<< Пред. стр. 4 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
20
лить поверх него 0,3%-ную чистую агарозу, в которой и форми-
ровать "карманы" для внесения препаратов [Schwinghamer,
Shepherd, 1980].
В качестве примера можно назвать успешное разделение пу-
тем электрофореза в смешанном геле (1,7% ПААГ + 0,5 агаро-
зы) полисом печени мыши от мономеров до пентамеров [Nishi-
naga, Yamamoto, 1980].
АЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНАЯ ПЛЕНКА,
ИМПРЕГНИРОВАННАЯ ПААГ
Вместо агарозы можно использовать жесткую, крупнопори-
стую пространственную сетку ацетатцеллюлозы. Полоску этого
полимера сначала помещают на поверхность раствора, где она
смачивается, а затем погружают в раствор мономеров акрила-
мида с инициирующими добавками. ПААГ полимеризуется во
всем объеме раствора, а также полоски целлюлозы. По оконча-
нии полимеризации гель с поверхности полоски можно отслоить
и отмыть. Таким способом нетрудно получить "пластинку" тол-
щиной 0,1 мм. Конец полоски следует оставить свободным от ге-
ля (не погружать). На него удобно наносить исходный белковый
препарат, который легко впитывается в ацетатцеллюлозу [Fren-
kel, Blagrove, 1978].
Глава 2
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГЕЛЕЙ
И АППАРАТУРА
Рассмотрим основные технические приемы приготовления
и использования гелей для электрофореза. Это рассмотрение
целесообразно провести отдельно для трех вариантов аналити-
ческого электрофореза: вертикального в трубках, вертикально-
го в пластинах и горизонтального в пластинах. Приемы препа-
ративного электрофореза будут рассмотрены отдельно. Методы
подготовки препаратов, выбора буферов и различных добавок к
ним, а также условий протекания самого процесса электрофоре-
за будут детально исследованы далее, в главах 3 и 4, посвящен-
ных описанию различных вариантов электрофоретического
фракционирования белков и нуклеиновых кислот.
ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ТРУБКИ
Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то пре-
имущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом
его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность ге-
ля. Затруднения при вертикальном расположении могут возни-
21
Рис. 5. Прибор для электрофореза
в вертикальных трубках (в разре-
зе)
1 - верхний электродный резервуар;
2 - центральный цилиндр; 3 - верхний
платиновый электрод; 4 - резиновая
прокладка; 5 - трубочка с гелем; 6 -
нижний электродный резервуар; 7 -
нижний платиновый электрод
кать для гелей, недостаточно прочно сцепленных со стеклом (см.
выше). Под действием собственного веса они могут постепенно
сползать вниз. Реальные трудности такого рода возникают,
главным образом, в случае препаративного электрофореза, ког-
да соотношение поверхности и объема колонок геля способству-
ет его сползанию.
Все приборы с вертикальным расположением гелей конструк-
тивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположени-
ем, так как верхний электродный резервуар должен быть под-
нят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах
сочленения его с трубками или пластинами. В приборах с труб-
ками для уплотнения обычно служат резиновые кольцевые про-
кладки, укрепленные в отверстиях на дне верхнего резервуара.
Схема такого прибора показана на рис. 5.
Трубки (12 - 18 штук) с уже заполимеризованным в них ге-
лем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верх-
ние концы выступали над дном резервуара. Если используют не
все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе
с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на
нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором рас-
стоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар элек-
тродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки оказы-
ваются почти полностью погруженными в буфер. Это делается
для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза С этой
же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой
или вводят дополнительную систему с циркуляцией охлаждаю-
щей воды. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной
формы изготавливают из плексигласа, что позволяет следить за
продвижением фронта красителя в процессе электрофореза.
В резервуарах должны быть закреплены электроды из платино-
вой проволоки. Нижний электрод при этом должен располагать-
22
ся так, чтобы поднимающиеся от него пузырьки газа не попада-
ли на нижние торцы трубок, что создавало бы помехи протека-
нию через них тока. Объемы электродных резервуаров доста-
точно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изменял-
ся под влиянием продуктов электролиза.
Стеклянные тонкостенные трубки, в которых ведут электро-
форез, чаще всего имеют внутренний диаметр 5 - 6 мм и длину
около 10 см. Фирма "Bio-Rad" в своем приборе модели 155 пред-
лагает широкий набор трубок с внутренним диаметром от 2 до
14,6 мм и длиной от 7,5 до 30 см. Их можно монтировать в пяти
сменных верхних резервуарах. Торцы трубок отшлифованы. При
изготовлении трубок в лаборатории не следует оплавлять их в
пламени горелки во избежание образования незаметного на
глаз сужения, которое будет мешать извлечению геля после
окончания электрофореза.
Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок за-
клеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают
их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор моно-
меров сразу после добавления и надежного смешивания с ним
раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из
пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний
участок трубки, предназначенный для внесения препарата, ос-
тавался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или
изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем
разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза
(см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабо-
чего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером
верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой
раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него
воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем
в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают
верхним электродным буфером.
Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный ре-
зервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее
конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает элек-
тродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой
с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препа-
рат, в который добавляют предварительно 5 - 10% сахарозы.
Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхно-
сти геля; препарат должен выливаться с высоты 2 - 3 мм над
гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей
повышенной плотности. При любом варианте электрофореза на-
до быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от
взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соби-
раться на торце геля и нарушать однородность тока по его сече-
нию, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон.
В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить
центрифугированием.
23
Рис. 6. Система для обра-
зования линейного градиен-
та концентрации ПААГ в
трубках
1 - пачка трубок; 2 - перисталь-
тический насос; 3 - смеситель
градиента
Выше уже упоминалось о возможности использования гра-
диента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по
высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведе-
ны соображения, касающиеся подбора концентраций иниции-
рующих добавок в этом случае. Преимущества таких "градиент-
ных" гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиент-
ных гелей используют такие же смесительные устройства, как
при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацент-
рифугирования. В этом случае также можно получать линейные
и нелинейные градиенты, "выпуклые" и "вогнутые", в том чис-
ле экспоненциальные.
В смеситель можно поместить раствор мономеров с макси-
мальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительно-
го устройства - соответственно разбавленный раствор. Затем
можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно цен-
трифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду ма-
лого объема трубки (2 - 4 мл). Кроме того, почти всегда жела-
тельно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой
градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку
параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее ре-
зинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, что-
бы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном,
Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из
трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6)
Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе гради-
ентного устройства должен находиться раствор мономеров ма-
лой концентрации, а в резервуаре - концентрированный рас-
твор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере
поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно
увеличивалась одновременно с повышением содержания акри-
ламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концент-
рированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения
в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально
необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше на-
чинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, нахо-
дящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.
24
Следует помнить о необходимости промывки смесительного
устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после
окончания их использования, до того как в них произойдет по-
лимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему
нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подво-
дящую к нему трубку.
По окончании полимеризации всю пачку трубок следует из-
влечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и
обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя техни-
чески и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за
счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора
мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lo-
rentz, 1976].
В описанном приборе для вертикального электрофореза элек-
трическая цепь надежно замыкается непосредственными кон-
тактами обоих концов трубок с электродными буферами. Одна-
ко надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было
пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения тру-
бок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струёй жид-
кости, направленной из шприца с согнутой иглой.
По окончании электрофореза гель из трубки извлекают.
В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и
затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов
трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от
ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с дру-
гого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленно-
го несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель
отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 - 1% какого-
нибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю
возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над кото-
рым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удале-
ния геля из очень длинных трубок по его периферии с концов
трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой
из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой кон-
центрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а
трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему
путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно
съеживается и отстает от стенки.
Основным недостатком электрофореза в трубках является
затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси ге-
ля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к
стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответствен-
но окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвиж-
ность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотво-
да можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах
диаметром 0,7 - 1,5 мм [Condeelis, 1977].
25
ВЕРТИКАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Для электрофореза белков обычно используют пластины
шириной 8 - 14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8 -
28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, на-
пример при секвенировании, нередко ведут в больших пласти-
нах размером 33 ? 43 см, что диктуется максимальным размером
рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гид-
ролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины
ПААГ длиной 90 см [Pirtle et al., 1980].
Полимеризацию акриламида или застывание агарозы, а за-
тем и сам электрофорез ведут в форме, образованной двумя
пластинами зеркального стекла толщиной 5 - 6 мм. Расстояние
между пластинами задается толщиной прокладок из тефлона
или плексигласа ("спейсеров") и определяет толщину геля.
Прокладки шириной 10 - 15 мм устанавливают вдоль боковых
краев стекол. Для аналитических целей, как правило, исполь-
зуют пластины геля (и соответственно прокладки) толщиной от
0,4 до 1,5 мм. Эти же прокладки можно использовать и для уп-
лотнения формы во время нахождения в ней еще не затвердев-
шего геля. Для этого устанавливают еще одну прокладку точно
такой же толщины (фрезеровать совместно!) по нижнему краю
стекол и плотно прижимают ее к фрезерованным торцам боко-
вых прокладок.
Хорошо подогнанные тефлоновые прокладки в силу гидро-
фобности материала можно не смазывать. Прокладки из плек-
сиглаза смазывают силиконовой смазкой. Тонкий валик смазки
из шприца без иглы наносят сначала с одной стороны трех хоро-
шо промытых детергентом прокладок (примерно посередине), а
также на нижние торцы двух из них (боковых). Боковые про-
кладки накладывают на одно из стекол формы смазкой вниз и
к ним вплотную придвигают так же уложенную нижнюю про-
кладку. Руками (в перчатках) прижимают прокладки к стеклу,
следя за тем, чтобы смазка не выдавливалась из-под них в по-
лость формы. На образовавшуюся таким образом П-образную
прокладку снова так же наносят сплошной валик смазки по все-
му периметру и накладывают второе стекло. Всю систему зажи-
мают по трем сторонам пружинными зажимами для бумаг.
При заливке агарозы уплотнение формы можно осуществить
проще - заклеить торцы стекол липкой лентой (лейкопласты-
рем). Нижнюю прокладку при этом можно не устанавливать.
Уплотнение не будет совершенным, но агароза в контакте с про-
кладками и лентой быстро застынет и заметного ее вытекания
не произойдет. Для надежности можно сначала залить неболь-
шой слой агарозы и дать ей застыть в нижней части формы, а
потом залить остальной ее объем.
Описано применение в качестве прокладки П-образной по-
лоски силиконовой резины с разрезом, позволяющим отнимать
ее нижнюю часть после полимеризации геля. Такая прокладка
26
не нуждается в смазке [Stein, Varricchio, 1974]. Можно вместо
нижней прокладки сделать в нижней части формы "пробку" из
ПААГ повышенной концентрации. Для этого собранные с боко-
выми прокладками пластины (или пачку пластин) устанавлива-
ют в корытце, заполненное раствором мономеров с инициирую-
щими добавками, так, чтобы заполнить нижнюю часть формы
на высоту 1 см и захватить при этом концы боковых прокладок.
Для успешной полимеризации на раствор мономеров наслаива-
ют воду. После полимеризации геля во всем объеме корытца и
внутри формы пластины вынимают и лишний ПААГ обрезают.
Перед заливкой рабочего геля следует отсосать воду над проб-
кой и промыть поверхность буфером геля. Фирма "Bio-Rad"
<< Пред. стр. 4 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу