<< Пред. стр. 30 (из 41) След. >>
Список литературы по разделу
размножившись, образует сомкнутый монослой, покрывающий дно
сосуда Никто не знает при этом, сколько клеток мигрирует из
трансплантата и сколько делений они совершают По мнению Голдштейна и соавторов, эта процедура соответствует примерно 10
удвоениям популяции [Goldstein et al., 1975]. В случае же эмбриональной ткани легкого ее обрабатывают трипсином, и суспендированные клетки пересевают в сосуд с питательной средой [Hayflick,
1968] После того как культура клеток образует монослой, ее
пересевают, обрабатывая 0 1Х-ным раствором трипсина, суспендируя и перенося желаемое число клеток в новые сосуды с
питательной средой Пересев в отношении 1 2 означает, что только
половина клеток, образовавших сомкнутый монослой, пересевается в
сосуд с той же поверхностью Когда и в этом сосуде в результате
деления клеток образуется монослой, считают, что произошло
удвоение клеточной популяции, соответствующее в среднем одному
делению клеток Подобную операцию повторяют многократно (в
случае эмбриональных фибробластов человека около 50 раз), до тех
пор, пока культура не потеряет способности к быстрому восстановлению своей численности Теперь попытаемся оценить число
делений, которое совершают клетки Известно, что через сутки после
операции пересева в живых остается только 50—70Х клеток
'молодых" культур и лишь 25Х клеток "старых" культур (эти клетки
являются более крупными и сильнее всего повреждаются при
суспендировании) [Гаврилов, Гаврилова, 1978, 1982]* Таким образом.
40—60 пересевов соответствуют не 40—60 удвоениям популяции, а
80—120 удвоениям, которые совершают выжившие клетки Далее, одно
удвоение клеточной популяции соответствует одному делению
клеток лишь в том случае, если все клетки способны делиться На
самом же деле доля делящихся клеток сильно уменьшается при
культивировании и к последнему пересеву составляет всего 10—20Х
[Там же] Можно показать, что в том случае, когда только 10Х клеток
сохраняет способность к делению, им необходимо поделиться 10 раз,
чтобы численность всей культуры удвоилась [Гаврилов, Ягужинский,
1978, Гаврилов, Гаврилова, 1982] Если учесть это обстоятельство, то
окажется, что 80—120 удвоений численности клеток соответствуют
170±30 делениям Итак, оказывается, что 50 пересевов клеток человека соответствует не 50, а 170±30 делениям
Самое главное, однако, состоит в том, что и это число делений
оказывается не окончательным Дело в том, что гибель клеточной
культуры определяется весьма своеобразно Оказывается, культуру
клеток называют мертвой лишь потому, что в течение произвольно
заданного интервала времени (обычно от одной до четырех недель)
Такое массовое разрушение клеток при пересеве в сочетании с низкими темпами
восстановления численности "старых" культур и порождало иллюзию естественной
массовой дегенерации и гибели клеток описанную в ряде работ [Swim, 1959,
Hayflick. Moorhead, 1961, Hayfhck, 1968]
189
ее численность не возрастает до желаемой величины (обычно
задается численность, в два-четыре раза превышающая исходную) .
Более того, в "мертвых" культурах еще остается 10—20Х клеток,
способных делиться, поэтому культура может компенсировать
естественную гибель клеток (которая, кстати, не увеличивается) и
даже медленно расти [Гаврилов, Гаврилова, 1978; 19821. Оказалось
также, что абсолютное число делящихся клеток в расчете на всю
образующуюся клеточную массу не уменьшается, а происходит лишь
их разбавление неделящимися клетками. В результате, когда доля
делящихся клеток становится близка к 10Х. культура действительно
не может расти столь быстро, чтобы ее считали живой. Таким
образом, феномен "гибели" культуры клеток не только не эквивалентен гибели клеток, но даже не означает того. что все клетки
культуры имеют ограниченную способность к делению. В результате
проведенных исследований нами был сделан вывод, что в культуре
клеток происходит их дифференцировка с образованием неделящихся клеток, но некоторые клетки культуры являются стволовыми и
могут размножаться неограниченно [Гаврилов, Ягужинский, 1978].
Некоторые из сделанных нами выводов были одновременно и
независимо подтверждены другими авторами [Belletal., 1978, р. 1160]:
"...одной из наименее документированных особенностей гипотезы
старения in vitro является общепринятое утверждение о том, что
клетки в фазе 3 являются нежизнеспособными и в конце концов
погибают. Это утверждение не имеет никакого серьезного экспериментального подтверждения ...Наш опыт свидетельствует о том.
что сам по себе пересев неизбежно приводит к потере клеток. ...Мы
наблюдали выживаемость фибробластов крайней плоти (штамм 1519) в
культуре в течение длительного периода после того, как клеточное
деление прекращалось. Наши первые культуры клеток штамма 1519
поддерживались живыми в среде Хэма ...в течение 22 месяцев и в
течение периода от года до 14 месяцев после прекращения клеточных делений ...Биохимические исследования показали, что, несмотря на то что клетки фазы 3 отличаются в некоторых отношениях
от клеток фазы 2, они, по существу, нормальны. ...Сообщения о биохимических различиях между клетками в фазе 2 и фазе 3 отражают
различия в дифференцировке, а не в возрасте»**.
Впоследствии и сам Л. Хейфлик совместно с Т. Матсумурой и
3. Зеррудо [Matsumura et al., 1979] подтвердил отсутствие массовой
гибели клеток в фазе III по его классификации. Авторы этой работы в
В качестве примера приведем следующее определение: "Культуры считались мертвыми, когда они не могли достигнуть сомкнутого монослоя после 4 недель при
еженедельной смене среды" [Goldstein, Singal, 1974, р. 360).
**
Фазы 2 и 3 в данной статье соответствуют классификации Хейфлика, а не Сейма Повидимому, авторы данной статьи, так же как и многие другие исследователи,
просто не знакомы с основополагающими работами Сейма и поэтому его статей не
цитируют.
190
Рис. 54. Первоначальная версия поведения диплоидных фибробластов человека в
культуре согласно работе [Hayflick, Moorhead, 1961]
На рисунке изображено увеличение числа клеток по мере их культивирования (фазы
I и II), за которым следует резкое уменьшение числа клеток (фаза III). Данный рисунок,
впервые опубликованный в 1961 г., постоянно воспроизводился в научных и научнопопулярных изданиях (см.: например: Hayflick, 1966; 1968; 1977; 1982] и приведен в
учебнике по биологии старения [Лэмб, 19801
течение шести месяцев поддерживали "мертвые" культуры, некоторые
из которых за это время в 16 раз увеличили свою численность.
Никаких признаков приближающейся массовой гибели клеток
обнаружить не удалось, хотя срок наблюдения за "мертвыми" культурами иногда превышал даже год (для сравнения отметим, что вся
предшествующая процедура 50 пересевов занимает обычно шестьвосемь месяцев) [Hayflick, 1968].
В результате этих исследований Хейфлик изменил свое представление об ограниченной продолжительности жизни клеточных
культур. Первоначально он излагал свои результаты следующим
образом (рис. 54): "Мы обнаружили, что фибробласты, взятые от
четырехмесячного человеческого эмбриона, удваивались таким
образом в числе в среднем 50 раз (от 40 до 60). Истощив свою
способность к делению, клетки гибли" [Hayflick, 1968, р. 35]. В работе
1979 г. приведена уже принципиально иная схема (рис. 55) и все
излагается иначе: "В ранней фазе III культура еще пролиферирует,
хотя скорость пролиферации снижается. В последней фазе III
клеточная пролиферация очень низка... В течение этого периода не
наблюдалось ни признаков окончательной смерти культуры, ни
спонтанного приобретения неограниченного пролиферативного
потенциала" [Matsumura et al., 1979, р. 332, ЗЗЗ]. Следует подчеркнуть,
что изменение позиции исследователя делает ему честь как ученому,
поскольку цель науки состоит не в отстаивании догматов, а в поиске
истины. Однако достойно сожаления то, что вскрывшаяся истина
191
Рис 55 Новая пересмотренная версия поведения диплоидных фибробластов человека
в культуре согласно [Matsumura et al., 1979]
На рисунке изображено увеличение числа клеток по мере их культивирования (фазы
I и II), за которым следует постепенное снижение темпов их роста (ранняя и поздняя
фазы III) В отличие от первоначальной версии (рис 54), данная, более правильная
схема Хейфликом не рекламировалась и известна лишь узкому кругу специалистов
стала известна лишь очень узкому кругу специалистов, а в таких
ведущих научно-популярных журналах, как "Scientific American",
продолжалась реклама старой легенды, что "в конце концов клетки
претерпевают различные дегенеративные изменения и гибнут"
[Hayflick, 1980, р. 42]. Конечно, удивительно, что пропаганда этого
мифа велась тем же автором, который годом ранее так хорошо
показал его несостоятельность, однако эта загадка выходит за пределы тематики данной книги В то же время становится понятен
механизм канонизации устаревших представлений о пределе клеточных делений в современных томах таких солидных изданий, как,
например, "Британская энциклопедия"
Нетрудно заметить, что с учетом новых фактов феномен Свима—
Хейфлика уже не столь очевидным образом связан с проблемой
ограниченной продолжительности жизни организмов Действительно, массовая гибель клеток могла бы приводить к гибели организма, в
то время как из снижения темпов роста клеточной популяции
ограниченность сроков жизни организма прямо не следует Более
того, снижение митотической активности часто является нормальным физиологическим процессом, связанным с дифференцировкой
клеток Например, при образовании нервной и мышечной ткани клетки
практически теряют способность к делению, и по приведенному выше
определению данные клеточные популяции могли бы быть названы
мертвыми Ясно, однако, что такое определение малоконструктивно,
поскольку речь идет о высокоспециализированных и функционально
Еще более удивительно, что тот же автор три года спустя опять публикует устаревшую схему (рис 54) вместо им же исправленной схемы (рис 55) и вновь излагает
опровергнутую версию, что "после исчезновения митотической активности
культура полностью дегенерирует" [Hayflick, 1982, р 641
192
полноценных клетках Действительно, во многих случаях выполнение высокоспециализированной функции оказывается несовместимым (по крайней мере, одновременно) с клеточным делением
Известно также, что при дифференцировке клеток для переключения
их метаболизма часто бывает необходимо клеточное деление, причем
критический пункт в таком переключении совпадает с синтезом ДНК
ЕГаврилов, Гаврилова, 1978. 1982] Таким образом, наблюдается явное
сходство между счетом делений, происходящим при дифференцировке клеток, и счетом делений, наблюдаемым при их длительном
культивировании Естественным образом возникает гипотеза, что
явление, обнаруженное Свимом и Хейфликом, представляет собой не
какой-то принципиально новый процесс типа старения на клеточном
уровне, а давно известный, хотя и малоизученный процесс дифференцировки клеток, сопровождаемый счетом делений и снижением
ми готической активности [Belletal., 1978; Гаврилов, Гаврилова, 1978.
1982, Гаврилов, Ягужинский. 19781 К сожалению, относительно
фибробластов человека до сих пор нельзя сказать, во что именно они
дифференцируются в культуре Возможно, что недостаточность
культуральной среды по тем или иным факторам сдерживает
нормальную экспрессию нового фенотипа В принципе известно, что
при определенных условиях фибробласты способны дифференцироваться в культуре с образованием неделящихся адипоцитов. однако
экспрессия этого нового фенотипа может сдерживаться при недостатке ряда факторов, например инсулина, биотина и пр Относительно же культур эпидермальных кератиноцитов человека
прямо показано, что снижение темпов роста этих культур сопряжено
с дифференцировкой (кератинизацией) кератиноцитов [Rheinwald,
Green, 1977].
Исходя из гипотезы дифференцировки, можно ожидать, что число
удвоений клеточной популяции вовсе не является фундаментальным
внутренним свойством клеток, как полагает Хейфлик. а может быть
сравнительно легко увеличено с помощью ингибиторов дифференцировки (некоторых факторов роста, опухолевых промоторов и т д )
Действительно, оказалось, что эпидермальный фактор роста увеличивает число удвоений клеточной популяции с 50 до 150 удвоений с
одновременным увеличением "времени жизни" культуры примерно в
три раза При этом увеличение "времени жизни" культуры сопровождалось задержкой проявления многочисленных признаков
терминальной дифференцировки кератиноцитов [Rheinwald, Green,
1977].
Другое предсказание гипотезы дифференцировки состоит в том,
что, вопреки утверждению Хейфлика, постоянный активный рост
клеточных культур может наблюдаться отнюдь не только у трансформированных гетероплоидных клеток, а возможен и для нормаль-
В данном конкретном случае речь идет не о трансформации клеток с помощью опухолевых промоторов а об их использовании в качестве ингибиторов дифференцировки клеток
193
ных диплоидных (если эти клетки не вступают на путь терминальной
дифференцировки). Действительно, оказалось, что нормальные диплоидные эмбриональные клетки мыши. которые в обычных условиях
испытывают кризис роста через 7—10 удвоений популяции, можно
успешно культивировать без всяких признаков приближающегося
кризиса роста, по крайней мере, в течение 200 удвоений популяции,
если только изменить состав культуральной среды (исключить сыворотку крови и добавить ряд компонентов, включая уже упоминавшийся эпидермальный фактор роста). При этом клетки, способные,
по-видимому, к неограниченному размножению, остаются диплоидными и незлокачественными [LooetaL, 1987].
Практически неограниченную способность к пролиферации некоторых нормальных диплоидных клеток можно наблюдать не только в
культуре (in vitro), но и в условиях целостного организма (in vivo).
Этим свойством обладают, например, нормальные клетки имагинальных дисков дрозофилы, если отсутствуют индукторы их дифференцировки [Finch, 1976], а также гемопоэтические стволовые клетки
[Harrison, 1984].
С учетом перечисленных выше фактов приходится признать, что
концепция Вейсманна—Свима—Хейфлика должна быть пересмотрена,
особенно в части тех дополнений, которые были внесены Хейфликом
[Hayflick, 1968]. Хотя данная концепция пользуется огромной популярностью, особенно среди исследователей, далеких от клеточной
биологии [Fries, 1980; Benjamin, 1982], в настоящее время неясно, какое
отношение к продолжительности жизни организмов имеют результаты, полученные при изучении клеточных культур. Не исключено,
что ограниченная способность части клеток к делению довольно
косвенно связана с ограниченной продолжительностью жизни
организмов. В пользу этого вывода свидетельствует также тот факт,
что организмы, построенные в основном из постмитотических клеток
(лабораторные дрозофилы). имеют принципиально те же закономерности распределения продолжительности жизни, что и человек.
Вместе с тем очевидно, что переход части клеток в постмитотическое состояние создает предпосылки к снижению регенераторных
возможностей организма и в конечном итоге к уменьшению числа
функционирующих клеток, что действительно наблюдается с возрастом [Лэмб, 1980; Walton, 1982] Поэтому исследование кинетики
клеточных популяций на разных этапах жизни организма может
иметь важное значение для выяснения механизмов, определяющих
продолжительность жизни. Однако попытки обосновать существование генетически запрограммированного предела продолжительности жизни ссылками на предел клеточных делений нельзя признать
убедительными. Ключ к механизму детерминации продолжительности жизни лежит не столько в выяснении причин снижения темпов
пролиферации, сколько в выяснении причин гибели и повреждения
клеток, а также других структур организма. Показательно, что один
194
из авторов рассматриваемой концепции предела клеточных делений
тем не менее сам отвергает гипотезу генетической программы и
отстаивает гипотезу накопления повреждений (износа) [Hayflick,
1988].
5.7. ТЕОРИЯ НАДЕЖНОСТИ МЕТОДОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА ИЗУЧЕНИЯ
МЕХАНИЗМОВ,
ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ
Как видно из предыдущего изложения, между процессами, ограничивающими продолжительность жизни организмов, и процессами
износа, которые мы наблюдаем в неживой природе, существует
определенная аналогия. Парадокс состоит в том, что эта очевидная и
на первый взгляд даже тривиальная мысль с большим сопротивлением воспринимается многими специалистами-геронтологами и
представителями иных профессий. Возможно, причина такого
сопротивления обусловлена верой в особое совершенство биологических систем и целесообразность всего, что с ними происходит.
Идея программы значительно привлекательнее идеи износа как для
энтузиастов, стремящихся с помощью одного-единственного средства разом решить всю проблему (эликсир молодости), так и для
фаталистов, считающих бессмысленными и даже аморальными все
попытки изменить план, предначертанный Создателем ("на все воля
божья" и "от судьбы не уйдешь").
Казалось бы, в обществе с материалистической и атеистической
ориентацией идея износа должна восприниматься как очевидная.
Однако нам неоднократно приходилось убеждаться, что это не так.
Уже попытки проведения аналогии между выживаемостью людей и
лабораторных дрозофил сопровождались упреками в биологизаторстве, т.е. в сведении высшей формы движения материи (социальной) к более низшей (биологической). Позиция оппонентов может быть
кратко выражена следующей фразой: "Человек стареет и умирает
принципиально иначе, чем животное. Истина эта достаточно банальна..." [Крон, 1980, с. 176]. Попытки же провести аналогию с
разрушением неживых систем воспринимались как крайняя степень
редукционизма — механицизм и покушение на тезис марксистской
философии о несводимости высших форм движения материи к
низшим. Следует, однако, отметить, что в этой борьбе за чистоту
марксизма наши оппоненты оказались "святее папы римского", ибо
сам К. Маркс в "Капитале" писал: "Повреждения, которым подвержены
отдельные части машин и т.д., по природе своей случайны, а потому
также случаен и обусловливаемый ими ремонт. Однако из массы этих
ремонтных работ выделяются два вида, которые имеют более или
менее постоянный характер и приходятся на различные периоды
жизни основного капитала: болезни детства и есравненно более
многочисленные болезни возраста, вышедшего з пределы средней
195
продолжительности жизни. Например, какой бы совершенной
конструкции машина не вступила в процесс производства, при ее
употреблении на практике обнаруживаются недостатки, которые
приходится исправлять дополнительным трудом. С другой стороны,
чем больше вышла она за предел своего среднего возраста,
следовательно, чем больше сказывается действие нормального
изнашивания, чем более изношен и старчески ослаб материал, из
которого она сделана, тем многочисленнее и значительнее становятся ремонтные работы, необходимые для того, чтобы поддержать
существование машины до конца периода средней продолжительности ее жизни; совершенно так же старому человеку, чтобы не
умереть преждевременно, приходиться делать больше расходов на
медицинскую помощь, чем человеку, полному юношеских сил"
(курсив наш. — Л.А. и Н.С.) .
В дальнейшем выяснилось, что форма зависимости интенсивности
отказов от возраста действительно поразительно совпадает для
живых систем [Hutchinson, 1978; Урланис. 19781 и технических устройств [Барлоу, Прошан. 1968; 1984] и качественно соответствует
U-образной кривой. В настоящее время в теории надежности выделяют следующие три периода функционирования систем.
1. Период приработки, называемый также периодом "выжигания"
дефектных элементов Он характеризуется высокой начальной интенсивностью отказов, резко снижающейся со временем. Именно такая же
динамика интенсивности смертности наблюдается в начале жизни
большинства организмов, включая человека. У человека этот период
соответствует возрасту повышенной детской смертности (примерно
О—5 лет) и также в значительной мере обусловлен преимущественной
гибелью ослабленных организмов с врожденными дефектами [Алтухов, 1989];
2. Период нормальной работы, соответствующий возрасту низкой и
приблизительно постоянной интенсивности отказов. Этому периоду
соответствует наблюдаемый у всех живых существ период низкой и
примерно постоянной интенсивности смертности. Для человека этот
период оказывается довольно коротким и кончается слишком рано
(10—15 лет).
3 Период старения, проявляющийся в неуклонном росте интенсивности отказов с возрастом. Этому периоду соответствует период
роста интенсивности смертности, который также характерен для
большинства живых существ, и описывается обычно законом Гомперца—Мейкема. Именно анализу смертности в этом периоде и была
посвящена основная часть данной книги. Для человека 'период
старения находится в пределах примерно от 20 до 100 лет.
Итак. существует удивительное сходство в распределении времен
жизни технических и биологических систем Это сходство еще более
усиливается, если учесть, что в самых экстремальных возрастах, по-
* Маркс К.. Энгельс Ф Соч Т 24 С 196
196
видимому, существует еще один период, общий для технических и
биологических систем. Этот период насыщения отказов соответствует очень высокой и примерно постоянной интенсивности о'> казов
(смертности). Существование такого периода, очевидно, связало с
тем. что в условиях высокой смертности скорость выбраковки
дефектных организмов становится соизмеримой со скоростью их
накопления, в результате устанавливается стационарное распределение организмов по числу дефектов, и интенсивность смертности
становится постоянной. Для человека этот период наблюдается в
возрастах, превышающих 100 лет [Гаврилов, 1980; Economos, 1983).
Нетрудно заметить, что приведенная возрастная периодизация
стадий разрушения живых и неживых систем удивительным образом
совпадает. Это внешнее сходство наблюдаемых закономерностей
наводит на мысль о возможности существования и определенного
внутреннего сходства процессов, ограничивающих время жизни технических и биологических систем.
К сожалению, эта простая и в общем-то очевидная идея долгое
время не имела своего научного развития. Отчасти это было связано
<< Пред. стр. 30 (из 41) След. >>
Список литературы по разделу