<< Пред. стр. 18 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
Полное растворение геля легко осуществить в том случае,
когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель
сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла-
ве 1 уже был назван в этом качестве NN/-диaллилтapтapдиaмид
(ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в
йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте
растворимого геля используют NN/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpи-
ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и
глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4
при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976]
утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос-
производимыми характеристиками, чем при использовании
ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил-
цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида
[Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в ?-меркаптоэтаноле за
2-3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон-
костей, которые необходимо учитывать во избежание образова-
ния дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэта-
нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN/-Бисакрилилцистамин в
настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и
ДОЭБА.
Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори-
мые ПААГ не получили широкого распространения - скорее
всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень
легко - простым нагреванием - расплавляются гели агарозы,
но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых
кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло-
жить до следующей главы.
Импрегнирование сцинтиллятора в гель
Возможен и обратный подход к решению проблемы счета ра-
диоактивности белка после электрофореза - вместо элюции бел-
ка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек
геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и со-
хранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна.
В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсо-
лютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его-на
толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому,
лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.
111
При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачности как
это происходит при вымачивании его в этаноле.
Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его раз-
резание, следует стремиться к тому, чтобы в одном кусочке геля
была вырезана целая полоса или все белковое пятно. Широко
распространенная практика разрезания цилиндрика геля на оди-
наковые диски толщиной 1-1,5 мм неудачна, так как разрез
"вслепую" может попасть на середину полосы. В результате это-
го радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в
двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более ши-
рокого и низкого пика радиоактивности на электрофореграмме.
Разумеется, для того чтобы правильно вырезать белковую
полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой кон-
центрации белка в полосе, что нередко имеет место при фрак-
ционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработ-
ка новых высокочувствительных методов окрашивания белков,
например серебром, поможет решить эту проблему.
Авторадиография
Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине геля
можно осуществить методом авторадиографии. На гель наклады-
вают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длитель-
ного времени в темноте, обычно при комнатной температуре.
Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю
пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уров-
ня радиоактивности белков экспозиция может длиться от не-
скольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обыч-
ными проявителями, предназначенными для получения макси-
мально контрастного изображения. Под действием ?-излучения
участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами,
чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех
случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или
йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испус-
каемые им ?-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток
между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду
их сильного поглощения в геле.
Потеря энергии ?-частиц в геле достаточно велика и в слу-
чае использования радиоактивного углерода, поэтому перед
авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушен-
ного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме-
тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на
фильтровальную бумагу ("Whatman 3MM"), под нее подклады-
вают пористую прокладку и перфорированную металлическую
пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и при-
соединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей
воде или под лампой гель высыхает за 1-2 ч, образуя тонкую
прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть
множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-
112
ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу по-
ристую основу и накрывают листом тонкой резины, которую при-
сасывает вакуумом. Во избежание прилипания резины к гелю
под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высуши-
вание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев не-
возможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.
Для авторадиографии следует использовать неэкранирован-
ную рентгеновскую пленку типа "Kodak No Screen X-Ray Film",
например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма
LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадио-
графии препаратов, меченных тритием, под названием "LKB-
Ultrafilm". Суть дела здесь не в повышении чувствительности,
а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией.
Это облегчает проникновение в нее "слабых" ?-электронов три-
тия, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувстви-
тельность метода авторадиографии для регистрации 14С можно
оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактив-
ность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распреде-
ленная по площади 1 см2, надежно регистрируется за 24 ч экспо-
зиции.
Для регистрации ?-излучения 125I удобно применять способ
"непрямой" авторадиографии. ?-Излучение регистрируется рент-
геновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и те-
ряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый
"интенсифицирующий экран", покрытый твердым сцинтиллято-
ром (CaVO4). Под действием ?-излучения экран флюоресцирует,
а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение
и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку
экран удален от геля на толщину пленки, а не все ?-частицы вы-
летают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш
в чувствительности получается значительный.
Для непрямой авторадиографии следует использовать экра-
нированные рентгеновские пленки, например: "Kodak X-Omat R"
и "Kodak RP-50" (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирую-
щие экраны выпускают, в частности, фирма "Du Font" (США)
под названием "Lightning Plus Intensifying Screen" и химфарм-
завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.
Для повышения чувствительности пленки ее иногда предва-
рительно засвечивают до плотности потемнения (после проявле-
ния), соответствующей A540=0,2-0,3. Объяснение этого стран-
ного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey,
Mills, 1975].
Флюорография
Для регистрации положения в геле белков, меченных три-
тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы
ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо-
дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками
в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит
113
из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов-
ской пленкой того же типа, который используют при непрямой
авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был
рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет-
рических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться
при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.
Повсеместное распространение для флюорографии гелей по-
лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки.
Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО),
вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч
в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему
геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через
кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено-
сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в
ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является
сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо
убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не
удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель
переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не-
растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится
белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за-
мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было
описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания
остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна,
но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО
с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть
зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до-
статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет-
ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле
[Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее
чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование
пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку
при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре
резко снижается чувствительность метода.
Гели с низким содержанием акриламида, например смешан-
ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в
ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить
ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для
более концентрированных гелей метанол непригоден - гели в
нем сжимаются.
Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются
при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается
только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу.
К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле-
гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к
тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше ("стек-
ленеет"), а на противоположной его поверхности остается влага,
которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во
избежание этого дефекта было предложено между свободной по-
114
верхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой по-
ристого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой
поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].
Недавно было указано на возможность замены ППО в каче-
стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979].
Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что
вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки.
Главное же преимущество этого реагента - в его водораствори-
мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в
10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение
30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-
графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания
следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой
кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1-2 не-
дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).
После флюорографии для количественных определений ра-
диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать,
дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да-
лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек-
гивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться
только методом внутренней стандартизации.
Для правильного совмещения изображения на рентгеновской
пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для
счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны-
ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра-
диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать
любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо
растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро-
чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю
авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра-
диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще-
ственно.
Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре-
гистрировать в геле двойную метку 3Н и 14С (например, сопо-
ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси
вводят радиоактивную метку по 3Н, в белки второй - по 14С. Обе
смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом.
Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и
регистрируют флюорографией на пленку "Kodak IR-5" сцинтил-
ляцию от обеих белковых смесей (3H+14С). С негатива делают
контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока-
зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную
пленку "Kodak NS-5T" при комнатной температуре регистрируют
авторадиографией только 14С. К свету сцинтилляций эта пленка
нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с
первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона-
хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в
состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух
белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].
115
Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не
только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой
цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре-
зать плоский слой толщиной 0,5-1,5 мм. Описано простое приспо-
собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].
Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны-
ми на их "репликами" белков из геля осуществляют очень про-
сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу-
шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен-
ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография
и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется
лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на
поверхности фильтров.
ПРЕПАРАТИВНЫИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения
в качестве препаративного метода фракционирования и очистки
белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности
осуществления равномерного теплоотвода из большой массы ге-
ля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плос-
кой). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле гра-
диенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому
ухудшению качества разделения белков.
Вторая трудность связана с необходимостью создания удоб-
ной и надежной камеры элюции для сбора белков по мере их
последовательного выхода из геля. В многочисленных конструк-
циях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру соз-
давали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от
нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохране-
ния качества разделения белков камера элюции очень малого
объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться
элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны
сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной
пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб
геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в каме-
ру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков
из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной.
Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодо-
леть указанные трудности. Препаративное фракционирование
белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную
мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного
резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание
сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее по-
давался под гидростатическим давлением, уравновешивающим
вес геля, а скорость элюции задавалась перистальтическим на-
сосом, стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму
незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного
ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделе-
116
нии ряда белковс молекулярными массами 100-500 тыс. при за-
грузке в гель 4 мг белка [Hardman, Kane, 1980].
Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении
проблемы камеры элюции [Marceau et al., 1975]. ПААГ полиме-
<< Пред. стр. 18 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу