<< Пред. стр. 16 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
(в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют
до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (рН
8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют 1/15 объема 10%-ного. раствора
данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, ин-
кубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный
данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутно-
желтую суспензию, тем не менее Данзилирование в ней происхо-
дит. Раствор просветляется после добавления 1/15 объема ???мер?
каптоэтанола и дополнительной инкубации в течение 15 мин.
Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхло-
рида.
Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки под-
вергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные про-
дукты данзилирования быстро отделяются от белков и уходят
вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения
белков под контролем данзилированных аликвот. При этом ис-
пользуется электрофоретическая элюция белковых полос из ге-
ля. Описан также пептидный анализ разделенных белков элек-
трофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабоче-
го геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков
под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом
[Stephens, 1975].
Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наиме-
нованием "Fluram") - желтовато-белый порошок, хорошо раст-
воримый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетонитриле. Хра-
нить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, осо-
бенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными
аминами (концевыми аминогруппами, ?-NH2-группами лизина)
98
в водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие
продукты в соответствии с представленной ниже схемой.
Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции
имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и макси-
мум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюо-
ресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресци-
руют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не
создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт мож-
но не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При ис-
пользовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов
перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит до-
полнительный отрицательный заряд (за счет образующегося
карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность
окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных
ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.
В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали
для окраски белков после их двумерного фракционирования влектрофокуси-
ровкой и электрофорезом по методу 0'Фаррела. Белки фиксировали в пласти-
не геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% ме-
танола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюо-
ресцамином). Гель споласкивали в 7%-ной уксусной кислоте, помещали на
1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2ч - в 0,04 М раствор борной кисло-
ты в ДМСО, титрованный NaOH до рН 10. Затем добавляли равный объем
раствора флюоресцамина (0,5 мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение
8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при ос-
вещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.
Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способ-
ность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствитель-
ность и разрешающая способность окраски флюоресцамином
примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок за-
висимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количе-
ства белка больше - вплоть до 7 мкг белка на 1 см2 в пятне или полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не да-
лее, чем для 3 мг/см2.
Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом
было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974].
Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации
99
0,5-1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфатном буфере (рН 8,5) с 5%
ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора
флюоресцамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей
очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза.
Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски
флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для
контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично исполь-
зовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофо-
резом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано исполь-
зование для окрашивания белков перед электрофорезом родст-
венного флюоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-ди-
фенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин,
этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно
флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе
не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.
В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой
дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и
абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирую-
щего продукта - при 390 нм, флюоресценции - при 745 нм.
Реакция идет лучше в щелочной среде (рН 9,5.) Продукт устой-
чив в интервале рН 2-10. Интенсивность флюоресценции-в
2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь не-
значительно уменьшается в случае предварительной обработки
белка ДДС-Na и ?-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствитель-
ность метода очень высока: по утверждению авторов, им удава-
лось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличие от
флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких ме-
сяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными
цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окраши-
вание ведут в 0,01 М боратном буфере (рН 9,5), энергично пере-
мешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.
Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для
окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделе-
нием электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды,
обработанные ДДС-Na и р-меркаптоэтанолом, окрашивали в
0,1 М Li-боратном буфере (рН 9,5), добавляя к ним в пятикрат-
ном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.
100
Ортофталевый альдегид (ОФА) в присутствии ?-меркапто-
этанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов,
давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с при-
веденной ниже схемой.
ОФА растворим в воде, но лучше-в метаноле, этаноле, аце-
тоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при
рН 8-9. При использовании ОФА его сначала растворяют в
одном из перечисленных органических растворителей, а потом
смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и
значения рН. Максимум возбуждения флюоресцирующего про-
дукта - при 340 нм, флюоресценции - при 445 нм. Раствор са-
мого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода - выше,
чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных
продуктов выражен сильнее.
Использование ОФА для окрашивания комплексов белок-
ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-
dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфат-
ном буфере (рН 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% ?-меркап-
тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали
при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда
добавляли 1/5 объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и вы-
держивали в темноте 2-3 ч.
Локализация ферментов после электрофореза
В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях
(без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности.
Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с
помощью специфических реакций, дающих окрашенные продук-
ты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофак-
торов, необходимых для протекания определенной ферментатив-
ной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих
окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить
быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их
полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует,
его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продви-
жением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией
фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять,
каково будет поведение субстрата в электрическом поле во вре-
мя электрофореза.
101
Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом
("индикаторном") геле на основе агарозы или импрегнировать
ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза
белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность наклады-
вают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют
в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей
цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикатор-
ных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих
случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с
дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в каче-
стве заключительного этапа реакции воспользоваться нефермен-
тативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана,.
что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продук-
ты (схема реакции приведена ниже),
В качестве примера можно назвать часто употребляющийся
препарат "Methyl thiazolyl blue" (MTT) или еще более сложное
соединение "Nitro blue tetrazolium" (NBT). В окисленном виде
обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает сине-
пурпурную, а вторая-иссиня-черную окраску. Реакция восста-
новления красителей ускоряется в присутствии промежуточного
переносчика электронов "Phenazine methosulfate" (PMS) или
нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели
фирмой "Boehringer" под названием "Meldolablue" [Turner,
Hopkinson, 1979].
102
Для обнаружения в геле протеолитических ферментов пред-
ложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофо-
реза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе
цитохрома с в буфере с рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и
1,7 мМ CaCl2. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диф-
фундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет
по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром с,
остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне
[Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на
гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для
удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После
трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотоплен-
ке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушаю-
щих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].
Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него
вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы
для своего действия нуждаются в ионах Mg2+, Са2+ или Zn2+, то
в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофоре-
за. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеино-
вых кислот-бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается
весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где
нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нук-
леаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во
время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием
ДДС-Na из геля вымывают.
Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно
выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Мож-
но также исследовать оптимизацию условий, необходимых для
активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробо-
вать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью
кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз.
Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяс-
нения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окра-
шивание бромистым этидием в описанных опытах можно заме-
нить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризо-
вать меченную 32Р нуклеиновую кислоту или синтетический
полинуклеотид [Iborra et al., 1979].
Выше указывалось, что для локализации ферментов по их
активности электрофорез желательно проводить в условиях,
исключающих возможность денатурации. Однако в недавней ра-
боте [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку цело-
го ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электро-
форезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки
их детергентом при повышенной температуре. Денатурация ока-
зывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na от-
мывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в
течение 1-2 ч в 0,04 М Трис-буфере, рН 7,6. Ферментативная
активность в ряде случаев восстанавливается.
103
По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермен-
та имеет смысл денатурировать его кратковременной обработ-
кой 6 М гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при раз-
бавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная
конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке
ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих
несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предваритель-
ную обработку (?-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исклю-
чить. Впрочем, то же самое относится и к одноцепочечному трип-
сину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S-S-связей в
нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие
более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.
В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофо-
реза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе
конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой,
например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979],
или радиоактивно меченного введением 125I [Horst et al., 1980].
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na
Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы по-
зволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в при-
сутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее
простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0-4°.
При боковом освещении на фоне черного бархата непрозрачные
белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачно-
го геля. По-видимому, комплексы белок-ДДС-Na служат ядра-
ми конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, раство-
римость которого очень сильно зависит от температуры. При
отргревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чув-
ствительности этого метода - 0,2 мкг белка на 1 мм2 площади
пятна [Wallace et al., 1974]. Попутно отметим недавно описан-
ный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержа-
щем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5-10 мин при -70°.
В местах расположения белковых зон за счет связывания части
свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая не-
прозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрач-
ным [Bachrach, 1981].
Недавно [Higgins, Dahmus, 1979] было предложено после
окончания электрофореза вымачивать гель в течение 1 ч при 25°
в 10-12 объемах 4 М раствора ацетата натрия. Свободный
ДДС-Na, который в концентрации 0,1% присутствует в геле, вы-
падает в осадок - гель становится белым и непрозрачным. Бел-
ки, связанные с ДДС-Na, при этом не осаждаются. Их прозрач-
ные полосы хорошо видны на темном фоне при освещении геля
сбоку и снизу. Чувствительность метода - 0,1 мкг белка на 1 мм2
площади пятна или полосы.
104
ЭЛЮЦИЯ БЕЛКОВ ИЗ ГЕЛЯ
Простейший прием элюции состоит в извлечении белка из по-
лоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного
времени при 37-40°. Этот прием пригоден как для свободных
белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения
диффузии белков из геля последний измельчают, например рас-
тирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элю-
ции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий
буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда
электрофорез белка проводили без него. Это делают для облег-
чения растворения белков. После окончания экстракции гель
удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок
можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью
ацетона с 0,1 М НС1 (6: 1), а затем чистым ацетоном. Осажден-
ный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. Брэй и
Браунли [Bray, Brownlee, 1973] элюировали таким образом бе-
<< Пред. стр. 16 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу