<< Пред. стр. 10 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
Выбор рабочего буфера геля
Из изложенного ясно, что рН буфера в этом варианте элект-
рофореза не играет существенной роли, так как заряд белка оп-
ределяется его комплексированием с ДДС-Na. Обычно работают
с нейтральными буферами. По традиции, идущей еще от пионер-
ской работы Вебера и Осборн [Weber, Osborn, 1969], часто ис-
пользуют 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 7,1. Его концентрация
обусловлена только желанием обеспечить 10-кратное различие в
электропроводностях буферов геля и препарата. В качестве по-
следнего берут 0,01 М Na-фосфат, рН. 7,1. Как уже указывалось,
такое различие обеспечивает концентрирование исходной поло-
сы при переходе белков из буфера препарата в гель. Однако
ввиду большой электропроводности Na-фосфатного буфера на-
пряженность поля приходится ограничивать значением 5 В/см,
что замедляет процесс разделения, поэтому вместе Na-фосфат-
ного имеет смысл использовать другой, менее проводящий бу-
фер, например имидазолфосфатный, рН 7. Молярность рабочего
буфера можно снизить до 0,05 М, сохранив для буфера препара-
та концентрацию 0,01 М. Это позволит значительно увеличить
напряженность поля и сократить продолжительность электрофо-
реза.
В электродных резервуарах обычно используют тот же буфер,
что и в геле. В буферы вносят и ДДС-Na до концентрации 0,1%.
Необходимость присутствия ДДС-Na в рабочем буфере геля
одно время оспаривалась [Stoklosa, Latz, 1974]. Авторы цити-
руемой работы утверждали, что ДДС-Na образует с белком
прочный комплекс, не разрушающийся в процессе электрофоре-
за. В более поздней работе, напротив, подчеркивается необходи-
мость введения ДДС-Na в буфер геля или хотя бы в катодный
буфер, откуда он будет поступать в гель. Показано, что ДДС-Na
может выходить из комплекса с белком. В тех случаях, когда
скорость миграции детергента в геле намного больше, чем бел-
61
ка, последний будет терять ДДС-Na и изменять свою подвиж-
ность в геле [Kubo et al., 1979]. Это обстоятельство было пред-
ложено использовать в своеобразном процессе двухстадийного
электрофореза [Sorimachi, Condliffe, 1977]. После обычной об-
работки ДДС-Na и ?-меркаптоэтанолом авторы сначала вели
электрофорез в течение 2 ч в 10%-ном ПААГ, полимеризован-
ном, как обычно, в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7) с 0,1%
ДДС-Na. Через некоторое время буфер в катодном резервуаре
заменяли на такой же, но без ДДС-Na. Это приводило к быст-
рой очистке геля от детергента, мигрирующего к аноду. Затем
от ДДС-Na освобождались и белки. Дальнейшее разделение шло
уже по заряду белков. При этом рН буфера можно с самого на-
чала выбрать оптимальным именно для второго этапа разделе-
ния, поскольку на первом этапе в присутствии ДДС-Na рН роли
не играет.
Подготовка белкового препарата
На эту операцию следует обратить особое внимание. Сопо-
ставлять молекулярные массы белков по скорости их миграции
можно только в том случае, когда есть уверенность в полной де-
натурации белка при обработке его ДДС-Na.
Вебер и сотрудники ввели широко употребимую до сих пор
процедуру обработки. Белковый препарат диализуют против
0,01 М Na-фосфата, содержащего 0,1% ДДС-Na и 0,1% ?-мер-
каптоэтанола, удаляя из него остатки соли. Затем концентрации
ДДС-Na и ?-меркаптоэтанола увеличивают до 1% (каждого) и
прогревают препарат при 100° в течение 2 мин. Концентрация
белка при этом должна составлять около 1 мг/мл [Weber et al.,
1972]. Если предполагается присутствие в препарате протеаз,
прогрев можно продлить до 5 мин. Показано, например, что
трипсин и химотрипсин сохраняют значительную каталитиче-
скую активность в .присутствии 1% ДДС-Na, но прогрев при
100° в течение 5 мин эту активность полностью подавляет [Рог-
tci, Preston, 1975]. Если же при высокой температуре наблюда-
ется неферментативный гидролиз белка, то прогревание при 100°
можно заменить инкубацией при 37° в течение 2 ч. Перед нане-
сением препарата на гель в него дополнительно добавляют ?-
меркаптоэтанол до концентрации 4 - 5%.
Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода
рекомендуют при определении молекулярной массы малоизу-
ченного белка проверить полноту его денатурации. Для этой це-
ли они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка
по более сложной прописи, гарантирующей его полную денату-
рацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный ?-меркаптоэтанол с по-
следующим алкилированием йодацетамидом). После этого фор-
мируют комплекс белка с ДДС-Na и сопоставляют картины
электрофореза белка, обработанного обычным способом, и кон-
трольного препарата.
62
С другой стороны, некоторые белки, в частности липопротеи-
ды, при кипячении с 1 % ДДС-Na и 1 % ?-меркаптоэтанола мо-
гут выпасть в осадок и не войти в гель. В этих случаях прихо-
дится уменьшать концентрацию ?-меркаптоэтанола или не вво-
дить его совсем.
При повышенной температуре иногда обнаруживается уси-
ленный протеолиз исходных белков. Известно, что денатурация
белка многократно увеличивает его доступность для атаки про-
теолитическими ферментами. ДДС-Na не входит в число их эф-
фективных ингибиторов. Если опасность протеолиза существу-
ет, в исходный препарат до денатурации белков вводят мощные
ингибиторы протеаз: фенилметилсульфонилфторид (300 мкг/мл) и 1,10-фенантролин (1 мг/мл).
Проведение электрофореза
Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего
напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то
здесь остаются в силе все те соображения, которые были приве-
дены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропро-
водность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электро-
форез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за
собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень
сильно зависит от температуры). При длительном электрофоре-
зе электродные буферы следует обновлять.
Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение
ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным
даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные
различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимо-
действие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности
определения молекулярной массы малых белков и олигопепти-
дов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М
мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля.
В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочеви-
ны при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов
с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая
линейная зависимость lg M от Rf [Kato et al., 1975], однако точки
для инсулина (М=5782) и глюкагона (M = 3483) из графика
этой зависимости выпадали.
Разделение улучшается в случае малых исходных количеств
белка (1 - 5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции око-
ло 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного
белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соот-
ветствующего набора стандартных маркеров. Затем следует
поварьировать условия - и, в частности, сопоставить значения
молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в ге-
лях с различным содержанием акриламида.
В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список
около 40 стабильных белков, которые можно использовать в ка-
63
честве стандартных маркеров в интервале М 12 - 200 тыс. даль-
тон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно
при М > 70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому
фирма BDH при разработке своих стандартных наборов марке-
ров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на
основе только одного белка с хорошо известным значением М,
сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров
обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое
время был описан и в лабораторной практике [Inouye, 1971].
Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан-
зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фик-
сировать их положение при УФ-освещении без окраски геля.
При определении молекулярной массы коллагена использо-
вание глобулярных белков в качестве маркеров возможно в том
случае, если строить график зависимости от расстояния мигра-
ции. не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп-
тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Ско-
рость миграции зависит именно от размера молекулы белка -
переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее
значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав
коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глици-
на, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].
Окрашивание и элюция белков
Эти вопросы рассмотрены ниже в специальных параграфах,
но все же имеет смысл несколько замечаний, связанных с ис-
пользованием ДДС-Na, сделать именно здесь
После электрофореза в присутствии ДДС-Na гель окрашива-
ют, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ R-250
(см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% мета-
нола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а
затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и
добавкой ионообменника AG 501 ? 8 для связывания красителя.
Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Од-
нако следует иметь в виду, что ДДС-Na является эффективным
детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и
фиксации белков. Для малых белков фиксация при окрашива-
нии может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать пред-
варительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло-
те (ТХУ). ДДС-Na, находясь в комплексе с белком, еще и пре-
пятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания.
10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Na. Еще лучше
это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в
течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Na, по-
этому его целесообразно включить в фиксирующий белки рас-
твор.
Можно окрашивать белки в геле, вымачивая его прямо в
0,05%-ном растворе СВВ R-250 в 10%-ной ТХУ. Краситель до-
64
вольно плохо растворим в ТХУ, поэтому происходит его распре-
деление между жидкой фазой и белками в пользу последних.
Белковые полосы проявляются очень быстро, и гель можно от
красителя не отмывать. Однако чувствительность окраски не-
сколько снижена по сравнению со стандартной процедурой. Ни-
же будут оценены возможности повышения ее чувствительности
с помощью таких флюоресцентных красителей, как данзилхло-
рид, флюоресцамин, ортофталевый альдегид и др. Здесь умест-
но отметить, что их присоединение к белкам исходного препара-
та не влияет на электрофоретическую подвижность этих белков.
Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из под-
робно рассмотренных ниже способов, в частности повторной
элюцией из кусочков геля встряхиванием в течение 6 - 12 ч при
37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с
0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя
бикарбонат, и растворяют в воде до 0,1 исходного объема. За-
тем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению
к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо
растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и
промывают 90%-ным ацетоном. В случае необходимости более
полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилизированный,
как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объе-
ма, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната аммония с 6 М
мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции бел-
ка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Do-
wex 1 ? 2 (200 - 400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером.
Мочевину затем удаляют диализом.
Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na сейчас в подав-
ляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной
Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка
ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы
ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется
всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение
исходной белковой полосы можно получить просто за счет раз-
бавления буфера, в котором вносится препарат. Больший инте-
рес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка
ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот при-
ем будет рассмотрен ниже.
Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно
использован для фракционирования белков хроматина без их
предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч
против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% ?-меркаптоэта-
нола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч - против
свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого
его прогревали в течение 3 мин при 100° и диализовали еще 2 раза по 12 ч против того же буфера, но содержащего вдесяте-
ро меньше ДДС-Na и (?-меркаптоэтанола. При такой обработке
ДНК отделяется от белка и не мешает протеканию последующе-
го электрофореза белков хроматина [Elgin, 1975].
65
СТУПЕНЧАТЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
(DISC-ELECTROPHORESIS)
Отличительной особенностью этой системы является полиме-
ризация в одной трубке или пластине двух гелей: рабочего, мел-
копористого, и непосредственно над ним - "формирующего",
крупнопористого. Кроме степени пористости, эти два геля резко
различаются по рН и молярности буферов, в которых они поли-
меризуются. Отсюда и название системы - ступенчатый элек-
трофорез. По-английски его сокращенно называют "disc-electro-
phoresis" (от слова "discontinuous"-прерывистый). Этот вид
электрофореза был предложен Орнстейном и Дэвисом еще в са-
мом начале становления метода электрофореза в ПААГ [Ornste-
in, Davis, 1964].
Пористость, длина и выбор буфера для нижнего (рабочего)
геля определяются точно такими же соображениями, что и для
простого непрерывного электрофореза. Единственное, что здесь
своеобразно-это обязательное использование в составе рабо-
чего буфера быстроподвижных ионов, мигрирующих в том же
направлении, что и белки, например: иона Cl- для щелочных бу-
феров или иона К+-для кислых. Выше отмечалось, что ис-
пользование таких ионов невыгодно, так как приводит к огра-
ничению напряженности поля и скорости миграции белков.
Однако в данном случае использование "быстрых" ионов дик-
туется самим существом метода, как это будет ясно из дальней-
шего изложения. Заметим, кстати, что если концентрация этих
ионов и зависит от рН буфера, то их электрофоретическая под-
вижность от рН совершенно не зависит.
В формирующем геле небольшой протяженности (1-3 см)
фракционирования белков не происходит. Наоборот, назначение
этого геля-собрать смесь всех белков перед переходом в ра-
бочий гель в одну узкую полосу, толщина которой может со-
ставлять сотые доли миллиметра независимо от первоначаль-
ного объема препарата. Для рабочего геля она является исход-
ной зоной для фракционирования, а это резко повышает его
разрешающую способность. Поскольку в формирующем геле
белки разделяться не должны, его концентрацию стараются сде-
лать минимальной (Т=2,5-3). Формирующий гель полимери-
зуют обычно в таком же по составу буфере, что и рабочий гель
(следовательно, он тоже содержит быстроподвижный ион), од-
нако по концентрации и значению рН эти буферы не одинаковы.
Буфер формирующего геля, как правило, почти нейтральный,
буфер рабочего геля - щелочной или кислый. Смысл этого раз-
личия будет раскрыт ниже.
Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор
электродного буфера, находящегося в контакте с белковым пре-
паратом и формирующим гелем ("верхнего" буфера в случае
использования системы с вертикальным расположением геля).
В этом буфере подвижность иона, мигрирующего в том же на-
66
правлений, что и белок, должна сильно зависеть от рН. Для
этого удобно использовать цвиттерионы, например простые ами-
нокислоты (глицин и р-аланин). Их изоэлектрические точки ле-
жат в нейтральной области рН (для глицина рI=5,97). При
этом диссоциации карбоксила с потерей протона и появлением
отрицательного заряда соответствует pKa1=2,34, а ионизации
концевой аминогруппы с присоединением протона и образова-
нием положительного заряда-рКa2=9,6. При рН 5,97 все мо-
лекулы глицина ионизированы по обоим концам и их суммар-
ный заряд равен нулю.
При сдвиге рН окружающей среды в щелочную сторону про-
исходит нейтрализация части молекул глицина по аминогруппе,
в то время как карбоксильные остатки всех молекул сохраняют
свой отрицательный заряд. Процесс этот-чисто статистиче-
<< Пред. стр. 10 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу