<< Пред. стр. 12 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
В аналогичной работе (Bordier, Crettol-Jarvinen, 1979] в первом
направлении использовали систему Лэммли в сочетании с гра-
диентом пористости рабочего геля в пластине-концентрация
ПААГ изменялась от 5 до 17,5%. При внесении в карманы геля
второго направления полоски индивидуальных белков, вырезан-
ные из пластины первого направления, заливали расплавлен-
ным 1%-ным раствором агарозы, чтобы фиксировать их исход-
ное положение на дне кармана. В другой недавней работе
[Nikodem, Fresco, 1979] белки гидролизовали бромистым циа-
ном. Как и в предыдущей работе, в первом направлении белки
фракционировали ступенчатым электрофорезом с обработкой
ДДС-Na в градиенте пористости геля, вырезали слегка окрашен-
ные полоски белков и обрабатывали их BrCN прямо в геле.
Реакцию вели в маленьких пластмассовых флаконах под тягой.
Затем полоски геля вымачивали в буфере и переносили в кар-
маны пластины второго направления для разделения пептидов.
Другие авторы [Boulikas et al., 1980] аналогичным образом про-
водили промежуточный гидролиз белков в геле N-бромсукцин-
имидом. В первом направлении белки разделяли электрофоре-
зом в "кислой мочевине".
Особенно совершенной оказалась двумерная система фрак-
ционирования белков и пептидов, предложенная 0'Фаррелом
[O'Farrel, 1975]. В этой системе во втором направлении также
использована методика Лэммли в сочетании с градиентом пори-
стости ПААГ. Подробный разбор системы 0'Фаррела и ее мо-
дификаций здесь провести нельзя, поскольку в первом направ-
лении в ней используется не электрофорез, а электрофокусиро-
вание.
ГРАДИЕНТ ПОРИСТОСТИ ПААГ
В конце предыдущего раздела было рассмотрено несколько
примеров использования градиентов пористости ПААГ. Теперь
рассмотрим возможности этого метода подробнее.
73
Техника приготовлений гелей с изменяющимися вдоль на-
правления миграции белков размерами пор, или, как их назы-
вают, "градиентов пористости ПААГ", была подробно описана
в главе 2. Постепенное уменьшение среднего размера пор вдоль
градиента достигается путем увеличения концентрации акрил-
амида. Электрофорез в градиенте пористости ПААГ имеет це-
лый ряд существенных преимуществ.
Во-первых, ему присуще самоограничение миграции белков
в геле. По мере продвижения в электрическом поле белковые
зоны попадают в области все более мелких пор, трение о гель
усиливается и движение зон замедляется. Если размеры белков
достаточно велики, то в какой-то момент времени миграция их
может практически прекратиться. Для разных зон этот момент
наступает не обязательно одновременно. Белки каждой зоны
мигрируют до своего конечного положения, соответствующего их
размерам, независимо друг от друга. Достигнув этого положе-
ния, они могут оставаться в нем неограниченно долго. Для бел-
ков разной величины конечные положения окажутся в разных
участках градиента пористости. К моменту окончания процесса
фракционирования в целом все белковые зоны займут свои ста-
ционарные положения и останутся в них до тех пор, пока будет
включено электрическое напряжение. Таким образом, экспери-
ментатору нет нужды наблюдать за окончанием электрофореза.
Его продолжительность можно выбрать "с запасом", например
поставить опыт на ночь.
Во-вторых, в ходе электрофореза происходит непрерывное
сужение белковых зон. Оно происходит потому, что белки в пе-
редней части каждой зоны постоянно оказываются в области
чуть более мелких пор, чем идущие в задней части этой же зоны.
Впереди идущие белки, таким образом, тормозятся гелем не-
много сильнее, а идущие сзади их постепенно догоняют. Этот
процесс противодействует диффузии белков из зоны. Убедитель-
ная иллюстрация эффективности такого противодействия была
приведена выше (см. рис. 16).
При электрофорезе в градиенте пористости ПААГ отпадает
необходимость в первоначальном сужении полос. Можно вести
электрофорез в простой непрерывной системе и не очень забо-
титься об объеме исходного препарата. Сделанное замечание
находится в противоречии с цитированными выше недавними
работами, где градиентный гель использовали в сочетании со
ступенчатым электрофорезом по Лэммли. Возможно, что при та-
ком сочетании хорошее разделение зон достигается быстрее, но
не исключено, что в некоторых конкретных случаях оно обус-
ловлено определенным консерватизмом и "перестраховкой".
По существу, картина разделения белковых зон при электро-
форезе в градиенте пористости ПААГ зависит только от соот-
ношения размеров белков в препарате и характера градиента
пористости. Выбор буфера и электрического режима электрофо-
реза играет второстепенную роль. Поэтому, в частности, можно
74
использовать любые буферы сравнительно малой концентра-
ции (0,03-0,05 М), достаточной лишь для сохранения знака
заряда белка. Это позволяет повысить напряженность поля, что
для данного метода немаловажно, так как скорости миграции
белков при приближении к конечным положениям существенно
уменьшаются.
Указанные преимущества объясняют растущую популяр-
ность градиентных гелей, несмотря на большую сложность их
приготовления по сравнению с обычным ПААГ. Легко понять, '
почему такая ведущая фирма, как "Pharmacia", специализиро-
валась на выпуске стандартизированных градиентных ПААГ.
Фирма предлагает гели в виде пластин с рабочими размерами
78х78х2,7 мм для двух интервалов концентраций ПААГ: 2-
16% и 4-30% (РАА 2/16 и РАА 4/30). Профиль градиента по-
ристости в этих пластинах подобран так, что в пределах некото-
рого диапазона- молекулярных масс нативных глобулярных бел-
ков они обеспечивают линейную зависимость расстояния миг-
рации белка (до конечного положения) от логарифма его моле-
кулярной массы. Калибровочные данные прилагаются фирмой
к каждому гелю вместе с указанием стандартных условий
фракционирования. Рабочие диапазоны молекулярных масс та-
ковы: для РАА 2/16-от 100 тыс. до 5 млн. дальтон, для РАА
4/30 - от 50 тыс. до 2 млн. Для РАА 4/30, например, это озна-
чает, что при достаточно длительном электрофорезе белки с мо-
лекулярной массой менее 50 тыс. могут выйти из геля, а имею-
щие массу более 2 млн.-не войдут в него. Последняя цифра
может относиться, конечно, только к белковым комплексам или
нуклеиновым кислотам.
Градиентами пористости ПААГ можно, как мы видели, поль-
зоваться и для разделения комплексов белок-ДДС-Na. Ламбен
обнаружил, что для белков, обработанных ДДС-Na, линейный
градиент концентрации ПААГ в интервале 3-30% позволяет
проводить электрофорез до полной обстановки белков с молеку-
лярными массами от 13 до 950 тыс. дальтон. При этом справедливо
следующее линейное соотношение: lg M = A lg T+B, где М-
молекулярная масса белка, а Т-концентрация ПААГ в месте
расположения белковой полосы. Для линейного градиента эта
концентрация легко вычисляется по расстоянию полосы от нача-
ла пластины. А и В-коэффициенты, указывающие на линей-
ный характер зависимости. Определять их нет нужды, если име-
ется возможность воспользоваться, как обычно, набором мар-
керных белков. Обработку исходного препарата можно прово-
дить в тех же условиях, что для обычного электрофореза в ПААГ
с ДДС-Na [Lambin, 1978].
Недавно Ламбен и Фаин [Lambin, Fine, 1979] предложили
способ определения молекулярной массы нативных белков (без
ДДС-Na) по кинетике их миграции в линейном градиенте кон-
центрации ПААГ (3-20%). Оказалось, что для любого белка
характер его непрерывно замедляющегося движения в таком
75
геле хорошо описывается линейной зависимостью: ??t=aD+b,
где t-любой момент времени с начала электрофореза, пока
белок еще движется; D-пройденное им к этому моменту рас-
стояние в геле; а и b - постоянные в данном опыте величины.
Для каждого конкретного белка такую зависимость легко
получить экспериментально. Удобно, например, в разные карма-
ны одной пластины геля последовательно, через известные про--
межутки времени, вносить аликвоты раствора исследуемого
белка. К моменту прекращения опыта для каждого трека на
пластине будет известна продолжительность электрофореза, а
расстояние миграции легко измерить. Это можно сделать даже
для смеси нескольких белков. Далее по экспериментальным точ-
кам строят график зависимости ??t от D, имеющий вид прямой
линии. Тангенс угла наклона этой прямой-значение коэффи-
циента а в написанном выше уравнении. Ясно, что этот коэффи-
циент должен зависеть от молекулярной массы белка: чем он
крупнее, тем медленнее мигрирует в геле. Оказывается, что
соотношение между логарифмами коэффициента а и молеку-
лярной массы белка имеет тоже приблизительно линейный ха-
рактер в широком интервале молекулярных масс-от 20 до
950 тыс. дальтон. Коэффициенты в этом втором линейном урав-
нении зависят от выбора буфера. Авторы дают их значения для
трех стандартных буферов: фосфатного (рН 7,2), Трис-боратно-
го (рН 8,2) и Трис-барбитуратного (рН 9,8). Так, для 0,01 М
Na-фосфатного буфера (рН 7,2) имеет место зависимость:
Lg M = l,93 lg a + 6,99. Точность определения молекулярной мас-
сы невысока-в среднем ±20%. Однако важное достоинство
метода состоит в возможности оценивать суммарную молеку-
лярную массу белков, состоящих из субъединиц, которые диссо-
циируют при обработке ДДС-Na. Таким образом, комбинируя
результаты определения молекулярной массы некоего белка
описанным методом с тем, что дает для него же электрофорез с
использованием ДДС-Na, можно выяснить субъединичное строе-
ние белка.
В заключение следует подчеркнуть, что градиентный гель хо-
рош только для разделения белков по размерам. В случае раз-
деления по заряду он может даже ухудшить результат, так как
белки с различной величиной заряда, но одинаковых размеров
при длительном электрофорезе остановятся в одном и том же
месте.
ДВУМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ
Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда
удается осуществить в ходе одного опыта даже с применением
описанных выше приемов повышения разрешающей способно-
сти электрофореза в ПААГ. Всегда достаточно высока вероят-
ность того, что в данной системе электрофореза различные бел-
ки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров,
либо ввиду совпадения значений их электрофоретических под-
76
вижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в ре-
зультате неблагоприятной для разделения комбинации этих
параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после
первого электрофоретического фракционирования смеси бел-
ков следует проверить на гомогенность, используя ее как исход-
ный препарат для электрофореза в других условиях. Это можно
сделать одновременно для всех полос первого разделения, или,
как его часто называют, "разделения в первом направлении".
Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека
из пластины первого направления, накладывают на стартовую
зону пластины "второго направления". Контакт между двумя
гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стар-
товым буфером или, для надежности, расплавленным раствором
агарозы в этом же буфере. Электрофорез ведут в направлении,
перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомо-
генная белковая полоса может дать несколько пятен, если при
новых условиях электрофореза подвижности первоначально об-
разовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми.
В результате на пластине второго направления после прокра-
шивания выявляется картина распределенных по всей поверх-
ности пятен, напоминающая "фингерпринт" в двумерной тонко-
слойной хроматографии. Число пятен, которое удается разли-
чить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к
двум тысячам (!).
При сочетании гелей двух направлений вовсе не обязательно,
чтобы они были одинаковой толщины. Например, гель из труб-
ки диаметром 6 мм вполне можно совместить с пластиной толщи-
ной 1 мм. Для этого в месте перехода от трубки к пластине сле-
дует образовать продольно расположенную полость, предпочти-
тельно клиновидного сечения, куда можно заложить цилиндрик
геля и залить'его там буфером, агарозой или даже заполиме-
ризовать в переходный, крупнопористый ПААГ. Способ образо-
вания и форма сечения этой полости не играют большой роли.
Необходимо выполнить только одно условие: цилиндрик или по-
лоска геля первого направления должны лежать параллельно
краю геля в пластине второго направления. Можно, например,
воспользоваться простым вкладышем из плексигласа (рис. 23).
Этот вкладыш легко монтируется в обычный прибор для элек-
трофореза в вертикальной пластине [Hoffman, Dowben, 1978a].
Иногда из цилиндрика вдоль его продольной оси вырезают пло-
ский, тонкий слой и накладывают его на гель второго направ-
ления, как и полоску трека, вырезанную из пластины. Для вы-
резания плоского слоя из трубки (в замороженном состоянии)
удобно воспользоваться простым приспособлением, описанным
Уоттсом и др. [Watts et al., 1977].
В каждом из направлений двумерного электрофореза ис-
пользуют одну из рассмотренных выше систем, отвечающую спе-
цифическим особенностям фракционируемых белков. Широкое
применение двумерный электрофорез нашел, например, для
77
Рис. 23. Вкладыш из плексигласа для двумерного электрофореза [Hoffman,
Dowberi, 1978a]
Рис. 24. Результаты двумерного электрофореза рибосомальных белков [Mets,
Bogorad, 1974]
I-первое направление; II-второе направление
анализа белков рибосом из разных источников. Это, в основном,
слабощелочные белки, и в первом направлении их разделяют ча-
ще всего по заряду. Для этого используют крупнопористый гель,
чтобы различие молекулярных размеров по возможности не
сказывалось на разделении белков в этом направлении, т. е. не
накладывалось на разделение по заряду. Во втором направле-
нии в этом случае белки разделяют по их размерам.
Так, Мете и Богорад электрофорез рибосомальных белков в
первом направлении проводили в трубках диаметром 4 мм и
длиной 10 см [Mets, Bogorad, 1974]. 4%-ный ПААГ полимери-
зовали в буфере с рН 5. При этом все рибосомальные белки за-
ряжены положительно и различия значений их суммарных за-
рядов выражены наиболее ярко. В буфер вводили 8 М мочевину,
чтобы помешать агрегации белков. При полимеризации геля
вносили больше ТЕМЕД, чем персульфата аммония (0,1 и
0,03%), так как в кислой среде каталитическая активность
ТЕМЕД понижена (см. главу 2). 0,1-0,2 мг смеси рибосомаль-
ных белков вносили растворенными в 8 М мочевине с 10 мМ ди-
тиотреитолом. Разделение вели при силе тока 1,5 мА на трубку
в течение 4-5 ч. Во втором направлении использовали ступен-
чатый электрофорез. Рабочим гелем служил 10%-ный ПААГ,
полимеризованный в буфере с рН 6,75. Формирующий гель-
такой же, как гель первого направления (4% ПААГ, рН 5). Его
полимеризовали вокруг геля из трубки, уложенного в клиновид-
ное расширение над пластиной. Концентрацию мочевины в этом
геле снизили до 7 М, чтобы цилиндрик не мог всплыть во время
полимеризации. В качестве медленно мигрирующего иона верх-
него электродного буфера использовали MES (2-(N-морфолино-
78
этенсульфокислоту) - продажный препарат для составления
буферов с рКа 6,15. Быстрым ионом служил остаток уксусной
кислоты. В состав верхнего буфера ввели также 1% ДДС-Na и
0,01% тиогликолевой кислоты, которая, как уже упоминалось,
служит для очистки гелей от остаточных свободных радикалов
персульфата аммония. Она мигрирует из электродного буфера
в гель, где и движется впереди белков. Отметим, что преэлек-
трофорез в ступенчатой системе невозможен-он нарушил бы
распределение ионов по ступеням. Однако его можно провести
предварительно, использовав в качестве верхнего обычный бу-
фер с быстро мигрирующим ионом, а затем заменить его, как
описано выше. Верхний электрод является катодом, анод рас-
положен внизу. Под действием поля ДДС-Na из верхнего элек-
тродного буфера мигрирует в гель. В цилиндрике геля первого
направления он образует комплексы с белками. Далее отрица-
тельно заряженные комплексы белок - ДДС-Na выходят из ци-
лкндрика и фракционируются ступенчатым электрофорезом в
пластине. Обработка белков ДДС-Na, таким образом, 'происхо-
дит в отсутствие ?-меркаптоэтанола. Его отчасти заменяет мо-
чевина; кроме того, исходно, до электрофореза в первом направ-
лении, белки восстанавливают 10 мМ дитиотреитолом. Электро-
<< Пред. стр. 12 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу