<< Пред. стр. 3 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
при напряженности поля 1 В/см. Величина и0 зависит от соотно-
шения суммарного электрического заряда макромолекулы (при
данном рН) и ее массы. Сила, действующая на молекулу в элек-
трическом поле, пропорциональна заряду, а противодействую-
щая миграции вдоль силовых линий поля сила трения о жид-
кость пропорциональна линейному размеру молекулы, а следо-
вательно, кубическому корню из ее массы. Для ориентировки
заметим, что электрофоретическая подвижность большинства
кислых белков в свободной жидкости при рН 8,8 лежит в пре-
делах 0,1 - 0,5 см/ч на 1 В/см. Прямой корреляции между мас-
сой молекулы и величиной и0, очевидно, быть не должно.
В геле трение существенно возрастает, причем тем сильнее,
чем больше масса молекул и меньше средний размер пор, т. е.
чем больше величина Т (для малых значений С). Показано, что
имеет место соотношение: ln(и'/и0) = - kRT. Величина коэффи-
циента торможения kR (порядка 0,1- 0,4) зависит от среднего
радиуса молекулы R и степени сшивки геля С, слабо увеличи-
ваясь с ростом последней в пределах от 1 до 7. Для глобуляр-
ных белков R лежит в диапазоне от 1,57 нм для лактальбумина
(M = 12400) до 3,61 нм для церулоплазмина (M = 151 000).
Для эффективного разделения белков при электрофорезе в
ПААГ соотношение u'/u0 должно составлять 0,1 - 0,2. Отсюда
следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность
белков в ПААГ лежит в пределах 0,01- 0,1 см/ч на 1 В/см. При
напряженности поля 10 - 20 В/см этому соответствуют скорости
миграции белков в диапазоне 0,1 - 2 см/ч. Таким образом, при
рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быст-
рые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее
подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти - сугубо
приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентиров-
ки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения
от них. Например, если заранее известно, что разделяемые бел-
ки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то
можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижно-
стей (и'), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить
время фракционирования в 2 - 3 раза.
Выбор значения Т зависит от природы различия электрофо-
ретических подвижностей белков в геле. Если сильно различа-
ются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более
или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным.
Разделение в этом случае будет происходить только за счет
трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при
этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза
усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой
смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может
оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле
15
при малых значениях Т), т. е. как бы в свободной жидкости,
почти не используя эффект трения молекул о гель. По крайней
мере, это обеспечит выигрыш во времени фракционирования.
Ориентировочно о характере различия электрофоретических
подвижностей двух белков в данных условиях разделения мож-
но судить в том случае, когда известны их молекулярные мас-
сы и изоэлектрические точки, а также содержание в них ионо-
генных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы приблизитель-
но, известны молекулярные массы. Если они различаются не-
значительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на круп-
нопористый гель и попробовать поварьировать рН буфера.
Пожалуй, самый существенный вывод из проведенного каче-
ственного рассмотрения - заключение об определенной свобо-
де выбора концентрации ПААГ и, особенно, содержания в нем
"сшивки" (С в пределах 2 - 5). В любом случае выбор значений
Т должен быть сделан на основе ряда пробных опытов, в кото-
рых, в частности, следует варьировать рН буфера и продолжи-
тельность электрофореза (электрофорез белков в присутствии
додецилсульфата натрия пока не рассматривается).
В качестве сугубо ориентировочной можно рекомендовать
следующую полученную на практике таблицу соответствия мо-
лекулярных масс разделяемых белков (М) и концентраций
ПААГ (Т):
М, тыс.
Дальтон
Т, %
М, тыс.
Дальтон
Т, %
10-40
15-20
100-300
5-10
40-100
10-15
>300
5
Приступая к электрофоретическому фракционированию био-
полимеров, необязательно в точности воспроизводить значения
Т и С, приведенные в литературе для сходного типа эксперимен-
тов, но выбранные однажды условия следует, разумеется, точно
воспроизводить в собственной серии опытов для надежной иден-
тификации и сопоставления положения соответствующих полос.
АГАРОЗА
Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агаро-
зы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макро-
молекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза - это особо
чистая фракция природного линейного полисахарида агара, ко-
торый извлекают из некоторых видов морских водорослей. В по-
лимерной цепи агарозы чередуются ?-D-галактопираноза и 3,6-
ангидро-?-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее состав-
ляет 104 - 105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, пу-
тем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет
водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обра-
зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%.
16
При температурах 84 - 96° (а у специальных типов - уже
при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость -
"плавится". Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агаро-
зы составляет 10 - 15 сП, что примерно соответствует вязкости
50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Рас-
творы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерези-
сом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низ-
ких температурах (36 - 42°). У легкоплавких типов агарозы эта
температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает
манипуляции с расплавленной агарозой - можно не опасаться
преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплав-
ленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают
до 50 - 55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в
формы; это удобно и не связано с возникновением значительных
тепловых деформаций.
Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено
не наличием примесей, а своего рода "кристаллизацией" геля и
свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель
представляет собой не вполне равновесную систему: со време-
нем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость.
Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом - очень
медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует вы-
держивать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины
для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной
камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных
гелей агарозы.
Температуры плавления и гелеобразования зависят от содер-
жания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать
3 - 4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В ага-
розе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их при-
сутствие существенно влияет не только на температуры плавле-
ния и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.
В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают силь-
но выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эн-
досмоса, сущность которого сводится к следующему.
Отрицательно заряженные остатки серной кислоты непо-
движно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствую-
щие им положительные ионы, напротив, находятся в водной фа-
зе и под действием электрического поля мигрируют в направле-
нии катода. Их место занимают катионы, поступающие из анод-
ного буфера. Возникает дополнительный ток сильно гидратиро-
ванных катионов, которые увлекают за собой всю массу жидко-
сти, находящейся внутри геля, и вместе с ней - растворенные в
водной фазе геля макромолекулы. Они "дрейфуют" вместе с
жидкостью, и это движение накладывается на их миграцию под
действием электрического поля.
В большинстве случаев электрофорезом в агарозе разделя-
ют отрицательно заряженные макромолекулы, мигрирующие к
аноду. Эндосмос направлен в противоположную сторону и ухуд-
17
Рис. 4. Влияние эндосмоса в агарозном геле на характер
фракционирования двунитевых ДНК одинакового разме-
ра [Johnson et al., 1980]
1 - сверхскрученная ДНК; 2 - линейная; 3 - кольцевая; сте-
пень эндосмоса увеличивается слева направо
шает разделение. Ввиду этого агарозу под-
вергают специальной очистке, и содержание
иона сульфата в продажных препаратах не
превышает 0,5%. Типы агарозы, отличающие-
ся слабо выраженным эндосмосом, содержат
менее 0,3% сульфата. В случае необходимо-
сти можно провести дополнительную очистку
агарозы от сульфата обработкой 1 М NaOH
в 0,05%-ном боргидриде натрия и переосаж-
дением 50%-ным этанолом [Lonnerdal, Laas, 1976].
Насколько существенно эндосмос может влиять на резуль-
таты электрофореза, видно из данных Джонсона и др. [John-
son et al., 1980]. Авторы использовали три типа агаро-
зы с различной способностью к эндосмосу (значения -mr со-
ставляли соответственно 0,081, 0,175 и 0,441; см. ниже). В одном
и том же опыте на параллельных полосках 1%-ной агарозы
этих типов они разделяли смесь трех форм репликативной ДНК
фага ФХ 174-сверхскрученной, кольцевой и линейной. С усиле-
нием эндосмоса не только происходило сильное замедление ско-
рости миграции всех ДНК (более чем втрое), но и (что хуже)
менялось взаимное расположение полос (рис. 4). По-видимому,
различные формы ДНК увлекаются потоком эндосмоса по-раз-
ному.
Наличие заряженных сульфогрупп иногда обусловливает
еще и неспецифическую сорбцию белков на агарозе, в результа-
те чего полосы расплываются с образованием "хвостов".
Степень эндосмоса количественно оценивают с помощью ко-
эффициента относительной миграции (-mr). Знак "минус" здесь
только напоминает о том, что за счет эндосмоса нуклеиновые
кислоты "сносит" в сторону, противоположную направлению их
миграции. Коэффициент представляет собой отношение скоро-
стей миграции незаряженного полимера (за счет только эндос-
моса) и сходного с ним по структуре полианиона при электро-
форезе в агарозе данного типа. Для обозначения типов агарозы
ниже будет использована номенклатура фирмы "Miles". По дан-
ным каталогов, в частности по значениям -mr ее нетрудно сопо-
ставить с обозначениями других фирм, тем более что большин-
ство из них получает свои препараты от одного и того же произ-
водителя - фирмы "Marine Colloids Inc.".
Для агарозы с малой степенью эндосмоса (тип LE) -mr=
= 0,1 - 0,15. Для агарозы типа НЕ характерен сильно выражен-
ный эндосмос (-mr = 0,23 - 0,26). Агароза типа ME занимает
промежуточное положение (-mr = 0,15 - 0,2). Чем меньше в ага-
18
розе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростати-
ческого отталкивания между молекулами полимера и выше их
способность к связыванию водородными связями. Агароза с по-
вышенными температурами плавления и гелеобразования (тип
НGТ) имеет -mr < 0,1; именно она чаще всего используется
для обычного электрофореза. Вместе с тем специальная техно-
логическая обработка (введение оксиэтильных групп) позволя-
ет получать агарозу с малой степенью эндосмоса и пониженны-
ми температурами плавления и затвердевания - тип LGT ("Sea
plaque" по номенклатуре фирмы "Marine Colloids"). Такая ага-
роза может быть полезна тем, что ее 1%-ный раствор остается
жидким при физиологической температуре (37°); кроме того,
плавление геля можно осуществить при температуре более низ-
кой, чем температура денатурации ДНК. Наконец, для иммуно-
электрофореза, при котором иммуноглобулины мигрируют к ка-
тоду и эндосмос способствует, а не препятствует их разделению,
была разработана специальная агароза типа НЕЕО с сильно вы-
раженным эндосмосом (-mr > 0,3). Этого удалось добиться не
за счет увеличения числа сульфатов, содержание которых по-
прежнему не превышает 0,3%, поэтому неспецифическая сорб-
ция белков на агарозе этого типа почти не происходит.
Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лио-
филизированного порошка. Для приготовления геля выбранной
концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем
буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термо-
стате при 90-95° около 2 ч для образования истинного раство-
ра полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обрат-
ным холодильником.
Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смеши-
вают с раствором агарозы в горячем виде (при 50 - 60°). Они
не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду,
что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водород-
ные связи, несколько затрудняет образование геля. Например,
гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при
75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980].
Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию ага-
розы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза
готовят путем заливки дозированного объема расплавленной
агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нуж-
ного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером
имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.
Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, дик-
туется размерами фракционируемых макромолекул. Средний
размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответству-
ет диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с
массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием
агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе
поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биопо-
лимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом
19
поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют ага-
розные гели с концентрацией 0,4 - 2%. Ниже для ориентировки
представлены примерные концентрации гелей агарозы (в %)
для некоторых распространенных объектов фракционирования:
Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид 0,4
Рестрикты ДНК (5 - 20 тыс. пар оснований) 0,7
мРНК, денатурированная обработкой метилртутью 1,0
Реовирусная двунитевая РНК (500 - 5000 пар оснований) 1,5
Рибосомная РНК 1,75
Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100 - 1000 пар оснований) 2,0
Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей
агарозы охлаждают до 50° и выдерживают не менее 1 ч в тер-
мостате при данной температуре. Это необходимо для полного
выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем
обеспечивается одновременное застывание всего геля и одно-
родность его структуры.
СМЕШАННЫЙ ГЕЛЬ (АГАРОЗА+ПААГ)
Электрофорез крупных белков иногда бывает целесообразно
вести в крупнопористом ПААГ, содержащем 1,5 - 2,5% акрила-
мида. Для придания прочности такому гелю его полимеризуют
совместно с 0,5 - 0,6% агарозы. Имеет место своеобразный "сим-
биоз": чистая 0,5%-ная агароза, застывая, дает очень мягкий
гель, 2%-ный ПААГ не удается даже заполимеризовать, а их
комбинация образует гели с отличными механическими характе-
ристиками.
Пространственная сетка агарозы в силу указанных выше
причин имеет гораздо более крупные поры, чем полимеризую-
щийся внутри этой сетки ПААГ, и мало влияет на электрофоре-
тическую подвижность белков, зато образует жесткий каркас,
придающий необходимую прочность гелю в целом. Для образо-
вания такой структуры надо обеспечить условия, при которых
агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ. Ис-
ходя из этого, подбирают концентрацию персульфата аммония
и ТЕМЕД.
Агарозу растворяют в буфере с учетом последующего раз-
бавления, прогревают, как описано выше, и выдерживают в те-
чение часа при 50°. При этой же температуре добавляют соот-
ветствующий раствор мономеров акриламида, быстро деаэри-
руют смесь, вносят инициирующие добавки и немедленно зали-
вают между подогретыми до 37° стеклами. Сначала застывает
агароза; полимеризация акриламида обнаруживает себя появ-
лением границы, лежащей на 2 - 5 мм ниже края геля агарозы.
Для обеспечения формирования узкой начальной полосы пре-
парата при вступлении его в гель имеет смысл спустя час после
окончания полимеризации ПААГ снять одну стеклянную пла-
стину и обрезать гель ниже границы полимеризации акрилами-
да. Затем можно снова наложить пластину, зажать гель и за-
<< Пред. стр. 3 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу