<< Пред. стр. 1 (из 7) След. >>
Список литературы по разделу
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие.
ЧАСТЬ I. Введение. Предмет клеточной биологии
ГЛАВА 1. Клеточная теория
Клетка - элементарная единица живого
Клетка - единая система сопряженных функциональных единиц
Гомологичность клеток
Клетка от клетки
Клетка и многоклеточный организм
Тотипотентность клеток
ГЛАВА 2. Методы цитологии
Световая микроскопия
Витальное (прижизненное) изучение клеток
Изучение фиксированных клеток
Электронная микроскопия
- конрастирование корпускулярных объектов
- ультрамикроскопия
- другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов
Фракционирование клеток
ЧАСТЬ II. Строение и химия клеточного ядра
ГЛАВА 3. Центральная догма молекулярной биологии
ГЛАВА 4. Морфология ядерных структур
Роль ядерных структур в жизнедеятельности клетки
Ядерные компоненты прокариот
Ядро эукариотических клеток
Эухроматин и гетерохроматин
Хромосомный цикл
Общая морфология митотических хромосом
Клеточный цикл эукариот
Эндорепродукция и полиплоидия
Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре
ГЛАВА 5. Структура и химия хроматина
ДНК хроматина
Репликация эукариотических ДНК
Основные белки хроматина - гистоны
Функциональные свойства гистонов
Первый уровень компактизации ДНК. Структурная роль нуклеосом
Нуклеосомы при репликации и транскрипции
Второй уровень компактизации ДНК - 30 нм фибрилла
Негистоновые белки
Петлевые домены ДНК - третий уровень структурной организации хроматина
ГЛАВА 6. Ядерный белковый матрикс
Общий состав ядерного матрикса
ДНК ядерного белкового матрикса
ГЛАВА 7. Четвертый - хромонемный уровень упаковки хроматина
Общая организация митотических хромосом
ЧАСТЬ III. Ядерные транскрипты и их транспорт
ГЛАВА 8. Ядрышко - источник рибосом
Строение рибосом
Чем определяется число ядрышек в клетке
Множественность рибосомных генов
Амплифицированные ядрышки
Строение и функционирование генов рРНК
Структура ядрышка
Фибриллярный центр и ядрышковый организатор
Структурные типы ядрышек
Белки ядрышка
Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом
Новые, неканонические функции ядрышек
Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал
ГЛАВА 9. Нерибосомные продукты ядра
Транскрипция нерибосомных генов
Морфология РНП-компонентов ядра
Синтез РНК в пуфах политенных хромосом
Транскрипция на мейотических хромосомах
Морфология транскрипции индивидуальных генов
Синтез транспортных РНК
ГЛАВА 10. Ядерная оболочка
Компоненты ядерной оболочки
Роль ядерной оболочки в ядерно-цитоплазматическом обмене
Импорт кариофильных белков
Экспорт из ядра в цитоплазму
Динамика ядерной оболочки в митозе
ЧАСТЬ IV. Цитоплазма
ГЛАВА 11. Гиалоплазма и органеллы
ГЛАВА 12. Общие свойства биологических мембран
Структурной основой мембран является двойной слой липидов
Мембранные белки встроены в билипидный слой
Липиды и белки мембран обладают латеральной подвижностью
Клеточные мембраны асимметричны
Разные мембраны имеют различные свойства
Мембраны ассоциированы с цитоплазматическими белками
Рост мембран цитоплазмы происходит за счет встраивания готовых мембранных пузырьков
ГЛАВА 13. Плазматическая мембрана
Барьерно-транспортная роль плазмолеммы
Трансмембранный перенос ионов и низкомолекулярных соединений
Везикулярный перенос: эндоцитоз и экзоцитоз
Рецепторная роль плазмолеммы
Межклеточное узнавание
Специальные межклеточные соединения (контакты)
Клеточная стенка (оболочка) растений
Клеточные оболочки бактерий
ГЛАВА 14. Вакуолярная система внутриклеточного транспорта
Общая схема функционирования вакуолярной системы
Гранулярный эндоплазматический ретикулум
Котрансляционный транспорт растворимых белков
Транспорт нерастворимых (мембранных) белков
Синтез клеточных мембран
Транспорт между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи
ГЛАВА 15. Аппарат Гольджи
Тонкое строение аппарата Гольджи
Секреторная функция аппарата Гольджи
Модификации белков в аппарате Гольджи
Сортировка белков в аппарате Гольджи
ГЛАВА 16. Лизосомы
Общие характеристики лизосом
Морфологическая неоднородность лизосом
Лизосомные патологии
ГЛАВА 17. Гладкий ретикулум и другие мембранные вакуоли
Гладкий (агранулярный) эндоплазматический ретикулум
Вакуоли растительных клеток
Сферосомы
Пероксисомы (микротельца)
Секреция белков и образование мембран у бактерий
ЧАСТЬ V. Цитоплазма: системы энергообеспечения клетки
ГЛАВА 18. Митохондрии - строение и функции
Общая морфология
Ультраструктура митохондрий
Функции митохондрий
Окислительное фосфорилирование у бактерий
Увеличение числа митохондрий
Авторепродукция митохондрий
Хондриом
ГЛАВА 19. Пластиды
Хлоропласт
Функции хлоропластов
Онтогенез и функциональные перестройки пластид
Фотосинтезирующие структуры низших эукариотических и прокариотических клеток
Геном пластид
ЧАСТЬ VI. Цитоплазма: опорно-двигательная система (цитоскелет)
ГЛАВА 20. Промежуточные филаменты
ГЛАВА 21. Микрофиламенты
Общие свойства микрофиламентов
Акто-миозиновые компоненты немышечных клеток
Мышечные клетки
ГЛАВА 22. Микротрубочки
Общая характеристика микротрубочек
Центры организации микротрубочек
Динеины и кинезины - моторные белки
ГЛАВА 23. Клеточный центр
Центросомы и центриоли
Центросомный цикл
Базальные тельца, строение и движение ресничек и жгутиков
Двигательный аппарат бактерий
ЧАСТЬ VII. Механизмы клеточного деления
ГЛАВА 24. Митотическое деление клеток
Общая организация митоза
Различные типы митоза эукариот
Морфология митотической фигуры
Центромеры и кинетохор
Динамика митоза
Самоорганизация системы микротрубочек
Митоз растительной клетки
Деление бактериальных клеток
ГЛАВА 25. Мейоз
Особенности профазы I мейотического деления
Стадия профазы I мейотического деления
ГЛАВА 26. Регуляция клеточного цикла
Фактор стимуляции митозов
Циклины
Регуляция клеточного деления у млекопитающих
Контрольные точки клеточного цикла
ГЛАВА 27. Гибель клеток: некроз и апоптоз
Некроз
Апоптоз
Ю.С. Ченцов
ВВЕДЕНИЕ В КЛЕТОЧНУЮ БИОЛОГИЮ.
ОБЩАЯ ЦИТОЛОГИЯ.
ПРЕДИСЛОВИЕ
Данный учебник "Введение в клеточную биологию" является продолжением предыдущей книги под названием "Общая цитология", 3е издание 1995 г.
За последние 50 лет произошло значительное развитие биологической науки, как бы ее вторая революция, если за первую считать времена после 1953 года. За это время гигантский шаг вперед сделала молекулярная биология и молекулярная генетика, клеточная и молекулярная инженерия, что позволило внедрить в практику, в промышленность многие, казалось бы, чисто теоретические разработки в различных областях современной биологии. Резкое расширение интересов исследователей и развитие многих принципиально новых методических подходов привело к накоплению за последние годы множества новых фактов и представлений, касающихся практически всех аспектов биологии клетки, как в изучении ее строения, так и в молекулярной и генетической ее организации. Поэтому чисто структурные, "цитологические" по представлению некоторых авторов, уровни изучения клетки как таковой уже просто невозможны, хотя бы потому, что невозможно оторвать структуру от функции. Следовательно и обучение студентов данному предмету должно также строиться на структурно-функциональном подходе в изучении клетки. Все это вызвало необходимость при новом издании учебника использовать название "Введение в клеточную биологию", ставя на второе место термин "цитология"", как устаревший или архаичный. Хотя сам термин "Клеточная биология" был применен впервые в названии книги Ж-Б. Карнуа еще в 1884 году.
В настоящем издании учебника, которое является кратким изложением курса "Общей цитологии", читаемого автором на биологическом факультете Московского Университета им. М.В. Ломоносова уже более 30 лет, сделаны значительные изменения, как, в первую очередь, в обновлении, дополнении и введении новой информации, так и в последовательности изложения материала. Здесь используется системный подход в анализе различных клеточных компонентов, что позволяет рассматривать их не в отрыве друг от друга, а в целостной совокупности, в элементарной единице живого - в клетке. Значительно расширен и обновлен материал о клеточном ядре, о мембранной вакуолярной системе, о цитоскелете, о клеточном делении, введены новые главы о регуляции клеточного цикла, о формах клеточной гибели (некроз и апоптоз) и многое другое.
Одна из особенностей этого учебника та, что курс "Общая цитология" читается студентам на первом курсе. Такое расположение курса цитологии в учебном плане студентов имеет свои преимущества и свои недостатки. Из недостатков главным, на наш взгляд, является то, что дать в достаточно полной мере сведения о строении клеток и о функциях ее компонентов очень трудно и сложно без привлечения материалов из смежных дисциплин, таких, как биохимия, биофизика, молекулярная биология. Студент же на первых курсах по современным учебным планам изучает сначала "общие" дисциплины: зоологию, ботанику, химию, физику, математику. Конечно было бы легче преподавателю читать курс цитологии после того, как студенты изучат эти общие дисциплины, а в добавок к тому и биохимию, и генетику и др. Но нам представляется невозможным изучение тонких физиологических отправлений организмов и клеток без знаний элементов их организации. Поэтому было решено идти на компромисс, давая в курсе краткие экскурсы в биохимию и молекулярную биологию. Эти вводные ознакомления, как нам представляется, не так трудны для студентов-биологов, так как они в основном укладываются в программу средней школы, и, кроме того, при сдаче конкурсных экзаменов школьники читают достаточно много дополнительной литературы (во всяком случае многие из них поражают обилием и глубиной знаний на вступительных экзаменах).
Другой особенностью курса является то, что он дает сведения о строении и функционировании клеток разного происхождения: бактерии, растения, животные. Это важно, так как будущие зоологи, ботаники, микробиологи и вирусологи, не говоря уже о биохимиках и биофизиках, должны знать клетку во всех ее формах и знать главные закономерности, являющиеся общими для клеток вне зависимости от их органного, тканевого или видового происхождения. Поэтому и в учебнике постоянно делаются сравнения строения разных клеток, прокариотических и эукариотических.
Представляется важным в курсе клеточной биологии давать не только объем конкретных знаний, но показывать как эти знания были получены. Поэтому часто в описании клеточных структур и их свойств введены описания экспериментов и методических приемов современной науки и основных методов современной клеточной биологии. Это делать необходимо потому, что нередко именно новые методические приемы и разработки могут быть основанием для развития новых направлений в изучении клетки.
В материалы этого издания внесен ряд дополнений по сравнению с предыдущим изданием. За прошедшие годы накопилось множество новых сведений о хроматине и хромосомах, о мембранах клетки, о цитоскелетных структурах и др. Это отражает бурное развитие работ по изучению клетки на самых разных уровнях, начиная с оптического, кончая молекулярным. Введение в учебник последних достижений науки не всегда оправдано, так как часто на основании новых фактов предлагаются гипотезы и теории, которые иногда не оправдываются, а полученные факты приобретают впоследствии иное объяснение. Все же ознакомление студентов с новинками науки крайне необходимо для того, чтобы они знали, чем живет наука в данный момент, какие"горячие точки" в ней привлекают внимание исследователей.
В заключение автор выражает большую благодарность своим коллегам кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ и Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также других кафедр и учреждений за помощь в работе над данным изданием, советы и критику: профессорам В.Ю. Полякову, Г.Е. Онищенко, И.А. Воробьеву и докторам биологических наук О.В. Зацепиной, Е.С. Надеждиной
Часть I. Введение. Предмет клеточной биологии
Цитология (от греч. kytos - ячейка, клетка) - наука о клетке, в современном звучании - биологии клетки - наука довольно молодая. Из среды других биологических наук она выделилась почти сто лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книге Ж-Б. Карнау "Биология клетки", вышедшей в 1884 г.
За последние 50 лет цитология из описательно-морфологической превратилась в экспериментальную науку, ставящую перед собой задачи изучения физиологии клетки, ее основных жизненных функций и свойств, ее биологии. Другими словами, современная цитология - это физиология клетки. Возможность такого переключения интересов исследователей возникла в связи с тем, что цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленного изучения клетки как таковой, для изучения ее общих свойств и функционирования уже с позиций этих наук, что и дало снование для появления некой синтетической науки о клетке, а именно биологии клетки или, как чаще называют, клеточной биологии. В этой науке плодотворно сочетаются как морфологические, так и молекулярно-биологические подходы, что позволяет в настоящее время считать, что термины цитология и биология клетки совпадают, т.к. их предметом изучения является клетка, имеющая свои собственные закономерности организации и функционирования.
Дисциплина "Биология клетки" относится к фундаментальным разделам биологии, т.к. она исследует и описывает единственную единицу всего живого на Земле - клетку. Познание клетки имеет важнейшее значение для развития множества других биологических наук, таких как физиология, генетика, молекулярная биология и др., т.к. дает им как бы субстрат, материал для изучения отдельных свойств именно клеток: все функциональные отправления организмов имеют клеточную основу. Огромное значение современная цитология или биология клетки, имеет для медицины, так как любые заболевания человеческого организма своей основой имеют патологию конкретных клеток или их групп, что важно для понимания развития болезни, для ее диагностики и для выбора методов лечения и профилактики заболевания. Длительное и пристальное изучение клетки как таковой привело к формулированию важного теоретического обобщения, формулированию так называемой клеточной теории, имеющей огромное общебиологическое значение.
Глава 1. Клеточная теория
Клеточная теория - это обобщенные представления о строении клеток как единиц живого, об их размножении и роли в формировании многоклеточных организмов.
Появлению и формулированию отдельных положений клеточной теории предшествовал довольно длительный (более трехсот лет) период накопления наблюдений над строением различных одноклеточных и многоклеточных организмов растений и животных. Этот период был связан с развитием применения и усовершенствования различных оптических методов исследований.
Роберт Гук (1665) первым наблюдал с помощью увеличительных линз подразделение тканей пробки на "ячейки", или "клетки". Его описания послужили толчком для появления систематических исследований анатомии растений (Мальпиги, 1671; Грю, 1671), которые подтвердили наблюдения Роберта Гука и показали, что разнообразные части растений состоят из тесно расположенных "пузырьков", или "мешочков". Позднее А. Левенгук (1680) открыл мир одноклеточных организмов и впервые увидел клетки животных (эритроциты). Позднее клетки животных были описаны Ф. Фонтана (1781); но эти и другие многочисленные исследования не привели в то время к пониманию универсальности клеточного строения, к четким представлениям о том, что же являет собой клетка. Прогресс в изучении микроанатомии и клетки связан с развитие микроскопирования в XIX в. К этому времени изменились представления о строении клеток: главным в организации клетки стала считаться не клеточная стенка, а собственно ее содержимое, протоплазма (Пуркиня, 1830). В протоплазме был открыт постоянный компонент клетки - ядро (Браун, 1833). Все эти многочисленные наблюдения позволили Т. Шванну в 1838 г. сделать ряд обобщений. Он показал, что клетки растений и животных принципиально сходны между собой (гомологичны). "Заслуга Т. Шванна заключалась не в том, что он открыл клетки как таковые, а в том, что он научил исследователей понимать их значение"(Вальдейер, 1909). Дальнейшее развитие эти представления получили в работах Р. Вирхова (1858). Создание клеточной теории стало важнейшим событием в биологии, одним из решающих доказательств единства всей живой природы. Клеточная теория оказала значительное влияние на развитие биологии, послужили главным фундаментом для развития таких дисциплин, как эмбриология, гистология и физиология. Она дала основы для понимания жизни, для объяснения родственной взаимосвязи организмов, для понимания индивидуального развития.
Основные положения клеточной теории сохранили свое значение и на сегодняшний день, хотя более чем за сто пятьдесят лет были получены новые сведения о структуре, жизнедеятельности и развитии клеток. В настоящее время клеточная теория постулирует:
1) Клетка - элементарная единица живого: - вне клетки нет жизни.
2) Клетка - единая система, состоящая из множества закономерно связанных друг с другом элементов, представляющих собой определенное целостное образование, состоящее из сопряженных функциональных единиц - органелл или органоидов.
3) Клетки сходны - гомологичны - по строению и по основным свойствам.
4) Клетки увеличиваются в числе путем деления исходной клетки после удвоения ее генетического материала (ДНК): клетка от клетки.
5) Многоклеточный организм представляет собой новую систему, сложный ансамбль из множества клеток, объединенных и интегрированных в системы тканей и органов, связанных друг с другом с помощью химических факторов, гуморальных и нервных (молекулярная регуляция).
6) Клетки многоклеточных организмов тотипотентны, т.е. обладают генетическими потенциями всех клеток данного организма, равнозначны по генетической информации, но отличаются друг от друга разной экспрессией (работой) различных генов, что приводит к их морфологическому и функциональному разнообразию - к дифференцировке.
1. Клетка - элементарная единица живого
Представление о клетке как о самостоятельной жизнедеятельной единице было дано еще в работах Т. Шванна. Р. Вирхов также считал, что каждая клетка несет в себе полную характеристику жизни: "Клетка есть последний морфологический элемент всех живых тел, и мы не имеем права искать настоящей жизнедеятельности вне ее" (1858).
Современная наука полностью доказала это положение. В популярной литературе клетку часто называют "атомом жизни", "квантом жизни", подчеркивая тем самым, что клетка - это наименьшая единица живого, вне которой нет жизни.
Такая общая характеристика клетки должна в свою очередь опираться на определение живого - что такое живое, что такое жизнь. Очень трудно дать окончательное определение живого, жизни.
М.В. Волькенштейн (1965) дает следующее определение жизни: "живые организмы представляют собой открытые (т.е. обменивающиеся с окружающей средой веществом и энергией), саморегулирующиеся и самовоспроизводящиеся системы, важнейшими функционирующими веществами которых являются белки и нуклеиновые кислоты". Живому свойствен ряд совокупных признаков, таких, как способность к воспроизведению (репродукции), использование и трансформация энергии, метаболизм, чувствительность, изменчивость. И такую совокупность этих признаков можно обнаружить на клеточном уровне. Нет меньшей единицы живого, чем клетка. Мы можем выделить из клетки отдельные ее компоненты или даже молекулы и убедиться, что многие из них обладают специфическими функциональными особенностями. Так, выделенные актомиозиновые фибриллы могут сокращаться в ответ на добавление АТФ; вне клетки прекрасно "работают" многие ферменты, участвующие в синтезе или распаде сложных биоорганических молекул; выделенные рибосомы в присутствии необходимых факторов могут синтезировать белок, разработаны неклеточные системы ферментативного синтеза нуклеиновых кислот и т.д. Можно ли считать все эти клеточные компоненты, структуры, ферменты, молекулы живыми? Можно ли считать живым актомиозиновый комплекс? Думается, что нет, хотя бы потому, что он обладает лишь частью набора свойств живого. То же относится и к остальным примерам. Только клетка как таковая является наименьшей единицей, обладающей всеми вместе взятыми свойствами, отвечающими определению "живое".
Что же такое клетка, какое ей можно дать общее определение? Из школьного курса известно, что разнообразные клетки имеют совершенно несходную морфологию, их внешний вид и величины значительно расходятся. Действительно, что общего между звездчатой формой некоторых нервных клеток, шаровидной формой лейкоцита и трубкообразной формой клетки эндотелия. Такое же разнообразие форм встречается и среди микроорганизмов. Поэтому мы должны находить общность живых объектов не в их внешней форме, а в общности их внутренней организации.
Среди живых организмов встречаются два типа организации клеток. К наиболее простому типу строения можно отнести клетки бактерий и синезеленых водорослей, к более высокоорганизованному - клетки всех остальных живых существ, начиная от низших растений и кончая человеком.
Принято называть клетки бактерий и синезеленых водорослей прокариотическими (доядерными клетками), а клетки всех остальных представителей живого - эукариотическими (собственно ядерными), потому что у последних обязательной структурой служит клеточное ядро, отделенное от цитоплазмы ядерной оболочкой.
Содержимое прокариотической клетки одето плазматической мембраной, играющей роль активного барьера между собственно цитоплазмой клетки и внешней средой (рис. 1, 2). Обычно снаружи от плазматической мембраны расположена клеточная стенка или оболочка - продукт клеточной активности. У прокариотических клеток нет морфологически выраженного ядра, но присутствует в виде так называемого нуклеоида зона, заполненная ДНК.
В основном веществе (или матриксе) цитоплазмы прокариотических клеток располагаются многочисленные рибосомы, цитоплазматические же мембраны обычно выражены не так сильно, как у эукариотических клеток, хотя некоторые виды бактерий (например, фототрофные пурпурные бактерии) богаты внутриклеточными мембранными системами. Очень сильно цитоплазматические мембраны развиты у синезеленых водорослей. Обычно все внутриклеточные мембранные системы прокариот развиваются за счет плазматической мембраны.
Но не только присутствие морфологически -выраженного ядра является отличительным признаком эукариотических клеток. У клеток высшего типа (эукариотических) кроме ядра в цитоплазме существует целый набор специальных обязательных структур, органелл, выполняющих отдельные специфические функции (рис. 3, 4). К числу органелл относят мембранные структуры: систему эндоплазматической сети (ретикулума), аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, пластиды (для клеток растений). Кроме того, для эукариотических клеток характерно наличие мембранных структур, таких как микротрубочки, микрофиламенты, центриоли (для клеток животных) и др.
Эукариотические клетки обычно намного крупнее прокариотических. Так, палочковидные бактерии имеют длину до 5 мкм, а толщину около 1 мкм, в то время как эукариотические клетки в поперечнике могут достигать десятков мкм.
Несмотря на четкие морфологические отличия, и прокариотические и эукариотические клетки имеют много общего, что и позволяет отнести их к одной, клеточной, системе организации живого. И те и другие одеты плазматической мембраной, обладающей сходной функцией активного переноса веществ из клетки и внутрь ее; синтез белка у них происходит на рибосомах; сходны и другие процессы, такие, как синтез РНК и репликация ДНК, похожи и биоэнергетические процессы. Исходя из вышесказанного клетке можно дать общее определение. Клетка - это ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система биополимеров (белков, нуклеиновых кислот) и их макромолекулярных комплексов, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.
Короче: клетка - самоподдерживающаяся и самовоспроизводящаяся система биополимеров. Это определение дает описание основных свойств "живого" - воспроизведение подобного себе из неподобного себе.
У многоклеточных организмов часть клеток утрачивает свойство размножаться, но они остаются клетками до тех пор, пока способны вести синтетические процессы, регулировать транспорт веществ межу клеткой и средой, использовать для этих процессов энергию. Есть примеры безъядерных клеток (эритроциты и тромбоциты млекопитающих, некоторые мышечные клетки моллюсков), это скорее не собственно клетки, а их остатки - одетые мембраной участки цитоплазмы с ограниченными функциональными потенциями.
Одно время первый постулат клеточной теории подвергался многочисленным нападкам и критике. Некоторые авторы указывали, что в многоклеточных организмах, особенно у животных, кроме клеток существуют и межклеточные, промежуточные вещества, которые тоже, казалось обладали свойствами живого. Однако было показано, что межклеточные вещества (основное вещество и волокна соединительной ткани) представляют собой не самостоятельные образования, а продукты активности отдельных групп клеток.
Другие возражения касались того, что часто у животных кроме отдельных клеток встречаются так называемые симпласты и синцитии (соклетия), а у растительных клеток - плазмодии. По морфологическому описанию - это крупные цитоплазматические образования со множеством ядер, не разделенные на отдельные клеточные территории. Примерами таких симпластов могут быть мышечные волокна позвоночных или эпидермис у ленточных червей, а также плазмодии у низших грибов миксомицетов. Однако если проследить за развитием таких "неклеточных" форм, то легко убедиться в том, что они возникают вторично за счет слияния отдельных клеток или же в результате деления одних ядер без разделения цитоплазмы, т.е. без цитотомии.
2. Клетка - единая система сопряженных функциональных единиц
В начале нашего изложения в согласии с клеточной теорией мы обсуждали первый ее постулат: клетка - наименьшая единица живого. Однако мы знаем о сложности строения этой "единицы", которая состоит, содержит в себе множество типов внутриклеточных структур, выполняющих разнообразные функции. При этом каждый компонент "специализирован" на выполнение одной собственной группы функций, и другие компоненты не могут работать "по совместительству", не могут принять на себя основные функции других внутриклеточных структур. Важно отметить, что каждая из функций является обязательной, без выполнения которой клетка не может существовать. Все это в значительной степени напоминает многоклеточный организм, который также является особой живой системой, обеспечивающей свое собственное существование и воспроизведение. Все тело организма может быть подразделено на ряд подсистем или систем, обеспечивающих отправление целого ряда организменных функций: пищеварительная, выделительная, мышечная, нервная, половая система и др. И эти функции выполняются отдельными или рядом органов: кишечник, почки, мозг и т.д. И в данном примере эти системы в основном монофункциональны и незаменимы. В общей системе организма как целого, все они играют главные, а не подчиненные роли. Жизнь организма становится невозможной при выключении любой из этих систем.
Формально любую клетку можно "разложить" на ряд как бы независимых структурных и функциональных компонентов, выполняющих свои специфические функции. Так, например, эукариотические клетки принято разделять на ядра и цитоплазму. В цитоплазме, в свою очередь выделяют гиалоплазму или основную плазму клетки (цитозоль - растворимый компонент цитоплазмы по терминологии биохимиков), а также целый ряд структур - органелл, выполняющих свои отдельные специфические функции. Это мембранные органеллы: одномембранные (вакуолярная система, включающая в себя эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, эндо- и экзоцитозные вакуоли, лизосомы, пероксисомы) и двумембранные (митохондрии и пластиды). К немембранным органеллам нужно отнести рибосомы и систему цитоскелетных фибрилл. Кроме того вся поверхность клетки покрыта цитоплазматической мембраной, тесно функционально связанной как с вакуолярной системой, с элементами цитоскелета, так и с гиалоплазмой.
Но каждая из этих морфологических "отдельностей" представляет собой новую систему или подсистему функционирования. Так клеточное ядро является системой хранения, воспроизведения и реализации генетической информации. Гиалоплазма - система основного промежуточного обмена; рибосомы - элементарные клеточные машины синтеза белка; цитоскелет - опорно-двигательная система клетка; вакуолярная система - система синтеза и внутриклеточного транспорта белковых биополимеров и генезиса многих клеточных мембран; митохондрии - органеллы энергообеспечения клетки за счет синтеза АТФ, пластиды растительных клеток - система синтеза АТФ и фотосинтеза, плазматическая мембрана - барьерно-рецепторно-транспортная система клетки.
Аналоги этих систем есть и у прокариот: это - плазматическая мембрана, которая кроме пограничной роли участвует в процессах синтеза АТФ и фотосинтеза, цитозоль, рибосомы, и даже элементы цитоскелета.
Важно подчеркнуть, что все эти подсистемы клетки образуют некое сопряженное единство, находятся во взаимозависимости. Так, например, нарушение функций ядра сразу сказывается на синтезе клеточных белков, нарушение работы митохондрий прекращает все синтетические и обменные процессы в клетке, разрушение элементов цитоскелета прекращает внутриклеточный транспорт и т.д. Как в часовом механизме повреждение любой его части приводит к остановке всей системы в целом.
3. Гомологичность клеток
Термин гомологичность означает сходство по коренным свойствам и отличие по второстепенным. Так, например, руки человека, крыло птицы, передняя нога лошади гомологичны, сходны не только по плану строения, но и по своему происхождению. Подобно этому можно говорить, что разные клетки организмов растительного или животного происхождения сходны, гомологичны.
Это обобщение, сделанное еще Т. Шванном, нашло свое подтверждение и развитие в современной цитологии, использующей новые достижения техники, такие, как электронный микроскоп. Гомологичность строения клеток наблюдается внутри каждого из типов клеток: прокариотическом и эукариотическом. Хорошо известно разнообразие клеток как бактериальных, так и высших организмов. Такое одновременное сходство строения и разнообразие форм определяются тем, что клеточные функции можно грубо подразделить на две группы: обязательные и факультативные. Обязательные функции, направленные на поддержание жизнеспособности своих клеток, осуществляются специальными внутриклеточными структурами.
Так, у всех прокариотических клеток плазматическая мембрана не только ограничивает собственно цитоплазму, но и функционирует как структура, обеспечивающая активный транспорт веществ и клеточных продуктов, как система окислительного фосфорилирования, как источник образования клеточных бактериальных стенок. ДНК нуклеоида бактерий и синезеленых водорослей обеспечивает генетические свойства клеток и т.д. Рибосомы цитоплазмы - единственные аппараты синтеза полипептидных цепей , - также обязательный компонент цитоплазмы прокариотической клетки. Разнообразие же прокариотических клеток - это результат приспособленности отдельных бактериальных одноклеточных организмов к условиям среды обитания. Прокариотические клетки могут отличаться друг от друга толщиной и устройством клеточной стенки, ,складчатостью плазматической мембраны, количеством и структурой цитоплазматических выростов этой мембраны, количеством и свойствами внутриклеточных вакуолей и мембранных скоплений и др. Но "общий план" строения прокариотических клеток остается постоянным.
Та же картина наблюдается и для эукариотических клеток. При изучении клеток растений и животных бросается в глаза разительное сходство не только в микроскопическом строении этих клеток, но и в деталях строения их отдельных компонентов. У эукариот так же, как у прокариот, клетки отделены друг от друга или от внешней среды активной плазматической мембраной, которая может принимать участие в выделении веществ из клетки и построении внеклеточных структур, что особенно выражено у растений. У всех эукариотических клеток от низших грибов до позвоночных всегда имеется ядро., принципиально сходное по построению у разных организмов. Строение и функции внутриклеточных структур также в принципе определяется гомологичностью общеклеточных функций, связанных с поддержанием самой живой системы (синтез нуклеиновых кислот и белков, биоэнергетика клетки и т.д.).
Одновременно мы видим и разнообразие клеток даже в пределах одного многоклеточного организма.. Так, например, по форме мало похожи друг на друга такие клетки, как мышечная или нервная. Современная цитология показывает, что различие клеток связано со специализацией их функций, с развитием особых функциональных клеточных аппаратов. Так, если рассматривать мышечную клетку, то в ней кроме общеклеточных структур (мембранные системы ретикулума, аппарат Гольджи, рибосомы и др.) встречаются в большом количестве фибриллярные компоненты, обеспечивающие специальную функциональную нагрузку, характерную для этой клетки.
В нервной клетке кроме общеклеточных компонентов можно отметить специфические черты: наличие длинных и разветвленных клеточных отростков, оканчивающихся специальными структурами передачи нервного импульса; своеобразную композицию в цитоплазме из элементов эндоплазматической сети (тигроид), большое количество микротрубочек в клеточных отростках. Вся совокупность этих отличительных черт нервной клетки связана с ее специализацией - передачей нервного импульса. Однако и микротрубочки и микрофиламенты можно обнаружить практически в любых эукариотических клетках, хотя они будут и не так обильны. Например, филаменты, сходные по химизму с актиновыми фибриллами мышечных клеток, имеются в цитоплазме фибробластов. В ней же обнаруживаются и микротрубочки. Следовательно, и микрофиламенты и микротрубочки представляют собой обязательные общеклеточные структуры. Сейчас известно, что микрофиламенты клеток представлены актином, что указывает на их общеклеточное значение - обеспечивать подвижность клеток. В мышечных клетках эта функция стала главной, поэтому так сильно в них выражен сократительный аппарат.
Структурное разнообразие клеток многоклеточного организма можно объяснить отличием их специальных функций, осуществляющихся данной клеткой как бы на фоне общих, обязательных клеточных функций.
Другими словами, гомологичность в строении клеток определяется сходством общеклеточных функций, направленных на поддержание жизни самих клеток и на их размножение. Разнообразие же в строении клеток многоклеточных - результат функциональной специализации.
4. Клетка от клетки
Формулировка положения "Всякая клетка от клетки" (Omnis cellula e cellula) связана с именем знаменитого ученого Р. Вирхова. Т. Шванн в своих обобщениях подчеркивал одинаковость принципа развития клеток как у животных, так и у растений. Это представление базировалось на выводах Шлейдена о том, что клетки могут образовываться из зернистой массы в недрах клеток заново (теория цитобластемы). Р. Вирхов как противник идеи о самозарождении жизни настаивал на "преемственном размножении клеток". Сегодня сформулированное Р. Вирховым афористическое определение можно считать биологическим законом. Размножение клеток прокариотических и эукариотических происходит только путем деления исходной клетки, которому предшествует воспроизведение ее генетического материала (редупликация ДНК).
У эукариотических клеток единственно полноценным способом деления является митоз (или мейоз при образовании половых клеток). При этом образуется специальный аппарат клеточного деления - клеточное веретено, с помощью которого равномерно и точно по двум дочерним клеткам распределяются хромосомы, до этого удвоившиеся в числе. Этот тип деления наблюдается у всех эукариотических, как растительных, так и животных клеток.
Прокариотические клетки, делящиеся так называемым бинарным образом, также используют специальный аппарат разделения клеток, значительно напоминающий митотический способ деления эукариот (см. ниже).
Современная наука отвергает иные пути образования клеток и увеличение их числа. Появившиеся одно время описания образования клеток из "неклеточного живого вещества" оказались в лучшем случае результатом методических недостатков или даже ошибок, а в худшем - плодом научной недобросовестности.
Одно время считали, что клетки могут размножаться прямым делением, путем так называемого амитоза. Однако прямое разделение клеточного ядра, а затем и цитоплазмы, наблюдается только у некоторых инфузорий. При этом амитотически делится только макронуклеус, в то время как генеративные микронуклеусы делятся исключительно путем митоза, вслед за которым наступает разделение клетки - цитотомия. Часто появление дву- или многоядерных клеток также считали результатом амитотического деления ядер. Однако появление многоядерных клеток является или результатом слияния друг с другом нескольких клеток (гигантские многоядерные клетки тел воспаления, остеокласты и др.) или результатом нарушения самого процесса цитотомии (см. ниже).
5. Клетки и многоклеточный организм
Роль отдельных клеток во многоклеточном организме подвергалась неоднократному обсуждению и критике и претерпела наибольшие изменения. Т. Шванн представлял себе многогранную деятельность организма как сумму жизнедеятельности отдельных клеток. Это представление было в свое время принято и расширено Р. Вирховым и получило название теории "клеточного государства". Вирхов писал: "...всякое тело, сколько-нибудь значительного объема, представляет устройство, подобное общественному, где множество отдельных существований поставлено в зависимость друг от друга, но так, однако же, что каждое из них имеет свою собственную деятельность, и если побуждение к этой деятельности оно и получает от других частей, зато самою работу свою оно совершает собственными силами" (Вирхов, 1859).
Действительно, какую бы сторону деятельности целого организма мы ни брали, будь то реакция на раздражение или движение, иммунные реакции, выделение и многое другое, каждая из них осуществляется специализированными клетками. Клетка - это единица функционирования в многоклеточном организме. Но клетки объединены в функциональные системы, в ткани и органы, которые находятся во взаимной связи друг с другом. Поэтому нет смысла в сложных организмах искать главные органы или главные клетки. Многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток, объединенные в целостные интегрированные системы тканей и органов, подчиненные и связанные межклеточными, гуморальными и нервными формами регуляции. Вот почему мы говорим об организме как о целом. Специализация частей многоклеточного единого организма, расчлененность его функций дают ему большие возможности приспособления для размножения отдельных индивидуумов, для сохранения вида.
В конечном итоге можно сказать, что клетка в многоклеточном организме - это единица функционирования и развития. Кроме того, первоосновой всех нормальных и патологических реакций целостного организма является клетка. Действительно, все многочисленные свойства и функции организма выполняются клетками. Когда в организм попадают чужеродные белки, например бактериальные, то развивается иммунологическая реакция. При этом в крови появляются белки-антитела, которые связываются с чужими белками и их инактивируют. Эти антитела - продукты синтетической активности определенных клеток, плазмацитов. Но, чтобы плазмациты начали вырабатывать специфические антитела, необходима работа и взаимодействие целого ряда специализированных клеток-лимфоцитов и макрофагов. Другой пример, простейший рефлекс - слюноотделение в ответ на предъявление пищи. Здесь проявляется очень сложная цепь клеточных функций: зрительные анализаторы (клетки) передают сигнал в кору головного мозга, где активируется целый ряд клеток, передающих сигналы на нейроны, которые посылают сигналы к разным клеткам слюнной железы, где одни вырабатывают белковый секрет, другие выделяют слизистый секрет, третьи, мышечные, сокращаясь, выдавливают секрет в протоки, а затем в полость рта. Такие цепи последовательных функциональных актов отдельных групп клеток можно проследить на множестве примеров функциональных отправлений организма.
Жизнь нового организма начинается с зиготы - клетки, получившейся в результате слияния женской половой клетки (ооцита) со спермием. При делении зиготы возникает клеточное потомство, которое также делится, увеличивается в числе и приобретает новые свойства, специализируется, дифференцируется. Рост организма, увеличение его массы есть результат размножения клеток и результат выработки ими разнообразных продуктов (например, вещества кости или хряща).
И наконец, именно поражение клеток или изменение их свойств является основой для развития всех без исключения заболеваний. Данное положение было впервые сформулировано Р. Вирховым (1858) в его знаменитой книге "Клеточная патология". Классическим примером клеточной обусловленности развития болезни может служить сахарный диабет, широко распространенное заболевание современности. Его причина - недостаточность функционирования лишь одной группы клеток, так называемых В-клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе. Эти клетки вырабатывают гормон инсулин, участвующий в регуляции сахарного обмена организма.
Все эти примеры показывают важность изучения структуры, свойств и функций клеток для самых различных биологических дисциплин и для медицины.
6. Тотипотентность клеток
Как же возникают разнообразные типы клеток в многоклеточных организмах? Известно, что организм человека, развившийся всего из одной исходной клетки, зиготы, содержит более 200 различных типов клеток. Каким образом возникает это разнообразие, сегодня до конца не ясно, так как еще мало конкретных данных, касающихся путей появления тех или иных клеточных типов.
Современная биология на базе представлений эмбриологии, молекулярной биологии и генетики считает, что индивидуальное развитие от одной клетки до многоклеточного зрелого организма - результат последовательного, избирательного включения работы разных генных участков хромосом в различных клетках. Это приводит к появлению клеток со специфическими для них структурами и особыми функциями, т.е. к процессу, называемому дифференцировкой.
Дифференцировка - это результат избирательной активности разных генов в клетках по мере развития многоклеточного организма. Другими словами, дифференцировка - это результат дифференциальной активности генов. Следовательно, можно утверждать, что любая клетка многоклеточного организма обладает одинаковым полным фондом генетического материала, всеми возможными потенциями для проявления этого материала, т.е. все - или тотипотентна, но в разных клетках одни и те же гены могут находиться или в активном или в репрессированном состоянии. Эти представления базируются на большом экспериментальном материале. Стало возможным вырастить зрелое растение из одной его соматической клетки. Многочисленные опыты на лягушках показали, что ядра дифференцированных клеток сохраняют все те потенции, которые есть у ядра в зиготе.
Было найдено, что если после оплодотворения яйцеклетки лягушки у возникшей зиготы микрохирургически удалить ядро, а на место его имплантировать ядро из другой зиготы, то произойдет полное развитие нормальной лягушки. Если же в этом эксперименте ядро зиготы заменить на ядро из специализированной (дифференцированной) клетки взрослого животного, то развитие эмбриона пройдет нормальным путем, вплоть до появления взрослой лягушки (рис. 5).
Аналогичным путем можно в безъядерную зиготу млекопитающих ввести ядро из ткани взрослого животного и получить клонированную особь, имеющую идентичную генетическую информацию с животным-донором. Так была получена (клонирована) овечка Долли.
Из этого вытекает, что клетки многоклеточных организмов обладают полным набором генетической информации, свойственной для данного организма, в этом отношении они равнозначны. Но одновременно клетки отличаются по объему проявления этой информации, что и создает возможность появления специализированных клеток. Однако эти представления не могут быть приняты полностью, так как имеются исключения, показывающие, что при дифференцировке происходит количественное изменение генетического материала. Так, при дроблении яиц аскариды клетки, дающие начало соматическим тканям, теряют часть хромосомного материала (диминуция). Сходный процесс описан у насекомых-галлин. В этом случае при обособлении соматических ядер происходит значительная редукция хромосомного материала. При этом клетки половых зачатков содержат 40 хромосом, а соматические - всего 8. Следует помнить, что такие различия были обнаружены только между половыми и соматическими клетками; различий в хромосомных наборах между разными соматическими клетками не обнаружено. Однако в последнее время появились данные о том, что плазмациты, в результате специфической дифференцировки при иммунном ответе претерпевают молекулярные перестройки в области генов, ответственных за синтез антител, и тем самым генетически отличаются от остальных клеток.
Общим же законом для многоклеточных растительных и животных организмов является то, что несмотря на структурные и функциональные различия клеток данного организма в генетическом отношении они однородны, тождественны и тотипотентны.
Подводя итог рассмотрению современного состояния клеточной теории, нужно сказать, что именно клетка является единицей развития многоклеточных, единицей их строения, единицей функционирования и единицей патологических изменений организма.
Для того, чтобы понять не только значение структурных особенностей клетки, но и, главное, разобраться в функциональных отправлениях ее отдельных компонентов и всей клетки в целом, чтобы сочетать изучение морфологии клетки с главнейшими биохимическими и генетическими особенностями ее устройства и работы, чтобы изучать клетку именно с позиций современной клеточной биологии, необходимо хотя бы вкратце вспомнить основные молекулярно-биологические закономерности, еще раз кратко обратиться к содержанию центральной догмы молекулярной биологии (см. глава 3).
Глава 2. Методы клеточной биологии
Цитология возникла как ветвь микроанатомии, и поэтому одним из основных методов, который используют цитологи, - это метод световой микроскопии. В настоящее время этот метод нашел целый ряд дополнений и модификаций, что значительно расширило круг задач и вопросов, решаемых цитологией. Революционным моментом в развитии современной цитологии и биологии вообще было применение электронной микроскопии, открывшей необычайно широкие перспективы. С введением электронной микроскопии в ряде случаев уже трудно провести границу между собственно цитологией и биохимией, они объединяются на уровне макромолекулярного изучения объектов (например, микротрубочек, мембран, микрофиламентов и т.д.). Все же главным методическим приемом в цитологии остается визуальное наблюдение объекта. При этом исследователь не просто изучает и описывает морфологию объекта, он может видеть степень его сложности, локализовать отдельные детали, получить сведения о химизме той или иной части клетки, визуально и достаточно точно оценить ее метаболические свойства, выяснить строение этой части на макромолекулярном уровне. Это создает своеобразие цитологии как науки, использующей главным образом методы изучения клетки непосредственно глазом, вооруженным увеличивающими оптическими системами. Кроме того, в цитологии применяются многочисленные приемы препаративной и аналитической биохимии, методы биофизики.
Световая микроскопия
Световой микроскоп, главный прибор биологии, представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсатора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 6). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 105 раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равно
?
d = 0,61 -----------
n sin ?
где ? - длина волны света, используемого для освещения объекта; n - коэффициент преломления среды; ? - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны - чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n sin ?) - чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть "полезное" увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.
Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод "темного поля", или, как его называли раньше, метод "ультрамикроскопии". Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.
Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов - метод фазово-контрастной микроскопии, широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.
Сходный прием используется в интерференционном микроскопе. Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.
С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор - это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
Витальное (прижизненное) изучение клеток
Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма.
Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.
Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для получения первичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал; культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.
При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру (около 20о для хладнокровных и около 37о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клеток является соблюдение стерильности. Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; это специальные клеточные штаммы, приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью это клетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.
Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.
В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.
Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.
Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможно использовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемки подвижных объектов .
При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях - "микрокузницах". При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазме и ядре.
С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить за судьбой второго, интактного. В этом случае показано, что второе ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и "работает за двоих". С помощью микропучков удается поразить часть митотической хромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражение центромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхождения хромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применять аппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.
При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1 : 200000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.
При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.
Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки - это хлоропласты.
Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Этот способ сходен с витальным окрашиванием в том смысле, что здесь также используют очень низкие концентрации красителя (1 х 10-4-1 х 10-5). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. Так, например, флуорохром акридиновый оранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами. Причем, связываясь в мономерной форме с ДНК, он флуоресцирует зеленым цветом, а в димерной форме с РНК светится красным цветом. Наблюдая за живыми клетками, окрашенными акридиновым оранжевым, видно, что их ядра имеют зеленый цвет свечения, а цитоплазма и ядрышки святятся красным цветом. Тем самым в живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию (а в некоторых случаях рассчитывать количество) тех или иных химических веществ. Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, слизью, кератином и др.
В живые клетки можно инъецировать также меченые флуорохромами антитела. Так, например, введенные в клетку связанные с флуорохромом антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперь можно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.
В последнее время начинает широко использоваться для изучения живых клеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особенно фазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения. При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения, которая как бы "убирает" фоновые уровни и выделяет, контрастирует наблюдаемые структуры. Такая методика позволяет на телеэкране видеть такие структуры как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньше разрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не только заменяют цейтраферную киносъемку, вместо которой используется видео-запись, но и позволяет компьютерную обработку изображения: сведения о плотности структур, о их параметрах, числе и трехмерной организации. В сочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают огромные перспективы в изучении живых клеток.
Обычные методы световой микроскопии трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.
Изучение фиксированных клеток
Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале. Если клетку повредить, она начинает претерпевать ряд изменений, а после смерти клетки в ней активируются автолитические ферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры. Следовательно, задачи фиксации - это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры). К сожалению, еще не найден такой химический фиксатор, который бы удовлетворял всем этим требованиям.
Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.
После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей.
Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают такие срезы и отдельных клеток.
Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол - парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.
Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе - микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препараты можно длительно хранить.
Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).
Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся с основными красителями, будут, как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры.
Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.
Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.
Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена (рис. 8). Суть ее в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором , реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть ДНК, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).
Также специфически можно определить локализацию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.
<< Пред. стр. 1 (из 7) След. >>
Список литературы по разделу