Идентификация генов изоцитратлиазы в прорастающих семенах арабидопсиса

PAGE 27

Выпускная работа бакалавра

Биохимия

Реферат

ГЛИОКСИЛАТНЫЙ ЦИКЛ, ИЗОЦИТРАТЛИАЗА, ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ, ПЦР, ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ, РНК.

Целью работы являлась идентификация генов изоцитратлиазы в прорастающих семенах арабидопсиса. Было установлено, что активность изоцитратлиазы индуцируется в первый день прорастания и постепенно увеличивается до максимумального значения на 4 день. Получены препараты суммарной клеточной популяции РНК. Методом обратной транскрипции получена кДНК. Проведен ОТ-ПЦР анализ, который показал, что две обнаруженные формы фермента являются изоферментами и экспрессируются двумя генами – icl 1 и icl 2.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

кДНК – комплементарная ДНК

ПЦР – полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

DTT- дитиотрейтол

EDTA- этилендиаминтетрауксусная кислота

IRNasine- ингибитор рибонуклеазы плаценты человека

M-Mlv- ревертаза вируса Moloney лейкоза мышей

Taq- ДНК-полимераза Thermus aquaticus

ИЦЛ – изоцитартлиаза

МС – малатсинтаза

ГЦ – глиоксилатный цикл

ЖК – жирная кислота

ПААГ – полиакриламидный гель

Содержание

Введение_______________________________________________________5

Глава 1.Обзор литературы

1.1. Общая характеристика глюконеогенеза________________6

1.2. Глюконеогенез в растения_______________________________ 8

1.3. Роль глиоксилатного цикла в глюконеогенезЕ________10

1.4. Характеристика структуры гена и белка ИЦЛ__________ 14

Глава 2.Экспериментальная часть

2.1.Цели и задачи ____________________________________________ 17

2.2.Объекты и методы исследования

2.2.1.Объект исследования___________________________________ 17

2.2.2.Методы исследования

2.2.2.1.Определание активности изоцитратлиазы__________ 17

2.2.2.2.Определение количества белка ______________________ 18

2.2.2.3 Выделение суммарной клеточной популяции РНК__18

2.2.2.4.Обратная транскрипция_______________________________ 18

2.2.2.5. Проведение полимеразной цепной реакции_________19

2.3. Результаты и их обсуждения.

2.3.1.Динамика активности изоцитратлиазы_______________20

2.3.2.Идентификация генов icl 1 и icl 2.

2.3.2.1.Выделение суммарной клеточной популяции РНК__21

2.3.2.2.Обратная транскрипция_______________________________ 22

2.3.2.3.Полимеразная цепная реакция_______________________ 23

Заключение__________________________________________________ 24

Выводы_______________________________________________________ 25

Список использованной литературы______________________ 26

Введение

Длительное время подвергается изучению глиоксилатный цикл растений, обеспечивающий растения интермедиатами при конверсии запасных липидов, а также в зеленом растении участвует в превращении токсичных продуктов фотодыхания в безвредные вещества, используемые в конструктивном метаболизме. Ключевым ферментом глиоксилатного цикла является изоцитратлиаза.

Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно имеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться к пониманию механизмов функционирования организма.

Изучение структурно-функциональной организации и молекулярных механизмов регуляции ключевого фермента глиоксилатного цикла – изоцитратлиазы, является актуальной проблемой современной биохимии растений.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Общая характеристика глюконеогенеза

Биосинтез глюкозы и других углеводов из более простых предшественников является в количественном отношении наиболее важным процессом в биосфере. Точно также как превращение глюкозы в пировиноградную кислоту, катализируемое ферментами гликолиза, является центральным путем катаболизма углеводов в большинстве клеток как в аэробных, так и в анаэробных условиях, также обратный процесс — превращение пирувата в глюкозу — является наиболее важным общим путем биосинтеза моно- и полисахаридов. В этот центральный биосинтетический путь вливаются два главных «питающих пути»: один из них из ряда реакций, посредством которых интермедиаты ЦТК, лактат, большинство аминокислот, пропионат превращаются в пировиноградную кислоту [рис.1] [этот процесс, протекающий у всех организмов называется глюконеогенезом]; второй важный путь состоит в восстановлении СО2 до глюкозы [этот путь является отличительной особенностью автотрофов].

Глюконеогенез реализуется путем обращения некоторых стадий гликолиза, однако в гликолитическом пути имеются три необратимых стадии, которые не могут использоваться при превращении пирувата в глюкозу, поэтому используются альтернативные реакции [обходные пути], которые термодинамически благоприятствуют синтезу глюкозы.

Первый обходной путь у некоторых животных требует совместного действия цитозольных и митохондриальных ферментов. Реакция, осуществляемая под действием митохондриальной пируваткарбоксилазы, выглядит следующим образом [рис.1]:

ПВК + СО2 + АТФ + ацетил-КоА = ОАА + АДФ + Фн

Пируваткарбоксилаза — регуляторный фермент, который в отсутствии ацетил-КоА почти полностью лишен активности, так как данный метаболит выступает в роли положительного регулятора. Оксалоацетат, образующийся в этой реакции, восстанавливается, а затем в митохондриях трансформируется в малат. Малат, диффундируя в цитоплазму при участии специальной декарбоксилатной транспортной системы, находящейся во внутренней митохондриальной мембране, окисляется цитоплазматической НАД-зависимой МДГ с образованием внемитохондриального ОАА.

Рис.1. Схема глюконеогенеза: красным выделены ферменты, осуществляющие обходные пути при синтезе глюкозы.

Под действием фосфоенолпируваткарбоксикиназы [Мn2+ - зависимая реакция, в которой донором фосфата служит ГТФ или АТФ] щавелевоуксусная кислота распадается на ФЕП и углекислый газ:

ОАА + ГТФ (АТФ) = ФЕП + СО2 + ГДФ(АДФ)

Фосфофруктокиназная реакция гликолиза необратима, поэтому второй обходной механизм биосинтеза глюкозы достигается при помощи фермента фруктозодифосфотазы, осуществляющим необратимый гидролиз 1-фосфатной группы: Фр-1,6-бис-фосфат + Н2О = Фр-6-Ф + Фн. G0= -3,9ккал/моль.

Для проявления активности фруктозодифосфотазы необходимы ионы Мg2+ и положительный модулятор – АТФ. Данный фермент резко ингибируется отрицательным модулятором – АМФ [5].

На третьем обходном пути вместо гексокиназы, работающей в гликолизе, в глюконеогенезе участвуют глюкозо-6-фосфотаза [Мg2+-зависимый фермент][рис.1].

Таким образом, суммарное уравнение реакции, ведущей от ПВК к свободной глюкозе следующее:

2ПВК + 4АТФ + 2ГТФ + 2НАДН + 6Н2О = Глюкоза + 2НАД+ +4АДФ +2ГДФ + 6Фн

Субстратами глюконеогенеза выступают также промежуточные продукты ЦТК. Главными из них являются интермедиаты, способные окисляться в малат.

Аминокислоты, служащие предшественниками ФЕП называются гликогенными. Лейцин и некоторые другие аминокислоты являются кетогенными, т.е. способны трансформироваться в ацетоацетат. Фенилаланин, тирозин относятся к смешанным аминокислотам, способным выполнять и кето- и гликогенные функции.

У микроорганизмов и растений субстратами глюконеогенеза выступают жирные кислоты и ацетил-КоА, способный вовлекаться в реакции глиоксилатного цикла.

1.2.ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ В РАСТЕНИЯХ.

Растение как целостный организм представляет собой сложную саморегулирующуюся систему с взаимозависимыми путями превращения метаболитов. Функционирование и регуляция такой системы обусловлены организацией и биогенезом ферментных комплексов, катализирующих протекание реакций того или иного метаболического пути. Наряду с метаболическими путями, имеющимим первостепенную важность в течение всей жизни растений, существуют процессы, протекающие только в определенные периоды онтогенеза. Превращение жиров в углеводы происходит при прорастании семян масличных растений, спор папоротникообразных, при росте пыльцевых трубок и др. [16; 17]. Два первых этапа данного процесса локализованы в глиоксисомах, цикл трикарбоновых кислот – в митохондриях, а последующие два этапа – в растворимой части цитоплазмы.

При прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые хорошо растворяются в воде, что обеспечивает возможность дальнего транспорта запасных веществ к местам утилизиции, где они участвуют в процессах биосинтеза клеточных компонентов. Глиоксилатному циклу принадлежит ключевая роль при глюконеогенезе, поскольку именно наличие ферментов глиоксилатного цикла – изоцитратлиазы и малатсинтазы – обеспечивает протекание этого процесса.

Янтарная кислота, образующаяся в глиоксилатном цикле, используется в дальнейших реакциях глюконеогенеза, а также для регенерации и последующее его окисление до малата и оксалоацетата показаны, в частноости, на примере эндосперма клещевины [23]. Последующие две стадии глюконеогенеза, протекающие в цитозоле, изучены пока слабо.

Превращение фосфоенолпирувата в глюкозо-1-фосфат, являющийся ключевым промежуточным соединением в биосинтезе сахаров и полисахаридов, просходит путем обращения части гликолитической последовательности. В связи с тем, что запасные жиры семядолей и других жирозапасающих тканей находятся в особых тельцах – олеосомах, должна иметься тесная связь между олеосомами и глиоксисомами. Эти органоиды не являются производными эндоплазматической сети. Шопфер и др. показали, что имеется тесная связь между мембранами олеосомы и глиоксисомы[22]. В ряде случаев глиоксисома частично «покрывает» олеосому и только тонкий цитоплазматический слой остается между ними. Подобная близость олеосомы и глиоксисомы, по-видимому, обеспечивает стерическиблагоприятное состояние для транспорта жирных кислот. Вигил обнаружил, что в клетках эндосперма клещевины глиоксисомы могут располагаться в большом количестве на поверхности более крупных по размеру липидных тел – олеосом[29].

Кислая липаза гидролизует три-, ди- и моноглицериды, в то время как щелочная липаза расщепляет только моноглицериды. По-видимому, работа этих двух ферментов взаимосвязана. Однако данные о локализации липаз, полученные для клещевины, не подтвердились для других растений. Так, в рапсе [Brassica napus] липаза не обнаружена в верхней фракции градиента, представляющей собой олеосомы [19], но она присутствовала в мембранной фракции, которая, возможно, содержала мембраны олеосом. Данные, полученные при изучении арахиса [Arachis hypogaea] [12], указывают на то, что щелочная липаза связана с мембраной глиоксисом, а также имеется в митохондриях и пузырьках эндоплазматической сети. Липазная активность не обнаруживалась во фракции олеосом.

1.3. РОЛЬ ГЛИОКСИЛАТНОГО ЦИКЛА В ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗЕ

Глиоксилатный цикл был впервые открыт Корнбергом и Кребсом в 1957 году в клетках бактерий рода Pseudomonas, выращивыемых на ацетате [20]. Для этих микроорганизмов было показано, что его функцией является конденсация С2-молекул для синтеза составляющих клетку компонентов. Для растительных тканей функционирование глиоксилатного цикла было впервые показано в эндосперме клещевины [20]. В жирозапасающих тканях растений основной функцией глиоксилатного цикла также считается участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров. Глиоксилатный цикл шунтирует две декарбоксилирующие реакции цикла трикарбоновых кислот и позволяет использовать C2-соединения в качестве субстрата для глюконеогенеза[3]. Суммарное уравнение глиоксилатного цикла:

2Ацетил-СоА + Н2О + НАД+ сукцинат +2СоАSH + НАДН + Н+

Глиоксилатный цикл состоит из пяти реакций [рис.2]. На первом этапе ацетил-КоА [C2] конденсируется с глиоксилатом с образованием малата [C4] при помощи ключевого фермента глиоксилатного цикла – малатсинтазы [КФ 4.1.3.2]. НАД-зависимая малатдегидрогеназа окисляет малат до оксалоацетата, восстанавливая НАД+. Цитратсинтаза катализирует образование цитрата из оксалоацетата и ещё одной молекулы ацетил-КоА. Аконитатгидратаза превращает цитрат в изоцитрат через цис-аконитат. Другой маркерный фермент ГЦ изоцитратлиаза [КФ 4.1.3.1] катализирует расщепление изоцитрата на сукцинат и глиоксилат. Другими словами последним этапом глиоксилатного цикла является образование сукцината и регенерация глиоксилата в изоцитратлиазной реакции. Некоторые биохимические этапы ГЦ идентичны реакциям ЦТК, однако существуют их регуляторные особенности, связанные с работой изоферментов и компартментализацией.

Рис.2.Схема реакций глиоксилатного цикла.

Глюконеогенез, как правило, реализуется при кооперации ферментов, обычно вовлеченных в функционирование различных метаболических путей: липаз, ферментов -окисления жирных кислот, ферментов глиоксилатного цикла, ЦТК. Липазы обнаружены в олеосомах и глиоксисомах, -окисление и глиоксилатный цикл протекают в глиоксисомах, окисление сукцината в оксалоацетат [или малат] в митохондриях, конверсия оксалоацетата [малата] в сахарозу – в цитозоле. Реакции ЦТК вносят значительный вклад в глюконеогенез: образовавшийся в ГЦ сукцинат окисляется до малата, затем оксалоацетата, который превращается в фосфоенолпируват с помощью фермента фосфоенолпируваткарбоксикиназы [КФ 4.1.3.32]. Данный фермент, а также фруктозо-1,6-бисфосфатаза [КФ 3.13.11] катализируют два ключевых этапа глюконеогенеза [в отличие от остальных реакций, являющихся простым обращением гликолиза].

Возможность конденсации С2-соединений через глиоксилатный цикл, делает его центральной стадией в пути превращения жирных кислот в углеводы. Основной формой катаболизма жирных кислот [ЖК] является их -окисление в митохондриях и пероксисомах, приводящее к образованию ацетил-КоА. Как описано выше, две молекулы ацетил-КоА через глиоксилатный цикл могут конденсироваться до сукцината, далее превращающегося в глюкозу.

Процесс превращения ЖК в углеводы имеет место при прорастании семян масличных растений, основным веществом запаспа которых являются липиды. Конверсия запасных липидов в форму углеводов делает возможным построение клеточных компонентов в период, когда интенсивность фотосинтеза низка и необходимы эндогенные источники углеводов [2].

Таким образом, результатом одного оборота глиоксилатного цикла является синтез одной молекулы глюкогенного сукцината из двух молекул ацетил-КоА:

2ацетил-КоА сукцинат

Основными биологическими функциями ГЦ является обеспечение роста микроорганизмов на среде с С2-соединениями, синтез клеточных компонентов и конверсия ЖК в углеводы. Кроме того, совсем недавно было открыто, что работа ГЦ является необходимым условием для вируллентности патогенов животных, человека и растений.

У высших растений роль глиоксилатного цикла сводится, как правило к утилизации запасных жиров при прорастании семян и спор. При прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые хорошо растворяются в воде, что обеспечивает возможность дальнего транспорта запасных веществ к местам утилизации, где они участвуют в процессах биосинтеза клеточных компонентов. Глиоксилатному циклу принадлежит ключевая роль при глюконеогенезе, поскольку именно наличие ферментов глиоксилатного цикла – изоцитратлиазы и малатсинтазы – обеспечивает протекание этого процесса.

Пристствие гликсилатного цикла было доказано для прорастающих спор папоротников Dryopteris filixmas, Polypodium vulgare и хвоща Equisetum arvense[14]. У голосеменных также установлено наличие глиоксилатного цикла в прорастающих семенах пихты, некоторых видов сосны[13], а также в гинго. При чем активность глиоксилатного цикла коррелирует со степенью маслянистости семян. ИЦЛ встречается также в созревающих плодах банана[31], в зрелых плодах авокадо[7], в зеленых листьев ряда растений. В настоящее время список покрытосеменных, в которых обнаружен глиоксилатный цикл, достаточно велик.

Долгое время считалось, что ферменты глиоксилатного цикла появляются только при прорастании масличных семян. Но затем было показано, что незначительная активность этих ферментов может наблюдаться и в сухих семенах, при чем показано, что глиоксисомальные ферменты синтезируются уже на стадии созревания семян, присутствуя в микротельцах.

Что касается высших растений, то вопрос о возможности индуцированного синтеза ИЦЛ почти не изучен.

1.4.Характеристика структуры гена и белка ИЦЛ.

Охарактеризован ген ИЦЛ метилотрофных жрожжей Pichia pastoris. Продукт ген ИЦЛ найден скринингом геномной библиотеки P. pastoris. Используя пару вырожденных праймеров, данный ген был клонирован методом ПЦР. Размноженный ген ИЦЛ содержал открытую рамку считывания размером 1563 н. п. Секвенированный белок состоял из 551 аминокислоты[22].

Молекулярная масса субъединицы составила 60,6 кДа с высокой степенью гомологии ИЦЛ из других источников. Аминокислотная гомология составила 64% с ИЦЛ Saccharomyces cerevisiae. Ген ИЦЛ, размером 1458 н.п. был изолирован из метилотрофных дрожжей Hansenula polimorpha. Данная последовательность нуклеотидов кодирует 468 аминокислот белка с молекулярной массой субъединицы 54. 9 кДа.

Ген кодирующий изоцитратлиазу у психрофитной бактерии Colwellia maris был клонирован и секвенирован. Длина гена icl составила 1584 пар оснований, а длина первичной аминокислотной последовательности белка – 528 аминокислотных остатков. Молекулярная масса белка составила 58 кДа[28].

Другими исследователями была расшифрована кДНК из Strongyloides stercoralis. Сиквенс нуклеотидной последовательности кДНК показал, что она кодирует ИЦЛ. Концептуально полученная аминокислотная последовательность с открытой рамкой считывания кодирует белок размером 450 аминокислтных остатков с молекулярной массой субъединицы 50кДа.

Показано, что в мышечных клетках, а также клетках кишечика C. elegans в избытке содержится белок с молекулярной массой 106 кДа[21], который обладает ИЦЛ и МС каталитическими активностями. Данный белок назван бифункциональным белком глиоксилатного цикла. Его кДНК состоит из 3274н. п. N-концевой домен белка состоит из 443 аминокислотных остататков и имеет значительную степень гомологии с ИЦЛ грибов, бактерий и растений. Изоцитратлиаза из кукурузы Zea mays L. – тетрамерный белок, состоящий из идентичных субъединиц с молекулярной массой 64 kDa каждая[30].

Также показано, что изоцитратлиаза M. tuberculosis имеет гомотетрамерное строение. Каждая субъединица состоит из 14 -спиралей и 14 -структур. Все субъединицы устойчиво связаны взаимодействием спиралей. Восемь -спиралей и восемь -структур, составляющий самый большой домен и основу структуры, формирует /-баррель. Активный центр ИЦЛ типично для подобных структур формируется C-концевыми остатками -структур. Плоская молекула глиоксилата в активном центре координационно связывается с ионом Mg2+, а также образует водородные связи с аминокислотными остатками Ser 91, Gly 92, Trp 93, Arg 228. Молекула сукцината с другой частью активного центра фермента и формирует водородные связи с Asn 92, Glu 295, Arg 228, Gly 192, (первая карбоксильная группа) и Thr 347, Asn 313, Ser 315, Ser 317, His 193, (вторая карбоксильная группа).

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Целью работы являлась идентификация генов изоцитратлиазы в прорастающих семенах арабидопсиса.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Изучить динамику активности изоцитратлиазы в семенах арабидопсиса.
Выделить суммарную клеточную РНК из прорастающих семян арабидопсиса.
Методом обратной транскрипции получить кДНК из РНК объекта исследования.
Провести ПЦР анализ кДНК из семян арабидопсиса для идентификации генов ИЦЛ.

2.2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основных объектов исследования в работе использовали 4-дневные семена Arabidopsis thaliana L., выращенные гидропонным способом при 25° и интенсивности света 25 Ватт/м2.

2.2.2.МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.2.1 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ изоцитратлиазы

Измерение активности изоцитратлиазы проводилось спектрофотометрическим методом при длине волны 324 нм на СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 1 см в течение 5 минут при 25оС. Коэффициент экстинкции ( при 324) составил 1,7 мМ-1 см-1. Спектрофотометрирование проводили в среде колориметрирования с добавлением 20 мкл гомогената.

Активность изоцитратлиазы измеряли спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при 324 нм. Среда колориметрирования содержала 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5); 1 мМ изоцитрат калия; 5 мМ MgCl2; 4 мМ фенилгидразин солянокислый. Данный метод основан на образовании комплекса фенилгидразина с глиоксилатом, поглощающим при 324 нм (рис.3).

За единицу ферментативной активности принимали количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за одну минуту при 25оС и оптимальном значении рН.

2.2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БЕЛКА

Общее количество белка определяли по методу Лоури [27]. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия) при 750 нм.

2.2.2.3. ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ РНК

Суммарную клеточную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [8] со следующими модификациями. Для ингибирования РНКаз на стадии получения клеточного лизата использовали 42,6% гуанидин тиоцианат. Очистку РНК проводили при помощи осаждения хлоридом лития. Качественный анализ препаратов РНК проводили путём неденатурирующего электрофореза в 1% (в/о) геле агарозы при напряжённости электрического поля 7 В/см. Окрашивание геля производилось 0,1% водным раствором бромистого этидия. Визуализация результатов проводилась с использованием трансиллюминатора с длиной волны 312 нм. Результаты фиксировались цифровой видеокамерой Samsung и обрабатывались с помощью пакета программ Gel Explorer 1.0.

2.2.2.4. ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы RevertAid M-MuLV (Fermentas, Литва) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для проведения обратной транскрипции использовали 1 мкг суммарной клеточной РНК. В качестве затравочного использовался олиго-(dT)20 праймер. Для предотвращения деградации матриц РНК в реакционную смесь вносилось 20 ед. ингибитора РНКаз IRNasine.

2.2.2.5. ПРОВЕДЕНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Для идентификации генов изоцитратлиазы использовали специфические праймеры, разработанные с применением программного обеспечения FastPCR (Финляндия). Последовательности праймеров для гена icl 1: прямой 5'-atcgcacacccacttacctc-3' и обратный 5'-ttcccctagagcgtttctga-3' (Tm=57°С). Последовательности генспецифических праймеров для icl 2: прямой 5'-atcgaggacgagtgg-3' и обратный 5'-gtcccagtcccagac-3' (Tm=58°С). Полимеразную цепную реакцию [23] проводили в термоциклёрах Biometra (Biometra, Германия) и «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). Исследование результатов полимеразной цепной реакции проводили при помощи электрофореза в 1% агарозном геле в присутствии 0,1% этидиум бромида. Размер продуктов определяли путём сравнения с маркерами ДНК известной длины (СибЭнзим, Россия).

2.3.Результаты и их обсуждение

2.3.1.ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ицл В СЕМЕНАХ АРАБИДОПСИСА

Измерение активности изоцитратлиазы в семенах арабидопсиса в течение 10 дней показало, что она индуцируется с первых дней прорастания и достигает максимального значения уже на четвертые сутки. Возрастание активности ИЦЛ свидетельствует об интенсификации глиоксилатного цикла.

Рис. 3. Динамика активности изоцитратлиазы из семян арабидопсиса.

Активное функционирование глиоксилатного цикла приводит к уменьшению содержания жирных кислот в семенах и увеличению количества сахаров и их производных. Первоначально идет активное запасание сахаров, которое сменяется их потреблением в период интенсивного прорастания. По мере снижения концентрации жирных кислот, происходит уменьшение активности ИЦЛ.

2.3.2.Идентификация генов icl 1 и icl 2.

2.3.2.1.ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ РНК

В результате применения оптимизированной методики выделения с использованием фенол-хлороформной экстракции была проведена экстракция суммарной клеточной РНК из семян арабидопсиса. В ходе выделения в качестве хаотропного агента был использован гуанидин-изотиоцианат. Применение данного соединения позволило получить высокоочищенные препараты недеградированной РНК из растительных клеток, что было установлено путём проведения аналитического электрофореза в 1% агарозном геле (рис. 4). На приведённой электрофореграмме результатов типичного выделения видно, что количество 28S рРНК преобладает над 18S рРНК, что свидетельствует об отсутствии деградации препарата под действием РНКаз. Кроме того, в полученных препаратах отсутствовали примеси геномной ДНК, что является важным условием успешного проведения дальнейших манипуляций с выделенной РНК и позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты при измерении концентрации растворов РНК и проведении полимеразной цепной реакции.

Рис. 4. Электрофорез суммарной клеточной РНК из семян арабидопсиса, в 1% агарозном геле в присутствии бромистого этидия.

2.3.2.2. ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

Для синтеза первой цепи комплементарной ДНК использовалась рекомбинантная обратная транскриптаза вируса Moloney лейкоза мышей M-MuLv. Данный фермент состоит только из одной субъединицы и проявляет 5’3’ праймер-зависимую полимеразную активность, эффективную только в отношении матриц РНК [15]. В качестве затравочного праймера использовался олиго-(dT)20 праймер.

Использование данного праймера позволяет избирательно перевести в форму ДНК только молекулы информационной РНК, представляющих собой транскрипты работающих генов. Применение в реакционной смеси ингибитора РНКаз IRNasine [6] позволило избежать деградации матриц РНК во время протекания реакции и получить набор комплиментарных ДНК (рис. 5). Полученные в ходе обратной транскрипции продукты использовались далее для проведения полимеразной цепной реакции.

Рис. 5. Продукты обратной транскрипции суммарной клеточной РНК семян арабидопсиса с использованием ревертазы M-Mulv и олиго-(dT)20 праймера.

2.3.2.3.ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Обратная транскрипция выделенной РНК и последующий ПЦР-анализ кДНК с праймерами для icl1 и icl2 генов изоцитратлиазы показали наличие двух полос на гель-электрофорезе (рис. 6), что свидетельствует об экспрессии этих генов. Анализ банка данных GeneBank показал, что в геноме арабидопсиса изоцитратлиаза кодируется двумя генами, расположенными в разных хромосомах.

Рис. 6. Результаты ПЦР на матрице кДНК с использованием праймеров для генов icl1 и icl2.

Полученные результаты показывают, что в геноме арабидопсиса, на стадии прорастания семян экспрессируются одновременно два гена изоцитратлиазы.

Экспрессия двух генов в семенах арабидопсиса связана с тем, что в период прорастания клетки зародыша нуждаются в большом количестве энергии и материала для биосинтетических процессов. На начальных этапах прорастания семена осуществляют гетеротрофный тип питания, используя в качестве субстратов запасные вещества. В том числе, осуществляется процесс превращения запасных жиров в углеводы через глиоксилатный цикл, являющийся звеном глюконеогенеза.

Заключение

При прорастании семян арабидопсиса происходит интенсификация процессов утилизации запасных веществ, в том числе липидов, что, вероятно, связано с индукцией глиоксилатного цикла. Так появление активности изоцитратлиазы в первый день прорастания и постепенное ее увеличение до максимума на 4 день свидетельствует об активной утилизации липидов.

Изучение, включавшее выделение суммарной клеточной популяции РНК и проведение обратной транскрипции, получение комплементарной ДНК и ОТ-ПЦР анализ, показало, что в ходе прорастания семян арабидопсиса экспрессируются оба гена изоцитратлиазы - icl1 и icl2.

Таким образом глиоксилатный цикл может иметь более универсальное распространение в организмах чем считалось ранее. При этом данный метаболический путь не функционирует на протяжении всего онтогенеза, а индуцируется на определенных стадиях и выполняет ключевую роль в мобилизации запасного пула жирных кислот.

Выводы

1.Изучена динамика активности ИЦЛ при прорастании семян арабидопсиса и показано, что исследуемый фермент имеет максимальное значение активности на 4 день прорастания. Вероятно, в данный период осуществляется активная утилизация запасных липидов через глюконеогенез.

2. Применение олиго-dT праймера в качестве затравки при проведении реакции обратной транскрипции, дало возможность получить набор кДНК к матричной РНК из семян арабидопсиса, пригодных для дальнейших анализов.

3. Методом ОТ-ПЦР, с использованием специфических праймеров к генам изоцитратлиазы, установлено, что в семенах активно транскрибируются два гена – icl1 и icl2. Вероятно, в процессе развития организма происходит экспрессия генов ИЦЛ, обеспечивающей протекание глиоксилатного цикла в растительной клетке, при конверсии липидов в углеводы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. // М., 2012. - 446с.
Епринцев А.Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации?/ А.Т Епринцев., В.Н Попов., М.Ю. Шевченко //М.: ИКЦ «Академкнига», 2007.- 228 с.: ил.
Попов В.Н. Сравнительный анализ ключевого фермента глиоксилатного цикла, изоцитратлиазы, из организмов разных систематических групп / В.Н.Попов, Е.А. Москалёв, М.Ю.Шевченко, А.Т. Епринцев // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. – 2009. – №6.– С.317-329.
Страйер Л. Биохимия – М.: Мир, 1984. – Т.1.–232 с.
Филлипович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Высш. шк. 1993.– 496 с.
Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B.L. Jailkhani // J Biol Chem. - 2009. - vol. 254. - pp. 12488-93.
Carpenter W.D. Distributhion and properties of isocitritase in plants/ W.D. Carpenter H. Beevers//Plant Physiol.-2009.-Vol.34,№4.-P.403-409.
Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction extraction /P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 2007. - vol. 162. - pp. 156-159.
Cioni M. Comparative biochemistry of glyoxylate cycle / M.Cioni, G.Pinzauti, P. Vanni // Comp.Biochem. and Physiol.–1981.- V.70, B, N 1.-P.1-26.
Cioni M., Comparative biochemistry of isolation by acid guanidinium glyoxylate cycle / M. Cioni, P.Vanni // Comp.Biochem. and Biophis. – 2012, Vol. 70, P. 2621-2629.
Davis W.L.Cytochemical localization of malate synthase in amphibian fat body adipocytes:possible glyoxylate cycle in a vertebrate / W.L.Davis, R..G.Jones, D.B. Goodman // J.Histochem.Cytochem.-2006.-Vol.34,№5.-P.689-692.
Davis W.L. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver / W.L.Davis, D.B. Goodman // Source Anatomical Record.-1992.-V.234,№4.-P.461-468.
Firenzuoli A.M. Enzymes of glyoxylate cycle in conifers / A.M.Firenzuoli, P.Vanni, E.Mastronuzzi, A. Zanobini, V.Baccari // Plant Physiol.- 1968.-Vol.43, №7.-Р.1125-1128.
Gemmrich A.R.Isocitrat lyase in germinating spores of the fern Anemia Phillitia / A.R Gemmrich // Phytochemistry .-2009.-Vol.18,№6.-P.1143-1146.
High-efficiency cloning of full-length cDNA; construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama [et al.] // Methods Enzymol. - 1987. - vol. 154. - pp. 3-28.
Holmes R.P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrione chick liver // Biochim. Biophys. Acta. – 1993. – Vol.233.– P.123-138.
Jameel S.H., Caenorhabditis elegans: purification of isocitrate lyase and the isolation and cell-free translation of poly (A+) RNA./ S.H. Jameel, B.McFadden //Exp. Parasitol. –1985.– Vol.59.– P.337-346.
Jones J.D. The glyoxylate cycle: does it function in the dormant or active bear?/ J.D. Jones, P.Burnett, P. Zollman // Comp. Biochem. Phisiol. B.– 1999.– Vol. 124.– P.177-179.
Kamel M.Y.Biochemical studies of tick embryogenesis. Purification and partial characterization of isocitrate lyase from eggs of the tick.Hyalomma dromedarii / M.Y.Kamel, A.S.Fahmy // Comp.Biochem.Physiol.B/-1982.-Vol.72.-P.107-115.
Kornberg H.L.Synthesis of cell Constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H.L.Kornberg, H.A.Krebs // Nature.-2007.-Vol.179.-P.988-991.
Liu F. Bifunctional glyoxylate cycle protein of Gaenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle. / F. Liu, J.D.Thatcher, J.M. Barral // Dev.Biol.-2012/-Vol.169.-P.399-414.

НОСН2 РОСН2

О глюкозо-6-фосфат- О

НО Н Н фосфотаза НО Н Н фосфоглюкоизомераза

ОН Н ОН Н

Н ОН Н ОН

Глюкоза Глюкозо-6-фосфат

РОСН2 О СН2ОН фруктозо-1,6- РОСН2 О СН2ОР CНO

дифосфотаза |

Н ОН Н ОН CHOH

Н Н Н Н |

ОН Н ОН Н CH2OP

Фруктозо-6-фосфат фруктозо-1,6-бис-фосфат Глицеральдегид-3-фосфат

COOH COOH фосфоглицерат- COOH фосфоглицерат- COOP

| енолаза | мутаза | киназа |

C–OP CHOP CHOH CHOH

|| | | |

CH2 H2O CH2OH CH2OP АТФ АДФ CH2OP

Фосфоенолпируват 2-фосфоглицерат 3-фосфоглицерат 1,3-дифосфоглицерат

CO2 фосфоенол-

пируват- СООН

ГДФ карбокси- | СООН COOH

киназа C=O | |

ГТФ | пируваткарбоксилаза C=O лактатдегидрогеназа CHOH

CH2 | |

| CH3 НАДН НАД+ CH3

COOH ФН+ AДФ AТФ СО2 Пируват Лактат

Оксалоацетат

COOH

CHNH2

CH3

Аланин

Глиоксилатный цикл

СН3–СО~S–CоА СоА–SH CH2–COOH

ацетил–СоА |

CНOH–COOH

СН2– СООН CH2–COOH

| H2O лимонная кислота

CO–COOH H2O

щавелевоуксусная

кислота

СН2–СООН

НАДН |

С–СООН

НАД+ ||

СН–СООН

СН2–СООН цис-аконитатовая кислота

CHOH–COOH H2O

яблочная

кислота CH2–COOH

малатсинтаза |

Н2О изоцитратлиаза CH–COOH

CHOH–COOH

CoA–SH COOH изолимонная кислота

| (изоцитрат)

CHO CH2–COOH

СН3–СО~S–CoA глиоксилат |

ацетил–СоА CH2–COOH

янтарная кислота (сукцинат)

0,05

0,15

0,2

0,25

0,3

День прорастания семян

Активность, Е/мг белка

ICL 1

ICL 2

Идентификация генов изоцитратлиазы в прорастающих семенах арабидопсиса