

транспозоны

Is-последовательности

-не связаны с хромосомой (автономное состояние) самостоятельная репликация (т.е. деление, раздвоение

Всегда связаны с хромосомой

-связаны с хромосомой, встроены в нее (интегрированное состояние) не способны к самостоятельной репликации (делению)

Не способны к самостоятельной репликации (делению)

Плазмиды, транспозоны и Is-последовательности являются молекулами ДНК, отличающиеся друг от друга молекулярной массой, объемом закодированной в них информации, способностью к автономной репликации и другим признакам.

ПЛАЗМИДЫ

Функции

регуляторная	Кодирующая
Компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плазмиды в состав поврежденного бактериального генома, не способного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного участка	Внесение в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку. Например, образованию пилей (F-плазмида), резистентности к антибиотикам (R-плазмида), выделение бактериоцинов (антибактериальное вещество) (Col-плазмида)

Переход плазмид в автономное состояние часто связано с индуцирующими воздействиями внешней среды, в некоторых случаях продукты плазмидных генов способствуют выживанию несущих их бактерий. Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид и профагов происходит только гомологичных участках бактериальных хромосомы; а транспозонов и Is-последовательностей - в любой ее участок.

В настоящее время описано >20 плазмид, из них мы рассмотрим следующие:

F-плазмида (или половой фактор) представляет собой циркулярно замкнутую нить ДНК. Она контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili),которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации (перенос генетического материала из клетки донора в клетку реципиента). Даннаяплазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов. Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F-плазмиды (от англ. Transfer –перенос), обеспечивающим ее конъюктивность.

R-плазмиды (resistance –устойчивость), факторы множественной резистентности, детерминируют у бактерий устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распространению среди патогенных и условно-патогенных бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний. R-плазмиды имеют сложное молекулярное строение. В их состав входит: R-ген, который содержит более мелкие мигрирующие элементы (Is-последовательности, транспозоны и tra-опероны).R-ген, ответственный за устойчивость бактерий к антибиотику, контролирует синтез фермента, вызывающего его интоксикацию. В одном R-гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным антибиотикам. Этим объясняется множественная лекарственная резистентность бактерий.

Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства бактерий и их токсинообразование.

Бактериоциногенныеплазмиды контролируют синтез особого ряда антибактериальных веществ –бактериоцинов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечных бактерий (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины) и др. Наиболее изучены колицины, продуцируемые кишечными палочками, шигеллами и некоторыми другими энтеробактериями. Колициныэнтеробактерий представляют собой вещества белковой природы, известно >25 типов колицинов, различающихся по своим физико-химическим и антигенным свойствам и по способности адсорбироваться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. При обычных условиях культивирования в большинстве клеток бактериальной популяции, содержащей колицинопатогенные особи, синтеза колицина не происходит. Примерно в 1 из 1000 клеток отмечается так называемая спонтанная продукция колицина. Однако, количество колицинпродуцирующих клеток может быть резко увеличено при обработке бактерий УФ-лучами и некоторыми другими агентами. При этом погибают только сами клетки, продуцирующие колицины. В тоже время бактериальные клетки, несущие Col-плазмиды, резистентны к действию гомологическогоколицина. Col-плазмиды находятся в клетках энтеробактерий в автономном состоянии, однако, некоторые из них (ColV, ColB)могут всраиватся в бактериальную хромосому и находится в ней в интегрированном состоянии.

Практическое применение: способность выделять бактериоцины используется для типирования бактерий и при выявлении источников инфекции в эпидемических очагах. Такое типирование осуществляется путем определения типа Col-плазмиды (колициногенотипирование) или типа колицина, образуемого патогенными бактериями (колицинотипирование), выделенными от больных.

Значение в природе. Широкое распространение бактерицитогении среди микрофлоры организма человека имеет экологическое значение как один из факторов, влияющих на формирование микробных биоценозов. Колицины, продуцируемые кишечной палочкой –нормальным обитателем кишечника могут губительно действовать на патогенные энтеробактерии, попавшие в кишечник, способствуя тем самым нормализации его естественного микробиоценоза.

Плазмиды биодеградации несут информацию от утилизации некоторых органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углевода и энергии. Они могут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечивая им селективные преимущества во время пребывания в организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмидугидролизации мочевины. Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации ряда сахаров (лактоза, сахара и др.) и образовании протеолитических ферментов.

ТРАНСПОЗОНЫ

Представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие 2000-20500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. Транспозоны реплицируются только в составе бактериальной хромосомы, при этом новые копии транспозонов могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции. Т.о. важнейшим свойством транспозонов являются их способность к перемещению с хромосомной ДНК на плазмиду и наоборот. Кроме того, некоторые транспозоны, как и плазмиды, выполняют регуляторную и кодирующую функции. Они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, ферментов, разрушающим антибиотики.

IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (insertion –вставка, sequence –последовательность) (вставки последовательностей оснований) –представляют собой транспозируемые элементы. Это фрагменты ДНК длиной >1000 пар нуклеотидов. Их функции:

1. Содержание информации, необходимой для транспозиции, т.е. перемещения в различные участки ДНК.
2. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и профагов между собой и с хромосомой бактериальной клетки.
3. Вызывать инактивацию, «выключение» определенного гена.
4. Индуцировать мутации.

ПРОФАГИ (умеренные и дефектные и умеренные фаги)

Могут быть факторами изменчивости бактерий, которые напоминают по своим свойствам плазмиды бактерий. Встраиваясь в хромосому, эти фаги вызывают лизогенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ

Фенотипическая (ненаследуемая) модификация

Генотипическая (наследуемая) Мутация Рекомбинации: -трансформация -трансдукция -конъюгация

Кроме того: Своеобразная форма изменчивости, относящаяся к мутациям:R-S диссоциации и свойство бактериальных клеток –репарация

Модификации - фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков, в отличие от мутаций, они хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации возникают как адаптивные реакции микроорганизмов в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды, что позволяет микробным популяциям быстро адаптироваться к окружающей среде и сохранять свою жизнеспособность.

Модификации проявляются в изменении морфологических, культуральных и др. признаков с последующей реверсией (т.е. возврату) к первоначальному фенотипу после устранения фактора, вызывающего их образование, поскольку исчезает потребность в сохранении данной модификации. Биохимическую основу модификации составляет индуцированный синтез ферментов. Например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент (пенициллиназу), разрушающий данный антибиотик. Под действием того же пенициллина могут образовываться L-формы бактерий, лишенные клеточной стенки, они могут сохранятся и даже размножаться внутри клеток хозяина, а затем вновь реверсировать к исходной морфологической форме после прекращения действия пенициллина. Т.о. при выращивании многих бактерий на питательной среде с суббактериостатическими концентрациями, характеризуется изменением различных признаков.

МУТАЦИИ - представляют собой изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака (признаков).

По происхождению

Спонтанные Представляют естественный, или спонтанный, фон, величина которого колеблется в зависимости от типа мутации и вида микробной популяции. Причины разнообразны, например, ошибки в работе репарирующих ферментов (скажем, ДНК-полимеразы во время репликации ДНК)

Индуцированные Полученные в результате экспериментов под влиянием мутагенов: )физические мутагены –УФ-облучения, радиация. Нарушают процесс репликации ДНК. )химические мутагены –комплексируются с ДНК, вызывая выпадение или вставки оснований. Супермутагены –обладают множественным эффектом, вызывающим высокую частоту мутаций –нитрозосоединения (нитрозогуанин, нитрозомочевина)

Мутагены не обладают специфическим действием, т.к. способны вызывать изменения в любом гене.

ПО КОЛИЧЕСТВУ МУТИРОВАВШИХ ГЕНОВ

Генные - затрагивают один ген

Хромосомные –крупная перестройка в отдельном фрагменте ДНК. Делеция –выпадение нуклеотидов. Инверсия –поворот участка ДНК на 180. Дупликация –удвоение какого-либо фрагмента ДНК.

ПО ФЕНОТИПИЧЕСКИМ ПОСЛЕДСТВИЯМ

Нейтральные фенотипически не проявляются каким-либо изменением признаков

Условно-летальные Приводят к изменению, но не утрате функциональной активности фермента. И в зависимости от условий окружающей среды могут сохранять свою жизнеспособность или наоборот, утрачивать ее.

Летальные Характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный фермент.

Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и биохимических признаков. Например, жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки; способности ферментировать какие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и их соединения, возникновение устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществам.

Мутанты, нуждающиеся в определенных аминокислотах, азотистых основаниях, ростовых факторах называются ауксотрофными. Они могут сохранять способность к росту лишь в том случае, если утрата соответствующего фермента (ферментов) компенсируется наличием в среде готового продукта.

R-S-диссоциации (dissociation –расщепление)

Диссоциацию большинство ученых рассматривают как закономерную форму модификации, а некоторые относят ее к мутациям. Присуща она прежде всего энтеробактериям, в однородной популяции которых обычно появляются различные по биологическим свойствам особи, образующие на питательных средах несколько типов колоний.

1. R-КОЛОНИИ (rough –шершавый) –шероховатые, неправильной формы, неровными краями, поверхность утолщена, радиально исчерчена, сухая.
2. SR-ФОРМЫ, переходные, нестойкие типы колоний.
3. СЛИЗИСТЫЕ М-КОЛОНИИ (mucoid –слизь) –круглые, вязкой консистенции, часто с концентрическими кольцами на поверхности.
4. КАРЛИКОВЫЕD-КОЛОНИИ (dwarf –карлик), возникают нередко в виде дочерних.
5. L-КОЛОНИИ (названы в честь Листера) –микроскопически мелкие с нежным кружевным краем и врастающим в среду центром, приобретающим при длительном хранении желто-коричневую пигментацию.
6. S-ФОРМЫ (smooth –гладкий) –круглые с ровными края, выпуклые, влажные, полупрозрачные.

Процесс диссоциации, т. е. расщепления бактериальных клеток обычно протекает от S к R-форме, иногда через промежуточные М-формы. Обратный переход RS наблюдается редко. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост колоний в S-форме. Исключения: МКБtbc, персинии чумы, сибиреязвенные бактерии и др. растут в R-форме.

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологических свойств колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные и др. свойства бактерий.

МЕХАНИЗМ ДИССОЦИАЦИИ. В результате мутации происходит встраивание внехромосомных факторов наследственности в т.ч. профагов в бактериальную хромосому утрата генов, контролирующих синтез поверхностных липополисахаридовR-мутанты. У дифтерийных бактерий S-R диссоциация связана с их лизогенизацией соответствующими бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин.

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ: приобретение бактериями селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. S-формы больше устойчивы к фагоцитозу.R-формы –к факторам окружающей среды. Но S-R диссоциация зачастую серьезно усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний. (дизентерии, эшерихиоза).

РЕПАРАЦИИ

Процесс восстановления клеточного генома в результате действия мутагенных факторов. Репарация поврежденной ДНК осуществляется ферментами, образование которых контролируется специальными генами. Функции многочисленных репаративных ферментов заключается в установлении места повреждения ДНК, его «вырезании», синтезе поврежденных фрагментов на матрице сохранившейся нити ДНК, встраивании в молекулу репарируемой нити ДНК.

ЗНАЧЕНИЕ: обуславливает стабильность ДНК бактерий.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМБИНАЦИИ

ТРАНСФОРМАЦИЯ –непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора реципиентной клетке. Фазы трансформации:

1. Адсорбция ДНК донора на клетке-реципиенте.
2. Проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента.
3. Соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.

Эффективность спаривания трансформирующей ДНК с соответствующим участком хромосомы реципиента зависит от степени гомологичности донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание межвидовая трансформация проходит гораздо реже, чем внутривидовая.

ТРАНСДУКЦИЯ – передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов. Различают 3 типа трансдукции: неспецифическую (общую) специфическую и абортивную.

1. Неспецифическая - в момент сборки фаговых частиц в процессе репродукции фага в их головку вместе с ДНК проникает фрагмент ДНК бактерии-донора, при этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. Такие дефектные фаги составляют примерно 0.3% всего потомства. Т.о. в гены клетки-реципиента могут быть перенесены любые гены донора, например, гены, контролирующие способность синтезировать аминокислоты, пурины, пиримидины, гены резистентности к антибиотикам и др.
2. Специфическая –способность фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту.
3. Абортивная трансдукция –принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может в таком виде функционировать.

КОНЪЮГАЦИЯ –перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при их скрещивании. Клетка-донор прикрепляется к клетке-реципиенту с помощью половых ворсинок (sexpili). Затем между обеими клетками образуется конъюгационный мостик, через который из клетки-донора в клетку-реципиента передаются F-фактор и др. Плазмиды, находящиеся в цитоплазме бактерии-донора в автономном состоянии При конъюгации передается только одна нить ДНК-донора, а вторая достраивается.

ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ

1. Модификации –изменение химического состава внешней оболочки (суперкапсида) вириона, связанное с включением в ее состав липидов и углеводов клеток-хозяина.
2. Мутации –как и у бактерий спонтанные и индуцированные и затрагивают различные свойства вирусов.
3. Генетическая рекомбинация –обмен генами между двумя и более вирусами. Встречается у вируса гриппа.
4. Генетическая реактивация, особый случай рекомбинации или перераспределения генов, когда у 2-ух родственных вирусов инактивированы разные гены. При скрещивании таких вирусов могут образоваться полноценные вирусные частицы (у рео- и поксвирусов).
5. Негенетические процессы:
6. Комплементация –когда белки, кодируемые геномом одного вируса, способствуют распространению другого вируса. При этом один из вирусов доставляет генный продукт, который дефектен у другого вируса.
7. Фенотипическое смешивание –если геном одного вируса заключен в капсид другого вируса.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Это раздел молекулярной генетики, ветвь биотехнологии по созданию рекомбинативных ДНК из различных видов организмов и вирусов, способных размножаться в реципиентной клетке или организме и детерминировать образование биологически активных веществ, обеспечивающих потребности народного хозяйства, биологии и медицины. Генную инженерию называют «индустрией ДНК». Уже в ближайшие годы она должна создать новые мощности в микробиологической промышленности по производству ферментов, витаминов, гормонов, антибиотиков, вакцин и др. веществ. Индустрия рекомбинативных ДНК открывает практическую возможность эффективного лечения наследственных болезней обмена веществ путем реконструкции дефектных генов. Разрабатываются программы получения новых разновидностей высокопродуктивных мясных и молочных пород животных, высокоурожайных сортов растений, устойчивых к вредителям. Особый интерес для профилактической медицины представляют вакцины будущего на основе безвредных рекомбинантных вирусов, в геномы которых введены гены широко распространенных инфекционных вирусов, кодирующих один или несколько специфических антигенов.

Генетическая структура бактерий и вирусов