<< Пред. стр. 16 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу
Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют
камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается
в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги
закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить
возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной
фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от
поверхности подвижной фазы на 2-3 см. В остальном приемы работы
при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от
описанных выше.
Обработка хроматограмм
По окончании хроматографирования пятна веществ на
хроматограммах открывают при просмотре в видимом или
ультрафиолетовом свете. При необходимости хроматограмму
предварительно обрабатывают (погружением или опрыскиванием)
раствором реактива, дающего цветные реакции с хроматографируемыми
веществами.
В отдельных случаях пятна обнаруживают путем установления
факта угнетения или стимулирования роста бактерий в
непосредственной близости от пятна при помещении хроматограммы на
инокулированную среду.
Для обнаруженных пятен вычисляют величину Rf по уравнению:
а
Rf = ---,
b
где а - расстояние от линии старта до центра пятна; b -
расстояние от линии старта до фронта подвижной фазы.
ХРОМАТОГРАФИЯ В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА
Хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной
фазы в тонком слое сорбента (носителя), нанесенном на инертную
поверхность, называется хроматографией в тонком слое сорбента.
Неподвижной фазой в данном случае являются сам твердый сорбент
либо вещества, предварительно на него нанесенные. Механизм
хроматографического разделения может быть различным, но чаще всего
он является адсорбционным. Перемещение подвижной фазы в слое
сорбента с целью упрощения аппаратурного оформления процесса
хроматографирования, как правило, осуществляется восходящим
методом, т.е. под действием капиллярных сил.
По сравнению с хроматографией на бумаге хроматография в тонком
слое сорбента имеет ряд преимуществ, основными из которых
являются: высокая скорость процесса хроматографирования,
возможность использования в качестве неподвижных фаз (носителей)
разнообразных сорбентов, а также сильнокислых, щелочных или иных
взаимодействующих с бумагой подвижных фаз и жестких методов
открытия пятен путем обработки хроматограмм агрессивными
веществами при повышенных температурах.
Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки
с закрепленным слоем сорбента, выпускаемые промышленностью, и
пластинки со специально приготовленным тонким слоем сорбента.
Приготовление пластинок с тонким слоем сорбента
Обычно слой сорбента (чаще всего силикагеля или окиси алюминия
квалификации "для хроматографии") с размером частиц 150-200 меш
(сито N 61; ГОСТ 4403-67) наносят на стеклянные матовые пластинки
подходящего размера. Для закрепления слоя применяют добавки
сульфата кальция СаSО4 х 1/2H2О (гипса) или крахмала. Нанесение
слоя может осуществляться следующими способами.
Способ 1. Для получения закрепленного слоя сорбента толщиной
около 200-300 мкм с площадью 100 кв. см 2 г силикагеля или окиси
алюминия (150-200 меш) и 0,1 г гипса растирают с 5 мл воды в
фарфоровой ступке до образования однородной жидкой массы, которую
немедленно выливают на горизонтально расположенные, тщательно
вымытые стеклянные пластинки выбранного размера. Массу
разравнивают шпателем и полученный таким образом слой сушат при
комнатной температуре, предохраняя от возможных механических и
химических загрязнений. Если в частной статье не указано иначе,
пластинки активируют в сушильном шкафу при 120 град. С в течение 1
ч. Готовые пластинки с тонким слоем сорбента хранят в эксикаторе
над силикагелем или хлоридом кальция.
Примечание. Для получения слоя толщиной около 100-150 мкм
нанесение указанного выше количества массы проводят на пластинки с
общей площадью 200 кв. см.
Способ 2. Для получения закрепленного слоя сорбента толщиной в
несколько десятков микрон 2-3 г гипса растирают в ступке в 40 мл
метилового спирта. В суспензию гипса, продолжая растирание,
добавляют 40 г силикагеля или окиси алюминия (200-400 меш) и 140
мл хлороформа. Полученную суспензию сорбента из расчета 4,5 мл на
100 кв. см поверхности выливают на тщательно вымытые сухие
стеклянные пластинки, расположенные горизонтально. Пластинки, если
в частной статье не указано иначе, сушат на воздухе в течение
10-15 мин.
Суспензии сорбентов сохраняют в колбах с притертой пробкой,
тщательно взбалтывая перед употреблением.
Способ 3. Для приготовления незакрепленного слоя сорбента
последний насыпают на горизонтально расположенное матовое стекло и
разравнивают до получения слоя толщиной 1-2 мм валиком из
нержавеющей стали диаметром 6-8 мм с цилиндрическими утолщениями
на обоих концах. Диаметр утолщения должен превышать на 2-4 мм
диаметр валика (соответственно предполагаемой толщине слоя). Длина
средней части валика должна быть на 20-30 мм меньше ширины стекла,
на которое наносится слой сорбента. Вместо металлического валика
можно использовать стеклянную палочку с надетыми на концы кусками
резиновой или полиэтиленовой трубки, имеющей подходящую толщину
стенки и диаметр.
Методика хроматографического разделения
Для разделения веществ методом хроматографии в тонком слое
сорбента используют хроматографические камеры подходящего размера.
На дно камеры наливают подвижную фазу в количестве, достаточном
для образования слоя глубиной 0,5 см, камеру закрывают и
выдерживают для насыщения парами растворителей 30-60 мин. Стенки
камеры для полноты насыщения можно обкладывать фильтровальной
бумагой. Анализируемый раствор наносят микропипеткой или
микрошприцем на линию старта, проведенную на расстоянии 2-3 см от
нижнего края пластинки, так, чтобы пятна образцов отстояли друг от
друга и от краев слоя сорбента не менее чем на 2 см. Нежелательное
растекание пятен анализируемых проб при нанесении предотвращают
путем периодического подсушивания.
После окончательного высыхания нанесенных на линию старта
пятен пластинку вносят в камеру. Нижний край пластинки при этом
должен погрузиться в подвижную фазу на 0,5-1 см.
Пластинки с закрепленным слоем сорбента располагают под углом
60-90 град., а пластинки с незакрепленным слоем сорбента - под
углом 15-20 град. к поверхности жидкости. Когда фронт растворителя
пройдет 10-15 см, пластинку вынимают, отмечают положение фронта и
открывают пятна хроматографировавшихся веществ, как указано в
соответствующей частной статье. Опрыскивание незакрепленного слоя
сорбента проводят немедленно после завершения процесса
хроматографирования, не допуская высыхания хроматограммы.
Результаты хроматографирования оценивают, как описано в разделе
"Хроматография на бумаге" настоящей статьи.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ПРИЕМЫ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ
И В ТОНКОМ СЛОЕ СОРБЕНТА
При необходимости достигнуть лучшего разделения анализируемых
смесей веществ методами хроматографии на бумаге и в тонком слое
сорбента можно применять специальные приемы хроматографирования -
повторное и двухмерное.
Повторное хроматографирование заключается в том, что после
завершения первого хроматографирования пластинку или бумагу
высушивают и подвергают повторному пропусканию той же или иной
подвижной фазы в том же направлении.
При двухмерном хроматографировании повторное пропускание той
же или иной подвижной фазы осуществляют в направлении,
перпендикулярном направлению первоначального движения. Двухмерное
хроматографирование целесообразно осуществлять на квадратных
пластинках или листах бумаги. Анализируемая проба при этом
наносится на диагональ квадрата вблизи одного из его углов.
Двухмерную хроматографию с использованием одной и той же
подвижной фазы часто применяют для проверки устойчивости веществ в
условиях хроматографирования. Устойчивые вещества образуют пятна,
лежащие только на диагонали пластинки или листа бумаги.
Газовая хроматография
Газовая хроматография - это хроматография, в которой подвижная
фаза находится в состоянии газа или пара. В фармацевтическом
анализе находит применение как газожидкостная, так и
газоадсорбционная хроматография. В газожидкостной хроматографии
неподвижной фазой служит жидкость, нанесенная на твердый носитель,
в газоадсорбционной хроматографии неподвижной фазой служит твердый
адсорбент. В дальнейшем твердый носитель с нанесенной на него
жидкой фазой и адсорбент будут обозначаться термином "сорбент".
Анализируемые вещества вводятся в поток газа-носителя, испаряются
и в парообразном состоянии проходят через колонку с сорбентом,
распределяясь в результате многократного повторения актов сорбции
и десорбции между газовой и жидкой или газовой и твердой фазами.
Отношение количества вещества в неподвижной фазе к количеству
вещества в подвижной фазе представляет собой коэффициент
распределения, который, в частности, зависит от природы
растворенного вещества и количества неподвижной фазы.
Разделенные вещества элюируются из хроматографической колонки
потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на
хроматограмме в виде пиков. Полученная хроматограмма служит
основой для качественного и количественного анализа смеси веществ.
Метод газовой хроматографии применяется для анализа летучих
веществ либо веществ, которые могут быть переведены в летучие с
помощью специальных приемов и устройств в парообразное состояние.
Газовый хроматограф состоит из систем: измерения и
регулирования скорости потока газа - носителя и вспомогательных
газов (для детектора); ввода пробы анализируемого образца;
газохроматографических колонок, а также систем детектирования,
регистрации (и обработки) хроматографической информации;
термостатирования и контроля температуры колонок, детектора и
системы ввода проб.
Газ - носитель поступает в хроматограф из баллона через
редуктор. Обычно в качестве газа - носителя применяют гелий, азот,
аргон. При работе с детектором по теплопроводности
предпочтительнее гелий, так как он обеспечивает максимальную
чувствительность детектора благодаря высокой теплопроводности по
сравнению с большинством органических соединений.
Система ввода пробы анализируемого образца обычно состоит из
испарителя и мембраны из термостойкой резины, которая
прокалывается при вводе пробы. Некоторые хроматографы снабжены
также специальными дозаторами для ввода газообразных и твердых
веществ. Анализируемые вещества поступают в колонку в парообразном
состоянии, поэтому температура испарителя должна обеспечить
возможно быстрое испарение компонентов пробы. Жидкие пробы вводят
в хроматограф микрошприцем. Объем вводимой пробы зависит от типа
детектора, количества неподвижной жидкой фазы и диаметра колонки.
Обычно для насадочной аналитической колонки объем пробы жидкости
составляет 0,1-1 мкл, а газа - от 0,5 до 5 мл.
Газохроматографическая колонка представляет собой прямую,
спиральную или U-образную трубку, обычно изготовленную из
нержавеющей стали или стекла с внутренним диаметром от 0,6 до 5
мм. Наиболее часто используются колонки длиной 1-3 м.
Эффективность газохроматографической колонки n,
характеризующая степень расширения зоны определяемого вещества на
выходе газохроматографической колонки, определяется по формуле:
Љ l Ї2
n = 5,545 Ј------ Ј ,
Ј"ми "Ј
ђ 0,5 ‰
где l - время удерживания вещества, выраженное в единицах
длины диаграммной ленты (например, мм); "ми " - ширина
0,5
хроматографического пика, измеренная на половине его высоты и
выраженная в тех же единицах, что и расстояние удерживания.
Степень газохроматографического разделения веществ R
определяют по формуле:
"ДЕЛЬТА"l
R = ------------------------- ,
"ми " + "ми "
0,5(1) 0,5 (2)
где "ДЕЛЬТА"l - разность расстояний времен удерживания
разделяемых веществ 1 и 2.
Температура колонки должна обеспечивать оптимальное разделение
компонентов смеси при достаточно коротком времени анализа.
Для анализа смесей с широким диапазоном температур кипения
компонентов целесообразно применять газовую хроматографию с
программированием температуры либо газовую хроматографию с
программированием расхода газа - носителя, либо сочетание этих
видов газовой хроматографии.
Твердый носитель служит для удержания тонкой равномерной
пленки неподвижной жидкой фазы, его поверхность должна
обеспечивать достаточное разделение. Он должен иметь достаточную
механическую прочность и быть инертным как по отношению к
анализируемым веществам, так и к жидкой фазе. В качестве твердых
носителей применяют материалы на основе кремнезема - диатомита или
кизельгура (например, сферохромы, хроматоны, хезосорбы, целиты);
фторуглеродных полимеров (например, тефлон, полихром); полистирола
и сополимеров стирола и дивинилбензола (полисорбы). В отдельных
случаях в качестве твердых носителей могут использоваться
кристаллы некоторых солей (например, хлорида натрия), стеклянные
шарики и графитированная сажа (карбохром). Наиболее часто
используемый размер частиц твердого носителя от 0,1 до 0,5 мм. В
зависимости от задач анализа свойства носителей можно изменять
обработкой их кислотами или щелочами, а также силанизированием.
Неподвижная жидкая фаза представляет собой, как правило,
высококипящую жидкость. В качестве жидкой фазы обычно применяют:
индивидуальные углеводороды или их смеси, например вазелиновое
масло, апиезоны; силоксановые полимеры без функциональных групп;
сложные эфиры и полиэфиры; простые эфиры; полифенилы; амиды;
силоксановые полимеры с привитыми нитрильными или
галогеналкильными группами; одно- и многоатомные спирты;
полигликоли; амины; жирные кислоты и т. д.
Перед работой с новой колонкой ее следует кондиционировать при
температуре, как правило, на 10-30 град. С превышающей рабочую
температуру, в токе газа-носителя в течение нескольких часов.
Важно следить за тем, чтобы температура термостата колонки не
превышала температурного предела применения данной фазы.
Как правило, неподвижная жидкая фаза наносится на твердый
носитель в количестве 1-20% от его массы, наиболее часто
используются колонки с содержанием жидкой фазы до 5-10% от массы
твердого носителя. Нанесение жидкой фазы на носитель
осуществляется из ее раствора в подходящем растворителе.
Существует несколько методов нанесения жидкой фазы, из которых
предпочтительнее пользоваться наиболее воспроизводимыми методами
упаривания раствора при перемешивании в фарфоровой чашке или
удаления растворителя в ротационном вакуумном испарителе.
Для обеспечения высокой эффективности разделения применяют
капиллярную газовую хроматографию, в которой неподвижная жидкая
фаза нанесена в виде тонкой пленки непосредственно на внутреннюю
поверхность капилляра. Длина капиллярных колонок обычно составляет
от 10 до 100 м, внутренний диаметр - от 0,1 до 0,6 мм.
Автоматическая система измерения, регистрации и обработки
хроматографической информации включает в себя детектор,
электронные устройства усиления, самопишущий измерительный прибор
и интегратор.
Наиболее часто применяют детектор по теплопроводности и
пламенно - ионизационный. Действие детектора по теплопроводности
основано на изменении теплопроводности газа - носителя в
присутствии других веществ. Он характеризуется большой
универсальностью, так как чувствителен практически ко всем летучим
органическим соединениям. Действие более чувствительного пламенно
- ионизационного детектора основано на измерении тока насыщения
ионизированной газовой смеси в зависимости от ее состава. Детектор
чувствителен к органическим соединениям и нечувствителен к парам
воды. Кроме этих двух детекторов, в газохроматографическом анализе
лекарственных веществ, особенно если требуется повышенная
чувствительность определения, можно использовать селективные
детекторы, такие, как термоионный и электронозахватный.
Системы термостатирования и контроля температуры колонок,
детектора, узла ввода пробы предназначены для обеспечения
необходимых температурных режимов анализа.
Качественный анализ. Наиболее часто используемыми методами
качественного анализа, применяемыми для идентификации
<< Пред. стр. 16 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу