<< Пред. стр. 6 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
Описанные приборы не предъявляют строгих требований к
качеству полимеризации геля у его краев, поскольку края геля
не участвуют в электрофорезе. Полимеризацию пластины ПААГ
для прибора "Мультифор" ведут в форме, уплотненной по всем
четырем краям сплошной резиновой прокладкой. У одного из
своих углов она разрезана, и через этот разрез, слегка отогнув
прокладку, заливают раствор мономеров в форму. Последняя
образована двумя пластинами: стеклянной (толщиной 1 мм) и
толстой плексигласовой. На стеклянной пластине гель остается
во время электрофореза. Пластину из плексигласа после поли-
меризации геля снимают; на ней имеется ряд прямоугольных
выступов, которые при заливке формируют колодцы для внесе-
ния препаратов. Колодцы имеют фиксированный объем (для
"Мультифора" - 5 и 10 мкл). В таком же объеме надо вносить
и препарат, чтобы он заполнял все сечения геля, но не разли-
вался по его поверхности. Для этого препарат дозируют микро-
шприцем (рис. 13).
При сборке формы на стеклянную пластину накладывают
еще одну толстую пластину из плексигласа и все вместе зажи-
мают пружинными зажимами. Здесь нет необходимости наслаи-
вать воду, да и к материалу уплотнительной прокладки можно
не предъявлять высоких требований, поскольку в контакте с ней
гель может и не заполимеризоваться. После освобождения геля
оставшийся раствор мономеров по его краям можно убрать филь-
тровальной бумагой. Для облегчения разборки формы ее сле-
дует охладить в холодильнике.
Перед использованием ПААГ желательно выдержать не ме-
нее 12 ч обернутым в полиэтиленовую пленку во избежание под-
сыхания. Гели, содержащие додецилсульфат натрия (ДДС-Na),
34
не следует хранить в холодильнике, так как ДДС-Na мо-
жет выпасть в осадок. При установке пластины с гелем на ох-
лаждающий столик следует налить на него несколько милли-
литров раствора детергента, чтобы обеспечить хороший тепловой
контакт между столиком и пластиной. До этого имеет смысл про-
вести на столике водонесмываемым фломастером две линии на
расстоянии примерно 15 - 20 мм от каждого из противополож-
ных краев. Эти линии будут видны через гель и помогут ровно
уложить края фитилей, что немаловажно для создания в геле
однородного электрического поля.
Следует быстро вносить препараты в колодцы и сразу же
начинать электрофорез, так как бромфеноловый краситель
склонен диффундировать в геле. В процессе разделения нужно
следить за тем, чтобы колодцы с оставшимся в них буфером пре-
парата не обсыхали. Это нежелательно, так как искажает рас-
пределение тока по сечению геля. В ходе электрофореза можно
пополнять колодцы буфером или с самого начала добавить в
препарат 10-20% глицерина.
После электрофореза можно хранить гель на том же стекле,
обернув его целлофаном, или предварительно перенести на ме-
таллическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную
бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На
этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно
и высушить.
Пластины для горизонтального электрофореза в агарозе
можно приготовить чрезвычайно просто. На горизонтально ус-
тановленную (по уровню) плоскость кладут тонкое стекло опре-
деленного размера и на него выливают расплавленный раствор
агарозы в буфере. Его объем надо рассчитать или подобрать
так, чтобы получить пластину нужной толщины. Колодцы для
препаратов в этом случае можно и не делать. Фирма LKB реко-
мендует наносить препараты прямо на поверхность агарозы че-
рез прорези наложенного на пластину специального шаблона со
щелями. Препарат объемом 2 - 4 мкл вносят в щель шаблона,
откуда он полностью впитывается в агарозу. Впрочем, сравни-
тельно простое приспособление, смонтированное на столике для
заливки, позволяет установить над пластиной (перпендикулярно
к ее плоскости) гребенку и с ее помощью при заливке агарозы
образовать колодцы для препаратов. Перед использованием
пластину агарозы тоже следует выдержать во влажной атмосфе-
ре в течение суток.
При электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозе использу-
ют относительно большие токи, которые могут нагревать фити-
ли из фильтровальной бумаги. Было предложено фитили делать
тоже из агарозы - заливкой ее 1 - 2%-ного раствора в специ-
альные камеры; описаны конструкции соответствующих прибо-
ров [Kaplan et al., 1977; McDonell et al., 1977; Herrick, 1980].
На рис. 14 показан разрез одного из таких простых приборов.
В приборе фирмы "Bio-Rad" (модель 1415) фитилями из 0,5%-
35
Рис. 14. Прибор для препа-
ративного горизонтального
электрофореза ДНК в ага-
розном геле с агарозными
фитилями
1 - электродные резервуары; 2 -
форма для заливки агарозы;
3 - съемные перегородки; 4 -
гребенка
ного геля агарозы толщиной 6 мм оснащены специальные мо-
стики, на которых можно вести препаративный электрофорез
ДНК в пластинах геля агарозы толщиной до 1 см.
Вместе с тем для работы с микроколичествами препарата
описано приготовление гелей для горизонтального электрофоре-
за толщиной 0,1 мм на предметных стеклах. После высушива-
ния такой гель образует настолько тонкую, не заметную глазом
пленку, что она позволяет вести авторадиографию даже мечен-
ных 3H препаратов [Amaldi, 1972].
Высоковольтный горизонтальный электрофорез в пластинах
ПААГ толщиной 0,5 мм был использован для секвенирования
нуклеиновых кислот. Для улучшения теплоотвода гель разме-
ром 30 ? 50 см, подложив под него тонкую пленку, укладывали
на металлический охлаждающий столик самодельного прибора,
накрывали еще одной пленкой и плотно, по всей поверхности
прижимали к столику давлением наполненной воздухом подуш-
ки [Kutateladze et а1., 1979].
36
Глава 3
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
В двух предыдущих разделах были детально описаны прак-
тические приемы подготовки и проведения опытов по электро-
форезу. Это позволяет приступить к подробному анализу, си-
стематизации и сопоставлению физической сущности и потенци-
альных возможностей многочисленных и разнообразных вари-
антов этого метода, развитых за последние годы. В главах 3 и 4
мы попытались представить более или менее целостную картину
бурного развития электрофоретических методов исследования
белков и нуклеиновых кислот по состоянию на середину 1980 г.
Главная задача изложения - выяснение существа и возможно-
стей каждого из рассмотренных ниже вариантов. Однако следу-
ет еще раз подчеркнуть абсолютную необходимость совершен-
ного овладения описанной выше техникой эксперимента, без
которой попытки реализации самых блестящих замыслов зара-
нее обречены на провал.
Из множества рассмотренных ниже экспериментальных ра-
бот в интересах экономии места и концентрации внимания на
главном будут взяты только самые существенные количествен-
ные данные. Не следует пытаться по ним воспроизвести эти ра-
боты - для этого необходимо тщательно изучить цитируемый
первоисточник.
Рассмотрению конкретных вариантов в обеих главах пред-
посланы довольно подробные замечания общего характера, ко-
торые постоянно следует иметь в виду при анализе и сопостав-
лении этих вариантов.
ЗАМЕЧАНИЯ ОБЩЕГО ХАРАКТЕРА
Миграция белков в геле
Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность
биополимеров в геле (и') пропорциональна их подвижности в
свободной жидкости (uо), которая определяется отношением
суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, об-
условливающим отличие и' от uо является сила трения о гель,
которая зависит от соотношения линейных размеров макромо-
лекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс бел-
ков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляюще-
го большинства индивидуальных белков не превышают 500 000.
Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесооб-
разным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести
только по величине отношения заряда к массе. Как правило,
электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5 - 20%
акриламида.
Белки являются, цвиттерионами. Их суммарным зарядом, а
следовательно и отношением заряда к массе, можно управлять
37
путем изменения рН буфера, в котором полимеризуют ПААГ и
ведут электрофорез и который далее будем именовать рабочим.
Очевидно, что оптимальное значение рН рабочего буфера обус-
ловливает не максимальный заряд, а максимальное различие
зарядов разных белков, составляющих исходную смесь. Поэто-
му в большинстве случаев нецелесообразно использовать экст-
ремальные величины рН рабочего буфера, слишком удаленные
от изоэлектрических точек всех белков смеси. Для обычных
кислых белков оптимальные значения рН буфера оказываются
в нейтральной или слабощелочной области; миграция белков
идет в направлении от катода к аноду. Для щелочных белков
(гистонов, белков рибосом и др.) целесообразно использовать
слабокислые буферы (рН 4 - 5). Эти белки различаются по ве-
личине суммарного положительного заряда и мигрируют в на-
правлении от анода к катоду.
Несмотря на малое количество фракционируемого белка, от
рабочего буфера требуется существенная емкость, так как при
образовании зоны локальная концентрация белка может ока-
заться значительной. Поэтому приходится использовать буферы
с концентрацией 0,1 - 0,2 М и более. При этом следует учиты-
вать, насколько близко к границе буферной области лежит рабо-
чее значение рН. Если такое приближение к границе необходи-
мо, то для обеспечения достаточной буферной емкости моляр-
ность буфера приходится еще увеличивать. Вопрос об электро-
проводности буферов рассмотрен ниже.
Отметим далее, что эффект трения о гель зависит не только
от молекулярной массы, но и от конфигурации и жесткости бел-
ковой макромолекулы. Глобулярные белки, неспособные к агре-
гации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или
менее одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упа-
ковки глобулы. Рыхлые глобулярные и, особенно, фибриллярные
белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем
самым облегчать себе миграцию между его нитями. Этот эф-
фект особенно сильно выражен у высокомолекулярных нуклеи-
новых кислот.
Для однозначного определения молекулярной массы белка
по скорости его миграции при электрофорезе бывает целесооб-
разно распрямить полипептидную цепочку белка и придать ей
жесткость. Именно такой прием используется при электрофоре-
зе белков, обработанных додецилсульфатом натрия (подробно
это будет рассмотрено ниже).
Напряженность электрического поля (Н)
Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на
весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка
геля длиной l Е = Нl. В проводящей ток жидкости приложен-
ному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, ко-
торая в соответствии с законом Ома определяется суммарным
38
сопротивлением цепи R (I=E/R). В ПААГ проводящей жидко-
стью служит буфер, находящийся между нитями полимера.
Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заря-
женные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим
вкладом можно пренебрегать.
Электрическое сопротивление буфера определяется двумя
факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электро-
форетической подвижностью. Второй фактор играет очень важ-
ную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух бу-
ферах ионов С1- и СН3СОО- электропроводность первого буфе-
ра будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о
том, что электрический ток одинаков по всей длине электриче-
ской цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разры-
вов или скачков тока по длине геля физически быть не может,
это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряжен-
ностью электрического поля.
Если в любой электрической цепи последовательно включе-
ны два различных по своей величине сопротивления R1 и R2, то
одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них
за счет падения на нем напряжения Е1=IR1, а через второе - за
счет Е2=IR2. Полное напряжение по всей электрической цепи
Е=Е1+Е2. Если R1 сильно отличается от R2, то и Е1 также от-
личается от E2. При изменении сопротивлений двух участков рас-
пределение напряжений на них может существенно измениться,
оставаясь в сумме своей неизменным.
Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух
последовательно расположенных участков, где при полимериза-
ции были использованы разные буферы (содержащие ионы с
разной подвижностью или просто различающиеся по концентра-
ции). Сопротивления этих участков могут оказаться разными:
следовательно, различными могут быть и падения напряжения
на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако
заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значе-
ния напряженности поля на двух участках. Действительно, па-
дение напряжения на участке пропорционально его сопротив-
лению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля
есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому
соотношение напряженностей поля на двух участках геля не за-
висит от их длины и определяется только концентрациями и под-
вижностями содержащихся в них ионов. Это - очень важный
вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию
можно себе представить в двух простейших вариантах.
Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно,
ионы на двух участках геля (A и В) одинаковы, но концентра-
ция буфера на участке A в 10 раз меньше. Это приведет к тому,
что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В.
Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля,
и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем
такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их
39
концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое се-
чение обоих участков, а также через границу между ними, будет
одинаковым, что и означает неизменность тока I по всей длине
составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что
количество ионов в A не истощается - оно пополняется за счет
ионов, поступающих из электродного буфера.
Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обо-
их участках одинаковы, но ионы на участке A отличаются на-
много меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет
о подвижности в свободной жидкости (u0), так как сетка геля
не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле
A содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном рH),
а в геле В - ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обуслов-
ливает большую величину сопротивления. Суммарное напряже-
ние распределится между участками A и B так, что напряжен-
ность поля в A будет соответственно выше, причем именно на-
столько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорцио-
нальная произведению подвижности на напряженность поля,
стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует
условие неизменности величины тока вдоль всего геля.
В более сложных случаях могут различаться как подвижно-
сти ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряжен-
ности электрического поля в двух последовательно расположен-
ных участках геля устанавливаются такими, что они компенси-
руют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем
геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень
разными. Очень важно, что это различие существенным образом
влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же
белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На "ом
участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться
быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рас-
смотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белкоых
зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что
сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в од-
нородном по напряженности электрическом поле, чтобы разде-
ление белков отражало истинное различие их собственных ха-
<< Пред. стр. 6 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу