<< Пред. стр. 7 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
рактеристик - молекулярных масс и электрического заряда.
Выбор буфера рабочего геля
Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от
природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что
сама по себе величина рН практически не сказывается на элект-
ропроводности геля. Даже при рН 4 концентрации протонов
(0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по
сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет
видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и
к ионам ОН- в реально используемом диапазоне рН щелочных
буферов.
40
В то же время косвенным образом выбор рН может сильно
влиять на электропроводность данного буфера, определяя сте-
пень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый
Трис-НСl-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис+, С1- и не-
заряженные молекулы Триса. Для этого буфера рKa = 8,1. Это
означает, что при рН 8,1 ровно половина молекул Триса несет
положительный заряд, практически целиком за счет протонов
соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в рас-
творе находится такое же количество ионов С1-. Таким образом,
при рН 8,1 0,1 М Трис-НСl содержит 0,05 М Трис+ и 0,05 М С1-.
Электропроводность этого буфера будет определяться, в основ-
ном, ионами С1-, так как их подвижность намного выше, чем у
тяжелых ионов Трис+. 0,05 М С1- обеспечивает достаточно вы-
сокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же
концентрации и рН имеет значительно меньшую электропровод-
ность, так как подвижность аниона СН3СОО- явно ниже, чем
С1-.
При рН 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-НСl увеличится
примерно вдвое, так как этот рН лежит вблизи границы буфер-
ной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизирова-
ны; следовательно, концентрация С1- составит около 0,1 М. На-
оборот, при рН 8,9 электропроводность этого буфера значитель-
но ниже, чем при рН 8,1, так как для титрования до рН 8,9 по-
требуется заметно меньше НС1.
Существенную роль в определении электропроводности иг-
рает выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко
понять, что К- или Nа-фосфатные буферы, как и Трис-НСl, от-
личаются высокой электропроводностью за счет ионов К+ и
Nа+. То же относится к К- или Nа-ацетатным буферам. Между
тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концент-
рации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фос-
фатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отлича-
ется меньшей электропроводностью. Относительно низкую
электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и
Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что
электропроводности буферных систем, в которых не участвуют
легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щело-
чей, относительно невелики. Это важное заключение будет иг-
рать существенную роль в дальнейшем изложении. К сожале-
нию, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.
Таким образом, электропроводность рабочего буфера опре-
деляется тремя факторами: концентрацией, необходимой для
поддержания нужного рН в белковых зонах, степенью диссоциа-
ции буферных веществ при этом рН и характером участвующих
в диссоциации ионов.
Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних
солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутству-
ющую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, сле-
дует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра-
41
цию до 0,05 М. На избыток соли в препарате указывает, между
прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя
граница полосы препарата сразу после его вступления в гель.
При нормальном разделении должна иметь место как раз об-
ратная картина - резкая передняя и более диффузная задняя
граница полосы. Это можно проконтролировать путем окраши-
вания пробного геля через 20 - 30 мин после начала электрофо-
реза или при использовании люминесцентных маркеров (см.
ниже).
Помимо суммарной электропроводности, определенную роль
играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигри-
рующих в том же направлении, что и разделяемые макромоле-
кулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей под-
вижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы
большие органические ионы: Трис+ (катион), остатки барбиту-
ровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как
глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях
Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании ще-
лочных белков, а барбитуратный - для кислых белков вблизи
нейтральной области рН буфера.
Выделение тепла при электрофорезе
Высокая электропроводность буфера нежелательна, посколь-
ку ограничивает возможность повышения напряженности элект-
рического поля в геле из-за увеличения тока и связанного с этим
выделения тепла. Между тем, именно напряженность поля обес-
печивает всегда желательное ускорение миграции белков.
Электрическая мощность, рассеиваемая в виде тепла в геле,
равна произведению силы тока на падение напряжения по длине
геля (IЕ). В главе 1 было отмечено, что разумной продолжи-
тельности электрофореза соответствует напряженность поля
10 - 20 В/см. Кстати, как показывает практика, при заметном
превышении этих значений качество полос в обычных условиях
охлаждения ухудшается. Для геля длиной 20 см такой напря-
женности соответствует напряжение 200 - 400 В. При воздуш-
ном охлаждении вертикально расположенных пластин эффектив-
ный теплоотвод возможен при рассеиваемой мощности не более
20 Вт, что соответствует силе тока 50 - 100 мА на пластину.
В приборе GЕ-2/4 фирмы "Рhаrmасiа" (рис. 15) с принудитель-
ным жидкостным охлаждением пластин уровень мощности мо-
жет быть увеличен до 100 Вт с соответствующим повышением
напряженности поля и ускорением фракционирования белков.
Приборы для электрофореза в горизонтальных пластинах успеш-
но осуществляют теплоотвод при мощности до 40 Вт.
В процессе электрофореза электрическое сопротивление геля
может изменяться (чаще всего увеличивается). Причиной этого
является замена более подвижных ионов буфера в геле на ме-
нее подвижные, например при ступенчатом электрофорезе.
42
Рис. 15. Прибор для электрофореза в вертикальных пластинах с циркуляцией
буфера (Тип GЕ-2/4 фирмы "Рharmacia")
Как уже отмечалось, для сокращения продолжительности
разделения и уменьшения диффузии зон электрофорез желатель-
но вести при максимальном напряжении. Его начальное значе-
ние ограничивается требуемой вначале силой тока и максималь-
но допустимой для данного прибора мощностью. По мере роста
сопротивления в геле сила тока снижается, и напряжение мож-
но увеличивать. Современные источники напряжения делают
это автоматически, поддерживая заданный постоянный уровень
мощности, рассеиваемой в геле. От опасного (с точки зрения
надежности изоляции) повышения напряжения при этом можно
застраховаться, ограничив максимально допустимую его вели-
чину. Достигнув ее, прибор переключается на режим поддержа-
ния постоянного напряжения, поэтому при дальнейшем возра-
стании сопротивления сила тока и расходуемая в геле мощность
начинают снижаться.
В некоторых случаях сопротивление всей цепи электрофоре-
за может и уменьшаться. В частности, это может происходить
как из-за нагревания геля (напомним, что подвижность ионов
с температурой возрастает), так и за счет накопления ионов в
электродных резервуарах. В этих случаях источник тока, отрегу-
лированный на постоянную мощность, автоматически снижает
напряжение, а максимально допустимая сила тока может быть
заранее ограничена. Такого типа источники ("Соnstant роwеr
suрр1у") выпускаются фирмами "Рharmaciа" (модель
ЕСРS 3000/150) и LКВ (модель 2103). В других типах источни-
43
ков (ЕРS 500/400 фирмы "Рharmaciа" и модель 500 фирмы
"Вio-Rad") можно заранее установить постоянные значения на-
пряжения или тока и задать величину максимально допустимой
мощности, по достижении которой соответственно напряжение
или ток начинают автоматически уменьшаться.
Загрузка геля. Ширина белковых зон
Очевидно, что разделение близко идущих зон белков будет
тем успешнее, чем уже сами эти зоны, поэтому при электрофо-
резе следует заботиться о максимальном сужении белковых зон
(полос). Это накладывает ограничения на допустимую загрузку
геля. Разумеется, строгость таких ограничений зависит от со-
става белковой смеси и характера разделения полос. В качестве
ориентировочного максимума можно принять загрузку порядка
1 мг суммарного препарата белка на 1 см2 сечения геля. Для
кармана шириной 5 мм в пластине толщиной 1,5 мм это соответ-
ствует примерно 75 мкг белка, а для трубки диаметром 6 мм -
до 200 мкг. Идентификацию полос белка по их окраске можно
проводить при загрузках, в 10 раз меньших. При перегрузке бел-
ковые полосы бывают резкими в передней своей части и размы-
тыми сзади. При этом следует всегда считаться с возможностью
преципитации белка в момент вступления его в гель, когда все
макромолекулы стягиваются в узкую полоску и локальная кон-
центрация их сильно увеличивается.
Чем меньше загрузка геля, тем лучше разделение близких
зон. Ограничения в этом случае накладываются только метода-
ми обнаружения слабых полос. Поскольку диффузия зон идет
во времени, всегда желательно сокращение продолжительности
электрофореза, но не за счет чрезмерно высокой силы тока, вы-
зывающей неравномерный нагрев геля и искажение полос.
Электрофорез при пониженной температуре в этом плане дает
немного. Интенсивность диффузии уменьшается, но вместе с тем
снижается и электрофоретическая подвижность белков, а следо-
вательно, увеличивается продолжительность электрофореза.
В простом варианте электрофореза желательно наносить бел-
ковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота ис-
ходного слоя препарата была не более 2 - 3 мм. Выполнить это
условие нередко бывает затруднительно ввиду недостаточной
концентрации исходного препарата. На основании приведенных
выше цифр легко рассчитать, что концентрация белка в препа-
рате должна составлять 3 - 5 мг/мл. Ряд мер позволяет обойти
эту трудность; они направлены на концентрирование белкового
препарата в узкую зону в момент вступления его в рабочий гель.
Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем
область с повышенной напряженностью поля, где белки мигри-
руют намного быстрее, чем в рабочем геле. В момент перехода
из этой области в рабочий гель они будут стягиваться в узкую
полосу, так как находившиеся первоначально далеко позади
44
Рис. 16. Концентрирующий эффект электрофореза в градиентном геле (4 -
30% ПААГ)
а - начало фракционирования белков сыворотки; б - тот же гель после 60 ч диффузии
при комнатной температуре и выключенном напряжении; в - через 6 ч после возобновле-
ния электрофореза
молекулы белка "догонят" впереди идущие молекулы, замедлив-
шие свое движение при вступлении в рабочий гель.
Область с повышенной напряженностью поля можно создать
в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малопод-
вижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход исполь-
зован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного
ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного
препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5 - 10 раз ме-
нее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на
гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое примене-
ние в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого
приема.
Другой очень эффективный способ сужения полос - исполь-
зование градиента пористого геля. В этом случае при миграции
вдоль геля передний край каждой полосы все время оказывает-
ся в области чуть более концентрированного геля, чем задний.
Молекулы белка, расположенные ближе к переднему краю по-
лосы, тормозятся трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что
и приводит к непрерывному сужению полос в ходе их продви-
жения по гелю. Силу этого эффекта убедительно продемонстри-
ровали специалисты фирмы "Рharmaciа" на выпускаемых этой
фирмой стандартных пластинах с градиентом концентрации
ПААГ (4 - 30%). Начав электрофоретическое фракционирова-
ние белков сыворотки, они затем прерывали его и оставляли
пластину на 60 ч при комнатной температуре. За это время диф-
фузия полностью размывала сформировавшиеся было белковые
полосы. Однако через 6 ч после возобновления электрофореза
удавалось получить четкую картину полос, содержащую все
обычно наблюдаемые компоненты сыворотки (рис. 16).
45
Введение мочевины и ?-меркаптоэтанола.
Некоторые артефакты
Высокая концентрация белков в зонах может привести к их
осаждению или, по крайней мере, образованию агрегатов: ди-
мерных, тримерных и более крупных белковых комплексов, ко-
торые могут давать дополнительные полосы. Агрегация проис-
ходит, в основном, за счет водородных связей. Для ее предотвра-
щения в рабочий буфер нередко добавляют мочевину в концент-
рации 4 - 8 М. Она должна быть хорошо очищена, в частности
деионизована. Кроме того, следует всегда иметь в виду возмож-
ность частичного разложения мочевины с образованием циано-
вой кислоты и карбамоилирования белков. Это особенно отно-
сится к долго хранящимся буферам, поэтому лучше добавлять
сухую мочевину в буфер непосредственно перед приготовлением
геля. Если все же возникает подозрение, что некая полоса появи-
лась за счет карбамоилирования, то следует добавить в исход-
ный препарат цианат и посмотреть, не усилится ли подозритель-
ная полоса. Для предварительной деионизации маточный рас-
твор мочевины (10 М) суспендируют с бифункциональной ионо-
обменной смолой (например, AG 501 ? 8) в соотношении 5 г
смолы на 100 мл раствора в течение часа при комнатной темпе-
ратуре.
?-Меркаптоэтанол в концентрации 1 - 5% нередко вносят в
исходный белковый препарат для предохранения его от окисле-
ния и образования лишних дисульфидных мостиков. Более энер-
гичное воздействие с разрывом нативных дисульфидных связей
и разделением белковых субъединиц производят путем нагрева-
ния белкового раствора до 90 - 100° в присутствии не только ?-
меркаптоэтанола или его аналогов, но н ДДС-Na.
В некоторых случаях при использовании боратного буфера
или буферов, содержащих аминокислоты (глицин, аланин), воз-
можно образование комплексов компонентов буфера с белками.
Их электрофоретическая подвижность может оказаться несколь-
ко иной, чем у чистых белков, и соответствующие белковые по-
лосы раздвоятся. Проверить такого рода артефакт можно по-
вторным электрофорезом. В силу равновесного характера про-
цесса образования комплексов каждая из двух полос дублета
при ее повторном электрофорезе в том же буфере даст снова две
полосы.
В главе 1 уже упоминалось об опасности, которую представ-
ляют для белков сохраняющиеся в геле после полимеризации
долгоживущие свободные радикалы. Указывалось также на спо-
соб их удаления - "преэлектрофорез", т. е. пропускание тока
через гель без внесения препарата. Добавим, что в особых слу-
чаях для полной очистки от радикалов во время преэлектрофо-
реза через гель пропускают такие связывающие их соединения,
как цистеин, меркаптоуксусная (тиогликолевая) кислота или
гидрохинон.
46
При фракционировании очень малых количеств белка может
оказаться заметной сорбция их на геле (белки "размазывают-
ся" по гелю). Блокировать это явление можно, вводя в исход-
ный препарат дополнительный быстро мигрирующий белок. Про-
ходя через гель впереди всех остальных белков препарата, он
насыщает собой центры неспецифической сорбции в геле.
Лидирующие красители
Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препа-
рат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что
и фракционируемые белки. Он не должен заметным образом свя-
зываться с белками, а скорость его продвижения по гелю долж-
на быть заведомо больше, чем у наиболее быстро мигрирующего
белка. Вместе с тем краситель не должен слишком сильно от-
рываться от белков, чтобы его прохождению до конца пласти-
<< Пред. стр. 7 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу