<< Пред. стр. 5 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
предлагает для заливки пластин геля простое устройство, по-
зволяющее с помощью винтов прижать собранные с боковыми
прокладками стекла нижними торцами к полоске мягкой рези-
ны. Иногда, особенно для гелей толщиной менее 1 мм, нижнее
уплотнение осуществляют просто пластилином.
Собранную и уплотненную одним из описанных способов
форму устанавливают вертикально и заливают в нее раствор
мономеров ПААГ или расплавленную агарозу. Впрочем, ПААГ
толщиной 0,4 мм можно заливать в наклонном, а полимеризо-
вать - в горизонтальном положении пластин. Это значительно
упрощает задачу герметизации формы: достаточно оклеить ее
по торцам пластин водостойкой липкой лентой.
В аналитических опытах на каждой пластине обычно ведут
электрофорез нескольких препаратов, состав которых можно за-
тем сопоставить при идентичных условиях разделения. Как бы-
ло показано на фотографии (см. рис. 3), сопоставляемые препа-
раты фракционируют в параллельных друг другу "треках".
В ходе полимеризации на верхнем крае геля формируют ряд
одинаковых углублений прямоугольной формы - "карманов",
куда затем и вносят различные препараты. Для этого в еще не
заполимеризовавшийся гель или горячую агарозу вставляют
"гребенку" из тефлона или плексигласа такой же или чуть мень-
шей толщины, чем прокладки между стеклами. Прямоугольные
зубцы гребенки и формируют карманы для препаратов. На рис.
7 изображена собранная форма с вставленной в гель гребенкой.
На боковом сечении можно видеть, что верхняя часть гребенки
немного толще, чем нижняя (с зубцами). Это удобно, так как
гребенка ставится каждый раз одинаково и ровно - до упора
выступа о торец стеклянной пластины. Кстати, на рис. 7 показа-
ны и прокладки (пунктир). Можно заметить, что нижнюю про-
кладку делают чуть длиннее ширины стекол, так что ее концы
выступают наружу. За эти концы нижнюю прокладку и выни-
мают из формы после застывания геля. Для ясности на чертеже
показаны только три зажима (с правой стороны пластин).
Гель или агарозу заливают между пластинами с таким рас-
четом, чтобы при опускании гребенки до упора жидкий гель за-
полнил промежутки между ее зубцами. Гребенку начинают
27
вставлять с некоторым переко-
сом, чтобы под ее зубцами не за-
держивались пузырьки воздуха.
Для этой цели торцы зубцов
предварительно смачивают, по-
терев их о стекло с налитым на
него раствором акриламида.
В тех случаях, когда готовят
двухслойный гель, по окончании
полимеризации нижнего геля во-
ду отсасывают, поверхности про-
мывают буфером верхнего геля,
заливают этот последний и уже
в него устанавливают гребенку.
Рис. 7. Форма для полимеризации
вертикальной пластины геля
1 - стеклянные пластины; 2 - прокладки;
3 - гребенка; 4 - зажим
Когда гель готов, вынимают
нижнюю прокладку или снимают
липкую ленту и осторожно вы-
таскивают гребенку. При работе
с концентрированным ПААГ гель может прилипать к зубцам
гребенки и нижние плоскости карманов могут оказаться не-
ровными. Это ухудшает условия формирования исходных полос
в геле.
В таком случае имеет смысл ввести еще один слой геля
пониженной концентрации и гребенку устанавливать в него. На
границе между двумя слоями разной пористости полоса ис-
ходного препарата будет выгодным образом сужаться.
Перегородки между близко расположенными карманами в
агарозе малой концентрации могут оказаться непрочными. Опи-
сан вариант формы, в которой одну из пластин изготавливают из
плексигласа с рядом фрезерованных узких перегородок в ее
верхней части, выступающих на всю толщину зазора между пла-
стинами. Гребенку вставляют между этими перегородками, но
не на всю их длину. Зубцы гребенки хорошо подогнаны по ши-
рине интервалов между перегородками, так что форма оказыва-
ется уплотненной с ее будущего верхнего края. Перевернув фор-
му, заливают агарозу с противоположной стороны. После за-
стывания агарозы и удаления гребенки карманы для препаратов
оказываются разделенными перегородками из плексигласа, кон-
цы которых погружены в гель [Sugden et al., 1975].
Для получения пластин с градиентом пористости геля по вы-
соте используют те же приемы, что описаны выше. Для одной
пластины смесь подают на дно формы через тонкую стеклянную
трубку, прижатую к боковой прокладке. Разумеется, в этом слу-
чае смеситель градиентного устройства должен содержать смесь
мономеров малой концентрации, а резервуар - более концент-
рированную смесь с добавкой сахарозы. Чтобы не нарушить гра-
диента при вынимании трубки, ее можно оставить в полимери-
зующемся геле.
28
Возможно одновременное заполнение целой стопки открытых
снизу форм для геля (без нижних прокладок), которое проводят
в сосуде прямоугольной формы, как описано выше для пучка
трубок. Фирма "Pharmacia" (Швеция) предлагает для этой це-
ли специальный сосуд прямоугольного сечения, где два любых
набора могут быть зажаты с помощью клиньев, скользящих по
двум наклонным плоскостям. Градиент концентрации акрила-
мида подают на дно каждого из двух отделений сосуда через
отдельные штуцеры. На фотографии (рис. 8) в сосуд установле-
на только одна пачка пластин. Бесполезный расход акриламида
и загрязнение им пластин снаружи при использовании такого
сосуда сведены до минимума. Подобного рода устройство из
плексигласа для пластин любого размера легко изготовить в ла-
боратории. Кстати, в нем удобно заливать и обычные, не гра-
диентные гели. Еще проще стопку пластин с боковыми проклад-
ками безо всякой герметизации поместить в полиэтиленовый
мешок, плотно обернуть его вокруг пластин, зажать всю стопку
и залить обычный гель прямо в мешок. После полимеризации
мешок снимают, а излишки геля с нижних концов пластин обре-
зают [Kerckaert, 1978].
Линейный градиент пористости геля в пластине или трубках
можно создать смешиванием двух слоев растворов мономеров
разной концентрации путем многократного переворачивания
пластины или трубок в наклонном положении.
В литературе описано много конструкций приборов для
электрофореза в вертикальных пластинах. Ряд моделей предла-
гают различные фирмы. Наибольшее распространение получила
конструкция прибора из плексигласа, предложенная Стадиером
(рис. 9) [Studier, 1973]. Ее легко реализовать и в лабораторных
условиях. Верхний и нижний электродные резервуары прямо-
угольной формы соединены вертикальной стенкой, в которой
имеется вырез, ведущий в полость верхнего резервуара. Такой
же вырез имеет одна из двух стеклянных пластин, между кото-
рыми полимеризуется гель. Пластины прижимают пружинными
зажимами к вертикальной стенке так, чтобы оба выреза совпа-
ли. Буфер в верхний резервуар заливают до такого уровня, что-
бы он через вырез покрывал верхний торец геля. При этом вто-
рая, не вырезанная, стеклянная пластина выступает в роли пе-
редней стенки резервуара. В месте совмещения двух вырезов,
между стеклянной пластиной и стенкой, должно быть осущест-
влено уплотнение, препятствующее вытеканию верхнего буфера.
Стадиер использовал для этой цели заливку агаром. Фирма
"Bio-Rad" в своих моделях 220 и 221 использует ту же конструк-
цию, но обеспечивает уплотнение с помощью резиновой про-
кладки.
В оба резервуара вмонтированы электроды из платиновой
проволоки. При установке в прибор форму с гелем частично по-
гружают в буфер нижнего резервуара, так что она опирается
там на разнесенные по сторонам выступы и ее нижний торец
29
Рис. 8. Сосуд для формирования градиента концентрации ПААГ в пластинах
(фирмы. "Pharmacia")
Рис. 9. Прибор Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Stu-
dier, 1973]
30
оказывается приподнятым над дном резервуара. После погру-
жения надо внимательно проверить, не осталось ли между пла-
стинами и на торце геля пузырьков воздуха. Их можно удалить
струёй жидкости из согнутой иглы шприца.
Препараты с добавленной в них сахарозой или глицерином
вносят в карманы геля после окончательной сборки прибора
так же, как и в трубки, т. е. подслаивают их под электродный
буфер на дно каждого из карманов. Их можно заполнять пре-
паратом (постепенно поднимая кончик пипетки) почти на пол-
ную высоту. Приемы заполнения были описаны выше.
Недавно был предложен очень простой, целиком (включая
пластины для геля) изготовленный из плексигласа прибор для
вертикального электрофореза в пластинах [Broadmeadow, Wil-
се, 1979]. В нем используется схема Стадиера, но пластины по
всей высоте омываются и охлаждаются с обеих сторон элект-
родным буфером. Верхний и нижний буферы непрерывно пере-
мешиваются и охлаждаются, проходя через находящийся вне
прибора змеевик. Этим компенсируется худшая, чем у стекла,
теплопередача через плексиглас. Для гелей малой концентрации
этот прибор, по-видимому, непригоден ввиду относительно сла-
бого сцепления ПААГ с плексигласом.
Некоторые фирмы используют для пластин такой же способ
установки в прибор, что и для трубок. Пластины вставляют
снизу через прорези в дне верхнего электродного резервуара.
Уплотнение осуществляют при помощи резиновых прокладок
прямоугольного сечения. Собранные формы с гелем закрепляют
за счет трения в прорезях прокладок ("Bio-Rad", "Pharmacia")
либо прижимают к ним шлифованными торцами ("Desaga").
В любом случае пластины должны быть изготовлены точно, по-
этому приходится ограничиваться использованием фирменных
пластин и гелей определенной толщины.
Необходимость интенсивного теплоотвода от большой по-
верхности пластин заставляет некоторые фирмы вводить в при-
бор для электрофореза змеевик с охлаждающей жидкостью и
насос, обеспечивающий циркуляцию электродных буферов.
Впрочем, в случае тонких гелей воздушное охлаждение оказы-
вается вполне достаточным. Протекающий ток нагревает гель до
некоторой равновесной температуры, но в тонком слое геля эта
температура оказывается практически одинаковой по всему его
сечению. Именно это обстоятельство является решающим для
обеспечения хорошего качества разделения.
В приборе Стадиера можно обойтись и без вырезов в стенке
и пластине, а также без уплотнения, если электрическую цепь
между верхним буфером и гелем замкнуть через смоченные тем
же буфером фитили из фильтровальной бумаги [De Wachter, Fi-
ers, 1971]. Конструкция прибора становится совсем простой, и
отпадает необходимость делать вырезы в стеклянных пластинах.
Тем не менее этот способ нельзя рекомендовать во всех случаях
аналитического электрофореза, так как он имеет один недоста-
31
ток: открытые фитили могут неконтролируемым образом не-
сколько обсыхать. Это приводит к изменению их электрического
сопротивления, а следовательно, напряжения и тока, текущего
через гель (см. ниже).
По окончании электрофореза пластины разнимают, отслаи-
вая одну из них от геля с помощью шпателя. Его всовывают
между пластинами со стороны карманов и слегка поворачива-
ют. Эту операцию не следует форсировать; лучше сначала прой-
ти шпателем с легким нажимом вдоль всего края пластины, на-
блюдая за тем, как между стеклом и гелем постепенно прони-
кает воздух, а потом уже приподнять пластину. Со второй пла-
стины гель снимают руками и переносят в ванночку для фикса-
ции или окраски. Хотя всегда есть возможность поднять гель с
пластины за "нерабочий" конец, лучше все же работать в пер-
чатках. Случайное прикосновение кожи рук к рабочей поверх-
ности геля при современных чувствительных методах окрашива-
ния может оставить на геле артефактное белковое пятно. При
авторадиографии влажный гель, лежащий на одной пластине,
можно прямо заворачивать в полиэтиленовую пленку.
ГОРИЗОНТАЛЬНО РАСПОЛОЖЕННЫЕ ПЛАСТИНЫ
Преимущество такого расположения - не только в компакт-
ности прибора, но и в отсутствии проблемы уплотнения. Оба
электродных буфера находятся в резервуарах, расположенных
ниже уровня горизонтального столика, на который кладут гель.
Естественно, что этот столик используется и для отвода тепла
от пластинки геля - в его каналах циркулирует охлаждающая
вода.
Гель, полимеризованный на тонкой стеклянной пластинке,
помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку
препарат вносят не с торца геля, а в ряд специальных "колод-
цев", расположенных на некотором расстоянии от его края.
Электрическая цепь замыкается через 8 - 10-слойные фитили из
фильтровальной бумаги, одним концом погруженные в элект-
родные резервуары, а другим - прижатые к гелю с перекрытием
в 10 - 12 мм (рис. 10, 11). При наложении фитилей на гель сле-
дует внимательно следить за отсутствием воздушных пузырей
между ними.
Показанные на рис. 10 перегородки в электродных камерах
препятствуют конвекционному переносу продуктов электролиза
от электродов к концам фитилей. В ходе электрофореза на ано-
де образуется свободная кислота, а на катоде - щелочь, кото-
рые по плотности отличаются от электродных буферов, а это
может вызвать конвекцию. Если электрофорез идет более 24 ч,
электродные буферы следует заменять. Если же они одинаковы
и между электродными резервуарами обеспечена циркуляция
жидкости, то кислота и щелочь взаимно нейтрализуются - и бу-
фер можно не заменять. В изображенном на схеме приборе
32
"Мультифор" (LKB, Швеция) циркуляция буфера не преду-
смотрена, но объем каждой камеры составляет 1,2 л.
Во избежание подсыхания фитилей и геля прибор во время
работы закрывают прозрачной крышкой (рис. 12), которую ино-
гда называют антиконденсационной. Она предохраняет гель в
случае существенного охлаждения от конденсации на его поверх-
ности влаги из окружающего воздуха. Впрочем, сама крышка
изнутри может запотевать за счет влаги, испаряющейся с фити-
лей, особенно в случае их перегрева. Это ухудшает условия на-
блюдения за ходом электрофореза, поэтому в аналогичном по
конструкции приборе фирмы "Bio-Rad" (модель 1415) по пери-
метру крышки у ее краев с внутренней стороны проходит трубка
с охлаждающей водой. Пары влаги конденсируются на трубке,
оставляя крышку прозрачной. Электродные резервуары у этого
прибора съемные, что облегчает их промывку. В качестве фити-
лей используется специально обработанная целлюлоза с повы-
шенной влагоемкостью.
Рис. 10. Схема прибора "Муль-
тифор" для электрофореза в
горизонтальных пластинах
(фирмы LKB)
1 - антиконденсационная крышка;
2 - электродный резервуар; 3 - ко-
лодец для внесения препарата; 4 -
гель; 5 - фитиль; 6 - охлаждающий
столик
Рис. 11. Наложение фитилей
на гель в приборе "Мульти-
фор"
33
Рис. 12. Наложение антиконденсацион- Рис. 13. Внесение препарата в ко-
ной крышки лодцы геля
<< Пред. стр. 5 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу