<< Пред. стр. 13 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
форез во втором направлении ведут в течение 5 ч при силе тока
25 мА на пластину. Метод удобен тем, что между разделениями
в первом и втором направлениях нет надобности вымачивать
гель, так как буфер геля первого направления-тот же, что и у
формирующего геля второго направления. Результаты электро-
фореза представлены на рис. 24.
В другой работе [Howard, Traut, 1973] разделение рибосо-
мальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в
4%-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-
боратном буфере, рН 8,7. При этом рН часть белков рибосом
оказывается заряженной отрицательно, а другая часть-поло-
жительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной
1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его
на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвер-
девания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси моно-
меров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в
интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ
агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавлен-
ном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряже-
ния миграция белков шла в обе стороны-к катоду и аноду.
Во втором направлении разделение белков вели по их размерам,
но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину
еще. более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (T=
=18,25; С=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кисло-
те, титрованной КОН до рН 4,5, также с добавлением 6 М моче-
вины. В этом случае все белки были заряжены положительно и
мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя ис-
пользовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля
79
вдоль его продольной оси вырезали плоскую полоску, вымачи-
вали ее в 0,013 М К-ацетатном буфере (рН 5,2) с 8 М мочеви-
ной. Полоску зажимали между стеклянными пластинками фор-
мы и прямо на нее заливали раствор мономеров рабочего геля.
Катионом верхнего электродного буфера служил глицин
(~0,19 М), титрованный уксусной кислотой до рН 4. Таким об-
разом, осуществлялась система ступенчатого электрофореза,
где в качестве быстрого иона выступал К+, а медленного-гли-
цин. Отметим, что в системе Орнстейна и Дэвиса глицин фигу-
рировал в качестве медленного аниона, а здесь он служил ка-
тионом. Возможность такого двоякого использования вытекает
из цвиттерионной природы глицина. Формирующим гелем в этой
системе служила сама полоска, вырезанная из геля первого на-
правления. Аналогичная система двумерного электрофореза ри-
босомальных белков описана и в другой работе [Sherton, Wool,
1974]. .
Гамильтон [Hamilton, 1974] при разделении рибосомальных
белков по заряду в первом направлении использовал ступенча-
тый электрофорез в кислом буфере (7,5%-ный ПААГ с рН 4,6-
в рабочем геле, 2,5%-ный ПААГ с рН 6,5-в формирующем).
Во втором направлении он вел разделение белков в комплексе
с ДДС-Na в 15%-ном ПААГ. Обработку детергентом он осуще-
ствлял, вымачивая извлеченный из трубки гель первого направ-
ления в 1%-ном растворе детергента. В работе были определены
молекулярные массы рибосомальных белков (путем сравнения
с маркерами во втором направлении) и оценены их количествен-
ные соотношения в составе малой субъединицы рибосом печени
крысы.
Интересный подход к фракционированию рибосомальных
белков был использован в недавней работе [Hoffman, Dowben,
1978b]. При разделении в первом направлении авторы исполь-
зовали различие в протяженности гидрофобных участков по-
верхности у разных белков рибосомы. Оно проявлялось в степе-
ни связывания этих белков с мицеллами Тритона Х-100, который
вводили при полимеризации геля до концентрации 0,15%. Ком-
плексы белков с Тритоном Х-100 разделяли по размеру в 8%-ном
ПААГ в присутствии 2 М мочевины. Концентрация детергента
была оптимальной; при меньших концентрациях он мало влияет
на подвижность белков, а при больших, как уже отмечалось,
препятствует последующей обработке ДДС-Na, который в этой
работе использовали при фракционировании белков во втором
направлении. Подробнее об использовании Тритона Х-100 в этих
целях будет сказано в следующем разделе.
В качестве лидирующего красителя при фракционировании
рибосомальных белков в кислом буфере недавно было предло-
жено использовать FeCl3. Ионы Fe3+ в присутствии уксусной
кислоты образуют стойкие комплексы коричневого цвета, миг-
рирующие к катоду впереди самого мелкого из рибосомальных
белков [Bernabeu et al., 1979].
80
Рис. 25. Сочетание хроматографии с электрофорезом в геле агарозы fBloom,
Anderson, 1979]
1 - хроматографическая колонка; 2-обессоливавие в "биофибрах", 3 - перистальтиче-
ский насос; 4- раствор агарозы; 5 - нагреватели; 6- трубка для электрофореза; 7-
охлаждающая смесь
Рис. 26. Разделение гистонов сочетанием хроматографии на оксиапатите (на-
правление I) и электрофореза в градиенте концентрации ПААГ (направление
II) в присутствии ДДС-Na [Bloom, Anderson, 1979]
Двумерным электрофорезом часто разделяют и другие ще-
лочные белки. Например, факторы инициации белкового синте-
за из ретикулоцитов образуют много пятен при фракционирова-
нии каждого из них в первом направлении по заряду в кислой
мочевине, а во втором-по размерам ступенчатым электрофо-
резом в системе Лэммли [Floyd et al., 1979].
Двумерный электрофорез белков хроматина описан Бакае-
вым и соавторами (Bakayev et al., 1978]. В первом направлении
хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фрак-
ционировали в 5%-ном ПААГ и буфере низкой ионной силы
(0,01 М ТЭА-НС1, рН 7,6) на олиго-, моно- и субнуклеосомы за
счет заряда входящей в их состав ДНК, как это было описано
выше. Во втором направлении авторы использовали в одном
случае фракционирование белков хроматина по размеру в си-
стеме Лэммли после вымачивания геля первого направления в
1%-ном растворе ДДС-Na. Детергент обеспечивал и диссоциа-
цию белков от ДНК. В другом варианте разделения диссоциа-
цию осуществляли с помощью цетавлона, а электрофорез во
втором направлении вели в кислой мочевине. Во втором вариан-
те хорошо выявлялась группа быстро мигрирующих негистоно-
•вых белков хроматина (HMG-белков). Для анализа этих белков
авторы экстрагировали их 0,35 М раствором Nad, очищали
осаждением ТХУ (2-20%) и разделяли двумерным электрофо-
резом, причем в первом направлении использовали фракциони-
рование по заряду в кислой мочевине, а во втором - разделение
по размерам в 15%-ном ПААГ после обработки ДДС-Na.
81
Двумерный электрофорез субъединиц различных РНК-поли-
мераз в уже цитированной работе д'Алессио и соавторов про-
водили в двух вариантах разделения белков по заряду в первом
направлении. В обоих вариантах использовали ступенчатую си-
стему электрофореза: в одном-с кислым буфером (рН 4,3) для
рабочего геля, в другом-со щелочным (рН 9,4). Во втором на-
правлении в обоих случаях белки фракционировали по их раз-
мерам после обработки ДДС-Na в системе Лэммли [d'Alessio et
al., 1979].
Мы не случайно в качестве примеров двумерного электрофо-
реза рассмотрели только случаи фракционирования щелочных
белков. Для кислых белков все другие варианты двумерного
фракционирования вытеснила уже упоминавшаяся система
О'Фарелла. Щелочные белки до последнего времени плохо раз-
делялись в этой системе, однако недавно была предложена ее
модификация, позволяющая успешно вести разделение и щелоч-
ных белков.
Блум и Андерсон предложили оригинальный метод двумер-
ного разделения белков [Bloom, Anderson, 1979]. Собственно,
электрофорез в нем используется только во втором направле-
нии. Фракционирование белков в первом "направлении" осуще-
ствляется на хроматографической колонке (рис. 25). Элюат с
колонки обессоливают, пропуская его через "биофибры", погру-
женные в 10%-ный раствор ДДС-Na с 1% ?-меркаптоэтанола.
Затем его подогревают до 96° и по каплям смешивают с раство-
ром расплавленной при такой же температуре агарозы. Оба
раствора подают одним двухканальным перистальтическим на-
сосом, и горячая смесь постепенно заполняет погруженную в лед
трубку. Таким образом, в трубке полимеризуется элюат с хро-
матографической колонки, т. е. по длине геля располагаются
белковые зоны в той последовательности, как они выходят из
колонки. Затем гель извлекают из трубки и накладывают на
пластину ПААГ, заливают расплавленной агарозой и ведут
электрофорез в системе Лэммли. В частности, авторы элюирова-
ли гистоны с колонки оксиапатита линейным градиентом кон-
центрации NaCl (0-1,5 М) в 1 мМ Na-фосфатном буфере
(рН 6) с 6 М мочевиной. Гистоны выходили, не разделившись,
а лишь растянувшись по элюату. Во втором направлении ис-
пользовали электрофорез в присутствии ДДС-Na в градиенте
пористости ПААГ (8-25%). На пластине гистоны оказались
прекрасно отделенными друг от друга (рис. 26). В частности,
гистоны Н2А и Н2В далеко отошли от НЗ благодаря значитель-
ному различию в их сродстве к оксиапатиту.
Исходный препарат в такой постановке опыта может быть
и не элюатом с колонки, а реакционной смесью, в которой со
временем происходят изменения белкового состава, например
в результате протеолиза. Маркерные белки с известной молеку-
лярной массой можно прикалывать при заполнении трубки так,
что их положение по ее длине будет заведомо определенным.
82
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ТРИТОНА Х-100 И ЦЕТАВЛОНА
Тритон Х-100
Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, пло-
хо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 за-
частую улучшает их растворимость и, .к тому же, в отличие от
мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются
вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их
биологическая активность.
Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли бел-
ки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в
1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали
с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном
буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на
формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с бел-
ком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость
белка, однако разделение полос оказывается более надежным,
если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксиро-
вании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, ко-
торый приходится дольше отмывать.
Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использо-
вать не только для растворения, но и для фракционирования
белков. Характер комплекса и количество связавшегося с бел-
ком детергента зависят от протяженности гидрофобного участ-
ка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут
связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на мо-
лекулу (родопсин-до 70). Это дает прирост эффективной мо-
лекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон
(молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост
легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.
В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] бел-
ки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентра-
ции 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5%
(?-мсркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли
Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков
из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос
в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно
вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в опреде-
ленной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона
Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого про-
цесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и
мочевины для данного типа белков подбирают эксперименталь-
но. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного
ПААГ (С = 0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксус-
ной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100.
Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ
со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-
83
ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иног-
да, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содер-
жащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним прихо-
дится предварительно заполимеризовать "пробку" обычного
ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за
счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внима-
ние следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его
сначала в течение 3-4 ч при напряжении 240 В до постоянства
силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в элек-
тродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кисло-
ту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл
протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мо-
чевиной. Возобновляли преэлектрофорез еще на 45 мин, поме-
няв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после
этого вносили белковые препараты и вели электрофорез при по-
стоянном напряжении 100 В в течение суток при той же поляр-
ности напряжения (белки мигрируют к катоду).
В рассматриваемой работе удалось наблюдать значитель-
ные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со-
li и даже мутантов одного штамма. Было использовано и дву-
мерное разделение. Полоски геля после электрофореза в при-
сутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сна-
чала в 1,5 М Трис-НСl (рН 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М
Трис-НСl (рН 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После это-
го их переносили на вторую пластину для ступенчатого электро-
фореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез
позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним
только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочеви-
ны или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.
Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в
5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочеви-
ной, удается также хорошо разделять разные формы а- и {?-це-
пей глобина [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатура-
цию белков в этом случае проводили в присутствии 5% (?-мер-
каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять
гидрофобные свойства белка.
Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле,
полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона
Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также пре-
электрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином.
В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гисто-
нов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфе-
ра геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100 + 4 М
мочевины.
Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100
использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль-
ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, по-
этому при электрофорезе в первом направлении благодаря ком-
плексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-
84
мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны
мигрируют вместе с относительно более крупными белками ри-
босом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%-
ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить раз-
личие истинных молекулярных масс этих двух типов белков.
ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и от-
носительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,.
отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].
Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий
комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направле-
ний, использовался довольно -часто [Hamana, Iwai, 1976; Gar-
nird, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977].
В последние годы описано применение в тех же целях других,
сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после
обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направ-
ления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в
0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы
"Sigma") и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А
печени и других органов мыши при этом удалось разделить на
два компонента, гистон НЗ-на три или четыре; в ряде случа-
ев расщеплялся и гистон HI. В другой работе [Allis et al., 1979]
был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо-
ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М
мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1+
<< Пред. стр. 13 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу