<< Пред. стр. 2 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
ленно разлагается с выделением кислорода. Продажные препа-
раты для электрофореза обычно достаточно хорошо очищены,
но их следует проверять. Если 1%-ный раствор персульфата
аммония в воде имеет рН < 2, то он непригоден. Отметим попут-
но, что катион не играет роли в процессе инициации. Можно с
успехом использовать, например, персульфат калия.
Рибофлавин представляет собой кристаллы в виде желто-
оранжевых игл. Он малорастворим в воде, но хорошо растворя-
ется в слабощелочных водных буферах; растворы имеют желто-
зеленую окраску.
Рибофлавин также может служить инициатором полимериза-
ции. При освещении его водного раствора видимым светом
(445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лей-
корибофлавина. Последний снова легко окисляется растворен-
ным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет раз-
ложения перекиси продуцируются свободные радикалы (НО?),
инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида.
К чистоте рибофлавина можно предъявлять не слишком
строгие требования, так как он, являясь очень эффективным ини-
циатором, используется в гораздо меньших концентрациях
(~ 0,005%), чем персульфат аммония.
Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) - (СН3)2N - CH2 - CH2 -
- N(СН3)2 - представляет собой бесцветную жидкость с плот-
ностью 0,78 г/см3. Концентрация неразбавленного ТЕМЕД -
около 6,7 М.
ТЕМЕД не является, собственно говоря, инициатором поли-
меризации акриламида, но служит катализатором этого процес-
са, заметно ускоряя его протекание. Он эффективен только в
своей неионизированной форме, поэтому при полимеризации ак-
риламида в кислой среде содержание ТЕМЕД следует значи-
тельно увеличить. В нейтральной или щелочной средах ТЕМЕД
можно вносить в количестве, эквимолярном по отношению к пер-
сульфату.
В качестве катализатора в последнее время нередко исполь-
зуют диметиламинопропионитрил - (CH3)2N - СН2 - CH2 - CN
(M = 102). Он более эффективен, чем ТЕМЕД, поэтому его вно-
сят в три-четыре раза меньше, чем персульфата аммония.
9
Процесс полимеризации ПААГ
При подготовке определенной серии опытов удобно заранее
приготовить концентрированный (30 - 40%) водный раствор ак-
риламида и метиленбисакриламида с определенным соотноше-
нием обоих мономеров. Такой раствор можно хранить в холо-
дильнике в течение нескольких недель. Так же хранят и маточ-
ный раствор буфера, например 10-кратной концентрации.
ТЕМЕД хранится хорошо, а персульфат аммония растворяют в
воде непосредственно перед началом опыта.
Для приготовления геля маточные растворы мономеров и бу-
фера смешивают в такой пропорции, чтобы получить нужную ко-
нечную концентрацию акриламида и буфера, дополняют до рас-
четного объема водой и вносят ТЕМЕД. После этого раствор
деаэрируют в колбе Бунзена, присоединенной к водоструйному
насосу, добавляют расчетный объем раствора персульфата и за-
ливают в трубку или между стеклами для формирования пла-
стин. При правильном выборе концентраций персульфата и
ТЕМЕД полимеризация занимает 30 - 40 мин. Ее следует вести
вдали от яркого источника света.
Рассмотрим некоторые факторы, влияющие на этот процесс.
Наибольшую опасность для нормального протекания полимери-
зации акриламида представляет растворенный в воде кислород,
молекула которого является определенного рода бирадикалом
и потому способна оборвать цепную реакцию свободнорадикаль-
ной полимеризации акриламида. Деаэрация смеси растворов
необходима именно для удаления из нее растворенного кислоро-
да. Ее можно вести достаточно энергично и с перемешиванием -
так, чтобы жидкость при пониженном давлении закипела, но
как только интенсивное выделение пузырей газа закончится,
деаэрацию следует прекратить, не допуская заметного испаре-
ния воды. Обычно эта процедура занимает несколько минут при
комнатной температуре.
Кислород воздуха в контакте с раствором мономеров может
помешать полимеризации, поэтому на поверхность раствора ос-
торожно наслаивают до высоты 3 - 5 мм деаэрированную кипя-
чением воду или изобутанол. Наслаивать следует по стенке фор-
мы через иглу от шприца с помощью перистальтического насо-
са. Им же удобно отсосать воду после окончания полимеризации
геля. Вначале граница между гелем и водой исчезает, но затем
вновь появляется, что указывает на окончание процесса полиме-
ризации.
Если в качестве инициатора используют рибофлавин, то фор-
му с раствором мономеров освещают люминесцентной лампой
"дневного света" с расстояния около 5 см в течение 30 - 45 мин.
Уже указывалось, что рибофлавин является более эффективным
инициатором, чем персульфат. Кроме того, продукты его распа-
да не опасны для белков и нуклеиновых кислот, в то время как
ион персульфата может вступать в реакцию с белками, созда-
10
вая артефакты при их фракционировании. В тех случаях, когда
это существенно, персульфат удаляют путем предварительного
электрофореза ("преэлектрофореза") геля до внесения в него
препарата, однако полностью это сделать не удается. Тем не ме-
нее в последние годы в качестве инициатора предпочтение отда-
ют персульфату, поскольку при работе с рибофлавином доволь-
но трудно подобрать оптимальную степень деаэрирования рас-
творов. С одной стороны, растворенный кислород препятствует
полимеризации, а с другой - он необходим, хотя и в небольшом
количестве, для самого процесса инициации с участием рибо-
флавина.
Полимеризация - экзотермический процесс, поэтому в слу-
чае высокой концентрации акриламида во избежание образова-
ния пузырей газа и нарушения однородности геля необходимо
обеспечить отвод тепла. Вместе с тем скорость полимеризации
увеличивается с ростом температуры за счет ускорения образо-
вания свободных радикалов. Этим можно воспользоваться для
замедления полимеризации: при охлаждении геля на 1° ее про-
должительность увеличивается примерно на 2 мин. Полимери-
зацию гелей, содержащих более 15% акриламида, лучше вести
на холоду.
Гель получается наиболее однородным, если время полиме-
ризации составляет 30 - 40 мин. Обычно этого добиваются эм-
пирически, подбирая оптимальную концентрацию персульфата.
Она может варьировать в пределах от 0,02 до 0,2% в зависимо-
сти от концентрации акриламида и качества самого персульфа-
та. С увеличением содержания акриламида концентрацию пер-
сульфата приходится уменьшать. Имеет смысл предварительно
внести различные количества данного препарата персульфата
в ряд пробирок с рабочим раствором мономеров акриламида,
наблюдая продолжительность полимеризации в них.
Количество ТЕМЕД в объемных процентах можно брать
примерно вдвое меньшим, чем персульфата. С учетом различия
молекулярных масс и плотности ТЕМЕД это обеспечит их при-
близительную эквимолярность. Напомним, что при использова-
нии кислых буферов количество ТЕМЕД следует увеличивать
вплоть до 10-кратного по сравнению с персульфатом. Впрочем,
нередко вносят избыток ТЕМЕД и в нейтральные буферы. Су-
щественной роли это не играет, если только гель не обнаружи-
вает склонности к растрескиванию при высушивании (для ав-
торадиографии). В этом случае содержание ТЕМЕД надо сни-
зить.
Состав буферов, используемых для электрофореза белков и
нуклеиновых кислот, не влияет на процесс полимеризации ак-
риламида. Природа, концентрация и рН буфера определяются
особенностями самого процесса электрофореза, которые будут
рассмотрены ниже. Полимеризации ПААГ не мешает также при-
сутствие мочевины (даже в высоких концентрациях), гуанидин-
хлорида, формамида, сахарозы или таких детергентов, как до-
11
децилсульфат натрия, Тритон Х-100, цетавлон и др. Сахароза
даже способствует полимеризации и улучшает механические
свойства геля. Разумеется, все эти добавки не должны содер-
жать посторонних примесей.
Весьма существенно обеспечить чистоту поверхности стеклян-
ных форм для геля. Их тщательно моют лабораторными детер-
гентами и обильно споласкивают водой. Трубки можно мыть ще-..
точкой для курительной трубки. Неплохо дополнительно погру-
зить пластины или трубки на 1 - 2 ч в хромпик. Иногда их моют
горячей азотной кислотой. По хорошо промытой стеклянной
поверхности вода должна стекать, не оставляя капель.
ПААГ хорошо прилипает к стеклу даже при малой концент-
рации акриламида (менее 5%). Это существенно для поддержа-
ния геля в устройствах с вертикальным расположением трубок
или пластин. Кроме того, хорошее прилипание улучшает тепло-
передачу от геля к стеклу и уменьшает опасность образования
шунтирующей ток пленки жидкости у поверхности стекла. Такой
шунт, а иногда и канал, по которому вытекает буфер из верхне-
го электродного резервуара, может образоваться между боко-
выми торцами пластины геля и прокладками, определяющими
его толщину, в случае загрязнения прокладок или неудачного
выбора их материала. Прокладки из тефлона, плексигласа или
чистой силиконовой резины не мешают полимеризации геля
вблизи их поверхности. Однако некоторые сорта резины с на-
полнителями, а также смазки, которыми нередко герметизиру-
ют прокладки, могут препятствовать полимеризации. Смазку
(лучше всего силиконовую) следует наносить тонким валиком
из шприца со снятой иглой на таком расстоянии от внутреннего
края прокладки, чтобы она не выдавливалась внутрь формы
при ее сжатии пружинными зажимами (см. ниже). Для доста-
точно ровных стекол тефлоновые прокладки можно использо-
вать без смазки.
Гели с высоким содержанием акриламида могут настолько
прочно связываться со стеклом, что их последующее извлечение
из трубок или снятие стеклянных пластин с геля становится за-
труднительным. В этом случае можно силиконировать стекло
или использовать формы, изготовленные из плексигласа, к ко-
торому ПААГ прилипает хуже, чем к стеклу, но при высокой
концентрации акриламида - вполне надежно. Полимеризацию
геля между тонким стеклом и толстой (для жесткости) пласти-
ной плексигласа удобно проводить для последующего горизон-
тального электрофореза. После окончания полимеризации плек-
сиглас можно легко снять, а гель на стекле перенести на ох-
лаждающий столик прибора. Полимеризацию ПААГ для гори-
зонтального электрофореза можно вести просто в тонком слое,
налитом на строго горизонтальное стекло, если его поместить в
камеру, заполненную азотом.
Особого внимания требует полимеризация "градиентных" ге-
лей с меняющейся по высоте концентрацией акриламида. Тепло-
12
выделение при полимеризации такого геля будет заметно боль-
ше в его нижней части, где содержание акриламида выше, а это
может привести к тепловой конвекции в жидкости и нарушению
градиента. Во избежание такого явления вместе с концентраци-
ей акриламида по высоте геля варьируют и содержание в нем
инициирующих добавок с таким расчетом, чтобы, полимеризация
начиналась с верхнего края пластины или трубки и постепенно
распространялась вниз.
Выбор концентраций мономеров
Для удобства изложения используются следующие обозна-
чения: Т - процентное отношение суммарной массы обоих мо-
номеров к объему их раствора, С - процентное отношение мас-
сы метиленбисакриламида к общей массе обоих мономеров. Ве-
личина Т практически варьирует в пределах 3 - 30%, а С, как
правило, составляет 1-5%, что соответствует отношению акри-
ламид/Бис в пределах от 99 : 1 по 19 : 1. Однако в некоторых
особых случаях, рассмотренных ниже, имеет смысл увеличивать
С до 20% и более. При указании значений Т и С значок "%" да-
лее будет опущен.
Чем же диктуется выбор значений T и С? Прежде всего, на
этот выбор накладывают ограничения механические и адсорб-
ционные свойства геля. Например, гели с T ? 5 и С = 1 оказыва-
ются слишком мягкими и липкими - их невозможно извлечь
из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увели-
чивать степень сшивки (повышать величину С до 3 - 5), т. е. от-
ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 : 1 до 20 : 1. При
этом происходит одновременное повышение прочности геля и
ухудшение его способности прилипать к стеклу - гель как бы
"замыкается". Мелкопористые гели (T около 20) при высоком
содержании "сшивки" оказываются хрупкими и мутными, по-
этому для них величина С не должна превышать 1 - 2.
На первый взгляд кажется очевидным, что поры ПААГ тем
мельче, чем больше содержание в нем мономеров, т. е. величи-
на Т. Но это не всегда так; имеет смысл разобраться в этом
глубже.
Неправильно было бы считать ПААГ регулярной простран-
ственной решеткой с жесткими ячейками определенного средне-
го размера. При малых значениях С он представляет собой ско-
рее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных
точках случайным образом сшитые между собой. Расстояние
между этими точками вдоль нити (при C ? 2) в среднем равно
50 - 100 мономерных единиц. Такая система не может быть
внутренне жесткой. Мигрирующие в геле макромолекулы, по-
видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных
полимеров акриламида. Разумеется, на это расходуется энер-
гия, миграция молекул замедляется и происходит своеобразное
"трение" их о гель. Однако жестких ограничений на размер
13
мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это
очень существенно.
Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основ-
ном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше проме-
жутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания
"сшивки" (С) сначала повышает жесткость геля так как сред-
няя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при
этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедля-
ется, - именно этого и можно было ожидать. Однако далее кар-
тина меняется. Эксперимент обнаруживает, что с увеличением
С выше 10 тормозящий эффект геля (при одних и тех же значе-
ниях Т) ослабляется. При С > 15 гель ведет себя как крупнопо-
ристый даже при высоких значениях Т. Дело в том, что внутрен-
няя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому,
совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам, располо-
женным теперь на расстоянии всего лишь нескольких мономер-
ных единиц друг от друга, оказывается энергетически выгодным
и вероятным многократное связывание нескольких параллельно
идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют
хаотически сшитую пространственную сетку. Однако эта сетка
оказывается действительно жесткой - нити в пучках раздвинуть
невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образу-
ются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой
геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биопо-
лимеров.
Между прочим, такая же ситуация возникает и при затверде-
вании агара или агарозы, однако нити линейных полисахаридов
связываются в пучки не ковалентными, а водородными связями.
Такая структура и обеспечивает удивительное сочетание круп-
нопористости и прочности, характерное для этих гелей.
Возвращаясь к ПААГ, следует указать, что гели с очень вы-
соким содержанием метиленбисакриламида (С > 15) хрупки,
легко отстают от стенок, непрозрачны и сильно окрашиваются.
Этих недостатков лишены гели, сшитые NN/-диaллилтapтapдиa-
мидом. Например, гель с T = 5 и С = 15, сшитый ДАТД, оказы-
вается настолько крупнопористым, что не тормозит миграцию
биополимеров с молекулярной массой 0,5 млн. дальтон; при
этом он механически прочен, хорошо сцепляется со стеклом и
прозрачен [Baumann, Chrambach, 1976]. Вспомним, что такой
гель к тому же растворим в йодной кислоте. Недавно описано
успешное использование для электрофореза белков еще сильнее
сшитого геля этого типа. В нем величина С достигала 27, т. е.
отношение акриламид/ДАТД не превышало 4 : 1 [Spath, Koblet,
1979].
Рассмотрим теперь подробнее влияние выбора значений Т и
С для обычного ПААГ на скорость миграции в нем биополиме-
ров. Тормозящий эффект трения о гель проявляется в снижении
электрофоретической подвижности заряженных макромолекул в
геле (и') по сравнению с их подвижностью в свободной жидко-
14
сти с такими же, как у буфера геля, значениями рН и ионной си-
лы раствора (u0). Электрофоретическую подвижность определя-
ют как величину скорости миграции заряженных молекул (см/ч)
<< Пред. стр. 2 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу