<< Пред.           стр. 2 (из 4)           След. >>

Список литературы по разделу

  7. Направленная дифференцировка ЭСК и ППК in vitro
 
  Ранее всего спонтанная дифференцировка ЭСК была изучена в культуре тератокарциномы. Недостаток линий ТК в том, что они быстро теряли способность дифференцироваться в стандартно воспроизводимые фенотипы соматических клеток. Первой была описана дифференцировка эмбриокарцином в крупные распластанные клетки (в культуре с низкой плотностью клеток). Часть полиплоидных клеток синтезировала хорионический гонадотропин, что делало фенотип похожим на клетки трофобласта. Далее были найдена линия NTERA2, на которой удалось детально изучить нейрогенез под влиянием ретиноевой кислоты. Этот проект закончился первым в истории биологии получением лабораторных нейронов и их дальнейшим использованием в клинике для лечения последствий инсульта, травм спинного и головного мозга, а также нейродегенеративных заболеваний. (подробности см. www.biolayton.com).
  Первые итоги лабораторного получения дифференцированных клеток из ЭСК были резюмированы в 1996 г (Weiss M., Orkin S.D., 1996). Инкубация клеток тератокарциномы F9 или P19 с тщательно подобранной концентрацией цАМФ и ретиноевой кислоты вызывала индукцию висцеральной эндодермы (желточного мешка). Клетки этого зачатка в культуре синтезировали фетуин, альфа-фетопротеин и альбумин. Те же клетки тератокарциномы созревали в гематогенные линии при добавления IL-3 и супернатанта фидера от стромальных клеток. Полагали, что фидер продуцировал следующие сигналы для созревания гематогенных линий: IL-3, SCF, bFGF, IGF-1, IL-6, GCSF.
  Репертуар дифференцировки линий ЭСК Томсона в соматические клетки in situ богаче, чем лабораторная дифференцировка ЭСК тератокарциномы (Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A., 2001). Выращенные в плотной культуре ЭСК человека (особенно при редкой смене фидера) снижали темп пролиферации и начинали спонтанно дифференцироваться. Сохранение плюрипотентности связано с поддержанием синтеза ID - ингибиторов дифференцировки (Nogieira M.M., Mitjavila-Garcia M.T., LePasteur F. et al., 2000). Первыми в таких "стареющих" культурах появлялись клетки экстраэмбриональной энтодермы, а также экспрессировались гены зародышевых листков (Reubinoff B.M., Pera M.F., Fong C. et al., 2000).
  Кроветворение in vitro в клоногенной культуре ЭСК начиналось при соблюдении двух условий: 1) из среды культивирования убирали LIF 2) создавали контакт эмбриоидных телец с клетками стромального фидера. В необработанных культурах кроветворение сочеталось с васкулогенезом. Внутри эмбриоидных телец вопроизводились события, происходящие в желточном мешке: формировалпсь сети ангиобластов с островками первичного кроветворения. Только крупные ангиобласты формировали капилляры de novo (васкулогенез). Позднее капиллярная сеть росла лишь за счет краевого роста (sprouting) эндотелиальных клеток. В культуре ЭСК удалось наблюдать раздельно образование капилляров и островков кроветворения.
 Большинство гематогенных стволовых клонов, полученных из ЭСК, не имели клинической перспективы, поскольку имели укороченные сроки обновления in situ. Сокультивирование "лабораторных" гематогенных колоний с гематогенной стромой возвращало потенцию клонам как к длительному самообновлению in viro, так и длительному выживанию в гематогенной ткани реципиента (Wang S., Gaerhart J.D., 2000).
 
 
  Рис 1-10 Образование гематогенных клонов из эмбриодных телец ЭСК мыши
 
  Для получения гематогенных стволовых клеток эмбриоидные тельца механически дезагрегировали в однородную клеточную популяцию. Затем клетки культивировали методом "висячей капли", либо помещали на метилцеллюлозу с добавлением цитокинов и ростовых гематогенных факторов. Показано, что ЭСК, трансфецированные двойной дозой гена Hox-B4, троекратно увеличивали скорость наработки предшественников миелоидного и эритроидного ряда in vitro.
  Обращало внимание, что синхронное образование предшественников кроветворения и эндотелия in vitro происходило не через мезенхиму и мезенхимальные стволовые клетки (как это происходило in situ). В зародыше взаимодействие стромы и гематогенных стволовых клеток предопределяло образование полноценной кроветворной ткани с длительно живущими самообновляемыми ростками миело- и эритропоеза. Возникновение очагов кроветворения из ЭСК сопровождалось частичной дифференцировкой островков кроветворения в линии так называемых эмбриональных макрофагов. Линии макрофагов, возникающих из кроветворных клонов желточного мешка имели фенотипические особенности. Эти клетки не принимали участия в презентации антигенов, но обеспечивали удаление погибающих клеток из провизорных клонов. После рождения такие транзиторные линии макрофагов полностью исчезали из кроветворной ткани (Inamdar M., Roch T., Rapoport R. еt al., 1997). Продемонстрирована дифференцировка клонов ЭСК мышей на специальном фидере без нескольких ростовых факторов, блокирующих эритропоэз и миелопоэз, в гетерогенную популяцию пре-В-лимфоцитов с характерными маркерами созревания (CD 19, CD24, CD117, CD45R+). C помощью рекомбиназы клетки на поверхности собирают иммуноглобулины из мРНК V,D, и J локусов. Индуктором дифференцировки являлся лиганд рецептора FLt3 (Cho S.K., Webber T.D., Carlyle J. et al.,1999)
  Для индукции нейрогенеза из ЭСК in vitro из среды убирали LIF и фидер. Далее частично прикрепленные к подложке постмитотические клетки обрабатывали 100нмоль ретиноевой кислоты с добавкой 1% телячей сыворотки (FCS). Эффективность начальных этапов нейрогенеза контролировали по экспрессии мРНК двух генов: Рах-6 и SHH. Исчезновение мРНК гена SHH коррелировало с остановкой митозов прогениторных популяций. Включение гена Рах-6 маркировало начало рестрикционного созревания нейронов.
 Линия тератокарциномы человека NT2 генерировала более 80% постмитотических нейронов после добавления в культуральную среду 10 мкг/мл ретиноевой кислоты в течение 6 нед (пропись фирмы BioLayton). Однако такой выход нейронов удавалось получить только из культуры, в которой сперва отсортировывались нестин+ НСК. Если получали нейроны из общей массы предшественников, эффективность процедуры оставалась на уровне 10-30 %. С помощью иммунофенотипических маркеров однородную популяцию зрелых постмитотических нейронов высортировывали с помощью поточного сортировщика клеток от остатков незрелых клеток. Как показали многократные эксперименты на животных, такие нейроны после трансплантации в мозг не только выживали, но и встраивались в региональные нейронные сети. В экспериментах на животных с модельным дефектом ЦНС обнаружены позитивные эффекты нейротрансплантата на симптоматику заболевания (последствия травмы, инсульта, димиелинизирующие заболевания, наследственные дефекты развития мозжечка, болезни отложения липидов и полисахаридов и т.п.). Эти вопросы подробно рассмотрены во второй главе книги.
  Пока лишь фрагменты программ для направленной дифференцировки ЭСК человека in vitro попали в открытую печать. Установлено, что нейрогенные эффекты ретиноевой кислоты in vitro нужно оценивать по экспрессии гена Wnt-13. Сама ретиноевая кислота стимулировала образование функционально незрелых нейронов с недоразвитой сетью синапсов и без электровозбудимой мембраны. Прединкубация таких незрелых нейробластов с средой культивирования зрелых астроцитов завершала дифференцировку тел нейронов и их медиаторную специализацию. Хотя лабораторно полученные нейроны человека из ЭСК уже начали использоваться в клинических испытаниях, научная база рестрикционного созревания ЭСК в нейроны только формируется. Детали "software" для лабораторного нейрогенеза строго засекречены и приватизированы частными фирмами. По-видимому, от идеи "один сигнал - один фенотип" приходится отказаться. Рестрикционное созревание любой соматической линии клеток находится под контролем множества сигналов.
  В культуре НСК из фетального мозга добавление 0,5 мкмоль ретиноевой кислоты в три раза усиливало скорость созревания нейронов (в контроле среда содержала только bFGF). Если ретиноевая кислота ускоряла индукцию master-genes (NeuroD, Hu, NeuN, p21), то нейротрофины (BDNF, NT-3, NGF) завершали второй этап дифференцировки нейронов формированием "профиля" нейромедиаторов. BMP-2 и BMP-4 необходимы для терминальной специализации нейронов. Показательно, что дифференцировка ЭСК в нейроны in vitro шла иными путями, чем созревание нейронов in situ.
  Общепризнанно, что в зародыше все популяции нейронов и глии образуются из нейральных стволовых клеток (НСК), первично возникших в эпендиме/субэпендиме развивающейся нервной трубки. Все НСК возникают в ходе гаструляции из клеток первичной эмбриональной эктодермы, получающей индуктивные сигналы от организатора (мезоэнтодермы) (Tropepe V., Hiftoshi S., Sirard C. et al., 2001). НСК в нервной трубке отличаются характерными маркерами: polysyalated-NCAM - поверхностный маркер незрелого нейроэпителия; нестин, виментин - белки промежуточных волокон нейроэпителия. Другой ранний белок- glial fibrillar acidic protein (GFAP) - преимущественно метил субэпендимальные НСК, особенно латерального желудочка мозга (Alvarez-Buyilla, 2000). За последние годы стало ясно, что НСК можно получать из ЭСК альтернативным путем, не повторяя событий in situ.
  Получить редкие колонии НСК в плотной культуре ЭСК удалось остановкой пролиферации в бессывороточной среде с добавлением 1мкмоля ретиноевой кислоты. Через 1 нед появлялись типичные нейросферы, клетки которых окрашивались антителами к нестину, виментину и polysyalated-NCAM. Еще через 1 нед в нейросферах появлялись клетки, экспрессирующие мРНК гена Рах-6. Когда позже сферы прикреплялись к подложке, распластанные вытянутые клетки формировали отростки и были идентифированы как нейробласты с помощью антител к МАР-2, NeuN, betaIII-tubulin. На заключительных стадиях созревания формировались лиганд- и потенциал-зависимые ионные каналы, рецепторы и белки синаптической мембраны. Получены однородные популяции предшественников олигодендроцитов из ЭСК. Трансплантация лабораторно полученных предшественников олигодендроглии стимулировала ремиелинизацию в поврежденном мозге животных (Brustle O, Jones K, Lerish R, et al., 1999; Liu S., Qu Y., Stewart T.J. et al., 2000).
  Серийный анализ генной экспрессии (SAGE) выявил наиболее важные сдвиги экспрессии генов (активация или выключение синтеза мРНК) в трех отсеках генома: энергетика, метаболизм и сигнализация. В незрелых пролиферирующих ЭСК отмечена ограниченная экспрессия генов сигнализации (рецепторы, G-белки, вторичные мессенжеры, транскриптазы, кофакторы экспрессии и репрессии). Из 588 исследованных генов сигнализации в ЭСК менее половины оказались экспрессированными. Методом SAGE показано, что при начальной индукции нейрогенеза ретиноевой кислотой происходило синхронное выключение 18 "старых" генов, работающих в ЭСК. Одновременно, включались 61 новых генов "сигнализации". Учитывались самые мощные сдвиги экспрессии, когда уровень мРНК возрастал или снижался в 2.5 раза и более. Первыми в ЭСК включались гены, контролирующие рецепторы клеточной адгезии, компоненты экстрацеллюлярного матрикса, рестрикционные транскриптазы и компоненты "кабеля транссигнализации" между ядром и рецепторами . Выключению подвергались гены-сайленсеры и коингибиторы генной экспрессии, удерживающие геном в неактивном, либо тотипотентном состоянии (Kelly, Rizzino, 2000)
 В ранних работах спонтанно сокращающиеся кардиомиоциты получали из ЭСК мышиных тератокарцином путем добавления в среду культивирования диметилсульфоксида (ДМСО). Позднее стало известно, что ДМСО играет роль вектора для доставки гидрофобных сигналов (ретиноевая кислота, цитокины с гидрофобными доменами) в ядро стволовых клеток. Более эффективно кардиомиоциты получают сейчас под контролем экспрессии гена Crypto. Уже говорилось, что этот ген контролирует нормальное формирование founder cells в эпибласте. Линии ЭСК Crypto-/- теряли способность генерировать зачаток сердца. Накопление кислородных радикалов и электрическая стимуляция ЭСК в культуре ускоряли образование зрелых спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов. Такие кардиомиоциты, полученные в лаборатории, активно встраивались в миокард развивающихся зародышей, либо в постишемическую поврежденную ткань (Doevendans P.A., Kubalak S.W., An R.H. et al, 2000; Kehat I. et al., 2001 ).
 Многие специализированные линии клеток (адипоциты, клетки поджелудочной железы, островки Лангерганса, клетки эндокринных желез, иммунной системы) не возникали спонтанно из ЭСК при блокаде клеточной пролиферации. Большинство исследователей получали адипоциты из линий стромальных клеток мезодермального происхождения (типа 10T1/2) (Dani C., Smith A.G., Dessolin S., et al, 1997).
  Только некоторые линии ЭСК тератокарциномы (E14TG2a, CGR8, ZIN40) трансформировались в адипоциты при добавлении ретиноевой кислоты, растворенной в ДМСО. Если микромолярные концентрации ретиноевой кислоты ингибировали адипогенез, то наномолярные концентрации ретиноевой ксилоты были эффективными индукторами жировых клеток (до 30-60 % от всех клеток в культуре). Предполагают, что ретиноевая кислота вызывает образование мультипотентных мезенхимальных клонов в культуре, которые далее по разным программам повторяют адипогенез, миогенез, кардиогенез уже с помощью набора сигналов и генов "второго эшелона" Низкие "адипогенные" концентрации ретиноевой кислоты не влияли на экспрессию генов Brachyury, Zeta-globin, Nkx5-2, кардиоспецифичную изоформу актина. Наоборот, высокие "кардиогенные" концентрации ретиноевой кислоты, блокируя адипогенез, стимулировали экспрессию генов мезодермы, кардиогенной мезодермы, генов созревания кардиомиоцитов (Dani C., Smith A.G., Dessolin S. et al., 1997) .Для этой трансформации существовал узкий временной диапазон (критический период), когда не только витамин А, но и стимуляторы пероксисом, Т3 (трииодтиронин) и индукторы липогенеза ускоряли образование преадипоцитов в культуре. Фенотип преадипоцитов определяли по появлению транспортных белков для жирных кислот и синтазе триглицеридов.
 Как известно, хондроциты в ходе эмбриогенеза образуются из сомитов и мезодермы через множество промежуточных структур костно-мышечной системы. Источником хряща являются мезенхимальные стволовые клетки. Однако с помощью ЭСК удалось вопроизвести рестрикционное созревание хондроцитов в обход главных событий органогенеза, взаимодействий склеротомов и нотохорды, не повторяя сложных эпителиомезенхимальных взаимодействий. Кажется удивительным, что эмбриоидные агрегаты ЭСК в простых условиях культуры способны дифференцироваться в хондроциты вне формирования зачатка конечности и других провизорных структур зародыша. ЭСК наращивали стандартным методом в суспензии над фидером в среде Дульбекко-Игл с15% FSC (HyClone). Выращенные агрегаты переносили на малтивеллы с дном, покрытым желатиной, и клетки переносили в среду для дифференцировки. Главными сигналами хондрогенеза было сочетание концентраций ВМР-2, ВМР-4 и TGF-beta. Исследование спектров мРНК показало, что первый этап дифференцировки сопровождается активацией генов Sox-9, Pax-1 - маркеров мезенхимальных стволовых клеток. На втором этапе активировалась транскриптаза scleraxisи и начинался синтез коллагена II типа. Третий этап созревания оценивали по накоплению специфического протеогликана- агрекана (Kramer J., Hegert C., Guan K. еt al., 2000). Самая важная особенность хондроцитов, полученных из ЭСК, - их уникальная способность сохранять фенотип дифференцированных клеток при длительном культивировании. Как известно, хондроциты в первичной культуре, выделенной из фетального или взрослого хряща, дедифференцируются в фибробласты за 7-15 дней. Возможно, эта особенность лабораторно полученных хондроцитов найдет практическое применение в медицине.
  В заключение следует подчеркнуть, что лабораторное получение нейронов, кардиомиоцитов и других соматических клеток человека из ЭСК идет в обход важнейших событий эмбриогенеза: 1) взаимодействия мезенхимы с провизорными клонами и тканями трех зародышевых листков 2) в обход региональных программ рестрикционного созревания нейронов и глии, когда источником локальных сигналов служила мезенхима. Полную картину ранних стадий эмбриогенеза невозможно вопроизвести на изолированных линиях ЭСК без организованного роста мезенхимы и провизорных органов. Например, из линий ЭСК не удается получить клетки нервного гребня in vitro. Лишь часть ранних событий органогенеза воспроизводится хаотически в культуре "эмбриоидных телец". Поскольку созревание линий дифференцированных клеток изначально идет в простых средах, полученные нейроны, кардиомиоциты, хондроциты способны стабильно сохранять фенотип в лабораторных условиях. Между тем добиться длительного сохранения фенотипа тех же клеток в культуре, изолированных из органов взрослых животных млекопитающих и человека, часто оказывается невозможным. Трансплантация дабораторно полученных нейронов/нейробластов в организм животных, подтверждает их функциональную полноценность, в том числе как средства биорепарации повреждений in situ. Существенно, что рестрикционное созревание нейронов, гепатоцитов, кардиомиоцитов может идти в культуре "отдельным пакетом" вне морфогенеза и общих программ согласованного строительства зародыша. Более того, часть программ "линейного созревания" клеток идет только in vitro после дисперсии клеток-предшественников и устранения межклеточных взаимодействий, которые блокируют дифференцировку прогениторных популяций. Например, многие программы дифференцировки клеток блокированы в "эмбриоидных тельцах", но идут после дезагрегации клеток.
  Дифференцировка ЭСК в специализированные классы соматических клеток открывает беспрецедентные возможности для изучения функциональных программ генома. Предстоит понять, почему в лабораторных условиях существуют десятки способов получения функционально зрелых нейронов или кардиомиоцитов с помощью разных сигналов и генов (Wernig M., Brustle O., 2002). Возможно, что разные способы сборки молекулярных машин и транскрипционных комплексов ведут к неидентичному функциональному результату, т.е. не жестко запрограммированному ответу клеток.
 
 
 
  8. ЭСК в изучении функций Нох-генов
 Как уже упоминалось, некоторые линии ЭСК и ТК мышей характеризовались высокой частотой хромосомных перестроек, иногда анеуплоидией, которые попутно заканчивались образованием иммортализованных линий. Взаимосвязь между иммортализацией и генетическими перестройками приобрела особый интерес, поскольку впервые наметилась взаимосвязь между аномалиями органогенеза (дисрегуляция Нох-генов) и внутриутробным карциногенезом. Характерно, что главные 4 группы Нох-генов расположены на четвертой хромосоме человека и мыши Возникновение первичного кроветворения в желточном мешке связано с экспрессией Нох-генов. Если обычные клоны эритро- и миелопоэза характеризовались умеренной экспрессией Нох-1 гена (миелопоез) и Нох-2 гена (эритропоез), то возникновение иммортализованныых линий из упомянутых клонов сопровождалось увеличением экспрессии как Нох-1, так и Нох-2 (Vieille-Grosjean I., Roullot V., Courtis G.,1992)
 Первый вариант хромосомных перестроек связан с перносом онкогенов в область экспресии ранних генов органогенеза. Чаще всего такие перестройки выявлялись появлением иммортализованных клонов в провизорной кроветворной системе (желточный мешок, фетальная печень). Второй вариант малигнизации прогениторных клеток кроветворения - образование новых химерных белков в результате слияния двух генов в один. Образование таких "гибридных" молекул, особенно из факторов генетической транскрипции (TAL1 (SCL), LMO2, AML1, CBF) приводил к иммортализации отдельных прогениторных клеток в миелоидных или эритроидных клонах. Самой распространенной молекулярной "химерой" (более 20% случаев пре-В-прогениторной лейкемии детей) оказалась новая гибридная молекула E2A-PBX1. 80 % случаев такого заболевания эффективно контролируется хемиотерапией. Другая гибридная конструкция из двух слившихся белков TEL-AML1 обнаружена лишь в 20 % случаев лейкемии у детей. Характерно, что главным средством лечения является ретиноевая кислота - универсальный индуктор дифференцировки ЭСК, останавливающей митозы прогениторных клеток.
 Далее выяснилось, что аномалии экспрессии генов сегментации и гомеозиса в провизорных клонах зародыша также ведут к онкогенезу зародышевых клеток.
 Избыточная экспрессия гена НохВ4 (в том числе, на почве транслокации) вызывает перепродукцию незрелых прогениторных популяций в гематогенных клонах. Мыши, родившиеся с такой аномалией развития, имеют миелоидную дисплазию, спленомегалию, ограниченный срок жизни. Избыточная экспрессия гена Нох -А10 ведет к неконтролируемой пролиферации колоний мегакариоцитов, с одновременным уменьшением прогениторных популяций моно- и лимфо-ряда.
 У детей, как и у млекопитающих выявлены формы лейкоза, при котором в иммортализованных клонах чаще всего экспрессированы следующие Нох- гены: MLL, MLL-AF9, MLL-AF4, trx-G, Bmi-1. Часто подвергается перестройке с последующей фузией Нох-А9 ген. Пока не ясно, каким образом отклонения в экспрессии Нох-генов ведут к иммортализации клонов стволовых/прогениторных клеток в зародышах. Возможно, что возникающие дефектные, аномальные клетки ускользают от апоптоза.
 Ген эритропоетина и Нох-В6 ген расположены на одной хромосоме и подвержены одновременной экспрессии в разных органах кроветворения у зародышей (Zimmerman F.,Rich I.N.,1997). Существенно, что одновременная экспрессия Нох-В6 и эритропоетина обнаружена в эритропоетических клонах in vitro. Экспрессия генов не выявлена в стволовых, но показана в митотических прогениторных клетках.
 Известно, что ген Pten контролирует синтез белка-супрессора опухолевого роста. Показано, что нейросферы, изолированные из мозга зародышей мыши Pten-/-, характеризуются более интенсивной пролиферацией прогениторных клеток в культуре.
 Избыточная экспрессия НохА9 вместе с Рвх вызывает иммортализацию гематогенных клеток (Schnabel C.A., Jacobs Y., Clearly M.L., 2000)
 Региональная экспрессия НохА5 и НохВ7 генов в клонах стволовых клеток волосяных фолликул связана с подавлением региональной дифференцировки прогениторных клеток (LaCelle P.T., Polakowska R.R., 2001). Иммортализацию CD34+ гематогенных стволовых клеток in vitro можно вызвать трансфекцией гена Нох-С4 в комбинации с ретровирусным вектором (Daga A., Podesta M., Capra M.C. et al.,2000). Скорость пролиферации трансфицированных клонов возрастала в 10-13 раз.
  Делеция гена Wnt7 - master gene рестрикционного созревания альвеолярного эпителия легких связана с множественными случаями раннего канцерогенеза альвеолярного эпителия (Calvo R., West J., Erickson P. et al., 2000). В зародыше экспрессия Wnt7 автоматически сопряжена с включением следующих генов: Нох-А1, Нох А7, Нох-А9, Нох-А10, Нох -В9, контролирующими организованный морфогенез эпителия альвеол. При выключении Wnt7 и сопряженном выключении упомянутых Нох-генов наблюдается неорганизованный и нелимитированный рост альвеолярного эпителия, который приводит к образованию типичных опухолей в легких уже во внутриутробном развитии.
 У мышей Нох-В6-/- резко увеличена доля незрелых прогениторных клеток в эритроидных ростках (Kappen C., 2000). С помощью пересадок ЭСК подсчитано, что закаладка эпителиальной части тимуса развивается из 900 founder cells, которые в зародыше мыши сохраняются в дормантносм состоянии на 16-18 дне внутриутробного развития. Пересадки "блоков" этих прогеиторных клеток вызывает быструю реконструкцию поврежденной железы реципиента (Rodewald .R., Paul S., Haller S. et al., 2001). У зародышей мыши Нох11-/- нарушается формирование селезенки. Стромальные Нох11-/- клетки концентрируются в виде неорганизованного конденсата между желудком и поджелудочной железой, мутантные клетки плохо пролиферирует и пркатически не мигрируют в зачаток селезенки (Kanzler B., Dear T.N., 2001)
 
 9. ЭСК - новый биоресурс медицины
 С помощью ЭСК разрабатываются эффективные технологии лечения многих наследственных заболеваний, которые не удалось решить методами молекулярной генетики, включая средства генной терапии. Прежде всего в целях экстренной помощи (острая недостаточность органа) обоснованы и допустимы трансплантации аллогенных стволовых клеток, которые в определенных условиях микроокружения способны дать ростки донорской ткани в органе-реципиенте в количестве, достаточном для компенсации генетического дефекта (Geiger H., Sick S., Bonifers C. et al., 1998). Доказано, что лишь 3-5% генетически нормальных клеток достаточно, чтобы восстановить утраченную биохимическую функцию поврежденной печени, скелетной мышцы, эндокринной железы (Репин В.С., 1998)
 Пересадки ЭСК и их дериватов в недалеком будущем окажутся наиболее эффективным способом регионального воздействия как на фенотип составляющих орган клеток, так и поведение клеток, контролирующих важнейшие функции органа. Например, пересадки овальных стволовых клеток, содержащих лишний экспрессированный ген HGF, IGF1, SCF и других митогенов восстанаваливают резистентность печени к циирозу на почве алкоголизма или персистирующей вирусной инфекции (Kaido T., Yamaoka S., Tanaka J. et al.,1996, Kobayashi Y., Hamanoue M., Ueno S. et al., 1996; Ueki T., Kaneda Y., Tsutsui h. ET AL., 1999). Аналогичным образом, пересадки аутогенных миобластов, трансфицированных геном HGF и (или) IGF1, могут стимулировать регенерацию и сохранение массы мышц при различных формах ускоренного старения или миодистрофии (Sheenan. S., Tatsumi R., Temm-Grove C. et al., 2000). Пересадки аутогенных миобластов, трансфицированных генами HGF, блокировали фиброз и почечную недостаточность за счет неогенеза тубул из стволовых пулов почки (Yang J., Liu Y.,2002)
  Хотя первые протоколы изолирования и пассирования ЭСК в виде самовоспроизводящихся линий появились около 20 лет назад, выделение ЭСК из зародышей остается искусством, а не стандартной GMP-процедурой. Причина - незнание многих свойств и характеристик гетерогенных ЭСК как in situ, так и in vitro. Например, эффективность изолирования мышиных ЭСК разных генетических линий существенно варьирует. Стабильно удается выделять только ЭСК трех линий мышей: 129, C57BL/6 и alpha-hybrid. Опыты с ЭСК из C57BL/6 воспроизводились гораздо хуже, чем ЭСК из линии 129. Иммортализованные линии мезенхимальных стволовых линий, выведенные в пассажи из одного образца стромы, также характеризуются выраженной биохимической гетерогенностью, разным профилем цитокинов, ростовых факторов, неидентичностью способностью поддерживать рост гематогенных колоний, а также репертуаром химической дифференцировки (Dormady S.P., Bashayn O., Dougherty R. et al., 2001). Для оптимального роста эти линии нуждаются в добавлении 8-12 цитокинов и ростовых факторов (взамен фидера).
 Геномные различия влияют на процент ЭСК среди клеток эмбриобласта. Многоэтапное созревание тотипотентных клеток зависело от фидера и LIF. Если эмбриобласт не реагировал на LIF, то ЭСК не удавалось пассировать без фидера. Первичные пролиферирующие суспензионные клоны ЭСК после диссоциации эмбриобласта всегда гетерогенны. Лишь небольшое число клонов содержали интенсивно пролиферирующие клетки. Не только клетки трофобласта, но и плохо пролиферирующие клоны ингибировали созревание ЭСК. Быстро растущие колонии необходимо изолировать и культивировать в микровеллах. Новую линию ЭСК изолировали из одного бурно пролиферирующего клона (но не одной клетки). Мышиные линии ЭСК - рекордсмены продуктивности. Они нарабатывали до 1-10 млрд стандартных незрелых тотипотентных клеток. Бластоцисты разных генетических линий генерировали разное количество активно пролиферирующих клонов.
  С помощью ЭСК впервые верифицированы два источника хондроцитов (главных клеток хряща). Как известно в ходе эмбриогенеза in situ преобладающая клеточная масса хряща возникала из мезенхимальных стволовых клеток. В культуре под влиянием комбинации BMP-2, BMР-4 тотипотентные клетки тератокарциномы или линии ЭСК мышей дифференцировались в хондроциты и адипоциты в обход мезенхимы (Kramer J.,Hegert C., Guan K. et al., 2000). Под влиянием других сигналов тотипотентные мезенхимальные стволовые клетки человека хорошо дифференцировались в адипоциты.
 Последний характерный пример нового прорыва с ЭСК - лабораторное получение клеток эндокринной части поджелудочной железы в обход органогенеза. В ранних наблюдениях было показано, что часть клеток в культуре НСК спонтанно дифференцировались в клетки, продуцирующие инсулин. Позже было обнаружено сходство программы начальной генной экспрессии в НСК и эндокринной части поджелудочной железы. Стволовые клетки поджелудочной железы и головного мозга имели нестин и общие экспрессированные гены. Возникновение инсулин-продуцирующих клеток требовало более однородной популяции некоммитированных клеток в культуре. Некоторые клеточные примеси блокировали программу созревания эндокринных клеток поджелудочной железы.
 
  Рис 1-11. Получение нестин+ клонов прогениторных клеток из ЭСК
 
  Последовательность включения ранних генов, контролирующих рестрикционное созревание нейронов и инсулин-продуцирующих клеток была прослежена на однородной популяции нестин+ прогениторных клеток. Смешанные популяции НСК, имеющие другие маркеры (виментин, GFAP) не генерировали бета- или альфа-клеток.
 
  Рис 1-12. Наборы soft-сигналов для получения инсулин-продуцирующих и глюкагон-продуцирующих клеток из НСК
 
  Научившись селективно размножать нестин+ НСК, авторы расшифровали комбинацию химических сигналов, которые направляли созревание прогениторных клеток либо в нейроны, либо в бета- и альфа-клетки. Фенотип лабораторных клеток островков Лангерганса был похожим на фенотип природных эндокринных клеток. Лабораторно полученные бета-клетки с пока низкой эффективностью нормализовали гипергликемию у животных с экспериментальным диабетом (Soria B., Roche E., Berna G., et al, 2000).. Содержание проинсулина в этих клетках было меньше, чем в природных.
 
  Рис 1-13. Получение разных линий нейронов из общего пула нестин+ субпопуляций НСК in vitro
 
  Впервые были найдены лабораторные способы наработки стволовых клеток мозга и показано, как химические сигналы направляли дифференцировку клеток в клоне. . Хотя уровень инсулина в полученных лабораторных бета-клетках был ниже, чем в природных островках, этот первый решенный генетический ребус помог найти software самого включения гена инсулина. Решить проблему количественной экспресии будет проще.
  Проблема происхождения эндотелиальных клеток была долгое время неразрешимым вопросом клеточной эмбриологии, исследовавшей появление новых линий специализированных клеток in situ. Исследования на ЭСК мышей сумели добавить новую страницу знаний. Хотя было известно, что первичные эндотелиоциты возникают из мезодермы, не удалось найти маркерных антител для самых ранних популяций. (Nishikawa S., Hirashima M., Nishikawa S. et al., 2001). Такие общеизвестные маркеры "раннего" фенотипа эндотелиальных клеток как Flk -рецептор и E-cadherin оказались непригодными, поскольку метили все клетки мезодермы. Более селективные маркеры выявили с помощью клеточного сортера, который помог изолировать субпопуляцию VEGEFR2+ Flk- E-cadh - клеток. В специальных средах эти предшественники дифференцировались в эндотелиоциты. Показательно, что фидер ОР9 из стромальных клеток поддерживал клоногенный рост эндотелиальных стволовых клеток. Введение цветного белка в стволовые клетки позволило визуализовать динамику созревания клонов. Таким образом, в лаборатории был не только прослежен по этапам путь созревания ЭСК в стволовую эндотелиальную клетку, но и налажено производство этих уникальных клеток со скоростью 10 (7) клеток в минуту. Хорошо известно, что стволовые эндотелиальные клетки широко сейчас используются в опытах на животных для экспериментальной неоваскуляризации сердца, почек, других паренхиматозных органов. Первоначально факторы ангиогенеза (рекомбинантные VEGF, FGF, HGF) рассматривались в качестве агентов No1 реваскуляризации ишемизированного сердца, почек, скелетной мышцы (Freedman S.B., Isner J.M., 2002; Toyoda M., Takayama H., Horiguchi N. Et al., 2001). Однако в последние годы все больший акцент делается на экспериментальную пересадку стволовых / прогениторных эндотелиальных предшественников с целью реорганизации микроциркуляции и улучшения кровонабжения в ишемизированной ткани (терапевтический васкулогенез) (Mirobara T., 2001). Стволовые клетки эндотелия также, по-видимому, характеризуются множественным фенотипом. Так, предшественники эндотелиальных клеток, идентифицированные в постнатальном колстном мозге человека, имели иммунофенотип, отличный от фенотипа стволовых клеток, получаемых через ЭСК (Reyes M/, Dudek A., Jahagridar A. et al., 2002).
  Хотя на рынке биоуслуг предлагается более 100 линий ЭСК, многие из них при трансплантации в бластоцисту не химеризуют зародыш, т.е. малоэффективны для изучения закономерностей постимплантационного эмбриогенеза. (O'Shea K.S., 1999). Однако у некоторых тщательно отобранных линий ТК и ЭСК удается вызвать экспрессию маркерных генов эпибласта, эстраэмбриональной энтодермы или первичной полоски. Эти селектированные линии ЭСК могут принести максимальную пользу в получении неограниченных клеточных масс эпибласта - главного биосырья банков клеток человека. Получение клеток эпибласта в обход оплодотворения и беременности будет второй революцией в биологии (после получения линий ЭСК человека), которая создаст фундамент новой медицины, использующей закономерности эмбриогенеза и клеточной регенерации для защиты от наиболее распространенных фатальных заболеваний человека.
  Получение специализированных клеток с варьирующим фенотипом идет в двух направлениях: а) через спонтанно формирующиеся эмбриоидные тельца (плюрипотентную зародышевую ткань) б) через культуру одиночных клеток ЭСК путем стимуляции начальной дифференцировки в трансфицированных клетках . Например, стимуляцию кардиогенеза вызывают лишней дозой гена Nkx-5-2, эритропоэза - лишней дозой HoxB4, нейрогенеза - лишней дозой Neuro D, миогенеза - лишней дозой Myo D гена . Хотя получаемые по этой прописи кардиомиоциты имеют полный фенотип, набор рецепторов и электровозбудимые ионные каналы, их выживаемость in vitro ограничена по сравнению с кардиомиоцитами, получаемыми из эмбриоидных телец. Различия двух клеточных популяций кардиомиоцитов проявляются не на уровне элементарного биохимического фенотипа, а на уровне поведения клеток, которое определяется согласованной работой всех биохимических машин и soft- программ кардиомиоцитов.
 
 
 
 
 
 
  10. ЭСК: законодательство и биоэтика
 
  После создания методов генной инженерии, рекомбинантных технологий переноса ДНК между клетками разных видов, завершения программы "Геном человека", получения первых линий ЭСК человека возникла новая биоэтика фундаментальных процессов, стоящих у истоков индивидуальной жизни. Эти новые реальности биоэтики нашли отражение в документе ЮНЕСКО: Биоэтика: международные аспекты (октябрь, 2001). Документ резюмирует итоги многочисленных круглых столов (52 государств на уровне руководителей министерств науки) по следующим стратегическим направлениям: а) эволюция базисных концепций и принципов биоэтики (достоинство, автономия, самоценность личности и прав с экстраполяцией на внутриутробный период развития человека); б) этика и научные исследования с клетками зародыша (предимплантационная диагностика заболеваний) в) использование геномных данных для диагностики и лечения (разработка новых биотехнологий получения зародышевых клеток); г) генетически модифицированные зародыши, клетки, линии ЭСК д) донорство и пересадки зародышевых клеток, включая ЭСК д) создание универсальных основ биоэтики и подготовка глобальных документов, регламентирующих деятельность ученых в этих областях биологии и медицины . В принятой ЮНЕСКО Универсальной Декларации о геноме человека и правах человека (1999 г) в статье 11 говорится: " Практика, противоречаящая человеческому достоинству, как репродуктивное клонирование человека, не разрешается. Государства и компетентные международные организации призываются начать кооперацию в идентификации злоупотреблений и разработке необходимых мер на государственном/межгосударственном уровне для выполнения принципов Декларации". При этом в следующей статье 12 Декларации постулируется: " Свобода научных исследований, необходимых для прогресса знаний, есть часть свободы мысли. Практическое приложение знаний генома человека должно быть направлено на уменьшение человеческих страданий, улучшения здоровья как индивидов, так и всего человечества". Разработки с геномом ЭСК есть часть этой общей стратегии.
  В Германии закон запрещает получение ЭСК, но разрешает работать ученым с импортированными линиями ЭСК. Госфинансирование позволяет работать с ЭСК животных и СК из тканей взрослого человека. В 2002 году Германия и Франция выступили с инициативой в ООН относительно глобального моратория на эксперименты по репродуктивному и терапевтическому клонированию человека.
  В Швейцарии закон запрещает эксперименты с ранними зародышами, включая терапевтическое клонирование стволовых клеток из бластоцист. Разрешено работать с импортированными ЭСК, но под строгим государственым контролем. В ООН Швейцария предложила рассмотреть вопрос о срочном первоочередном вето на любые эксперименты по репродуктивному клонированию (создание нового зародыша или взрослого организма из генома уже существовавшего человека). Вопросы, связанные с терапевтическим клонированием (включая создание и разрушение лабораторных бластоцист и предимплантационных зародышей) предложено рассмотреть в отдельном пакете, поскольку еще недостаточно научных данных, чтобы разобраться в альтернативных способах получения пролиферирующих плюрипотентных клеток.
  Во Франции разрешено работать с уже созданными ЭСК человека и получать новые линии с целью терапевтического клонирования органов и тканей больного человека. Запрещено репродукционное клонирование. В настоящее время Франция и Германия инициировали дискуссию в ООН о подготовке международной конвенции запрещающей рнпродукционное и терапевтическое клонирование плюрипотентных клеток в обход полового процесса.
  В Израиле принят закон о временном пятилетнем моратории на репродуктивное клонирование. Закон не регламентирует исследования с ЭСК с целью терапевтического клонирования и создания банков клеток для трансплантации. Ситуация с использованием ЭСК трактуется на базе притчи из Ветхого Завета. Там сказано, что Бог создал пшеничное зерно, чтобы человек научился добывать хлеб насущный. ЭСК создана, чтобы человек научился ими пользоваться во имя здоровья.
  В Великобритании, Бельгии и Швеции разрешены эксперименты с ЭСК для терапевтического клонирования клеток больного человека. Закон разрешил создание первого банка ЭСК. Разрешено создание и клонирование предимплантационных зародышей (до 14-го дня развития) для изолирования линий ЭСК. Репродукционное клонирование запрещено. Лицензии на работу с ранними зародышами и ЭСК выдаются специальной государственной комисссией.
  В Канаде пока не принято законодательство в отношении ЭСК и ранних зародышей. Но ученые и парламент склоняются к английскому варианту проекта.
  В Японии с июня 2001 г действует закон о запрещении репродуктивного клонирования, но разрешены эксперименты с зародышами, остающимися после процедуры искусственного оплодотворения. Репродукционное клонирование наказуется 10 годами тюрьмы и штрафом 90 000 ам. долларов. Закон позволяет клонировать предимплантационные зародыши для выделения ЭСК и создания банков клеток для трансплантации на их основе.
  В США госфинансирование распространяется только на официально зарегистрированные линии ЭСК. Создавать или разрушать ранние зародыши запрещено. Две трети населения поддерживают те работы с ЭСК, которые направлены на лечение ныне живущих пациентов.
  В России в первом чтении принят закон о временном (5-летнем) моратории на репродуктивное клонирование, в том числе частными компаниями. Нет никаких нормативных ограничений на работы с ЭСК.с целью терапевтического клонирования. Статус предимплантационных зародышей и внутриутробной жизни не имеет юридической нормы. Поэтому законодательство о правах человека не распространяется на эти стадии онтогенеза человека. Права зародышей могут зашишаться только средствами биоэтики. Аналогично ситуация трактуется в Великобритании, где парламент разрешил клонирование ранних зародышей человека для получения ЭСК.
  В Индии и Китае активно ведутся исследования как по получению линий ЭСК человека, так и разработке получения ЭСК из других биоисточников (межвидовых клеточных гибрилов).
  Разрыв между биоэтическими требованиями и реальным законодательством создает нерешенные узлы проблем:
  а) христианская биоэтика наделяет одноклеточный зародыш статусом новой жизни. Однако в западных клиниках разрешено криоконсервирование зигот и предимплантационных зародышей. Разрешены банки спермиев и яйцеклеток. Созданы все предпосылки для неконтролированного получения лабораторных зародышей человека.
  в) разрешено донорство яйцеклеток и спермы не только для целей искусственного оплодотворения
  г) не исключено, что генетические потенции ЭСК, а также мультипотентных стволовых клеток взрослого организма будут доведены до уровня тотипотентности зиготы. Это приведет к размыванию границ возможного в создании лабораторной одноклеточной/многоклеточной жизни, стыков клетки/организма
  История биологии показала, что нормирование законами любых спорных ситуаций лишь приносит вред науке и обществу. Только дальнейшее продвижение науки и ее практических границ порождает новые реалии, а с ними - новую биоэтику.
  Биоэтика играет важную роль мягкого буфера, позволяющего развивать науку на максимальном приросте полезных знаний с минимальными ошибками и злоупотреблениями. Злоупотребления порождаются не наукой, а бизнесом вокруг науки. Биотехнологические компании занимаются активно репродуктивным клонированием домашних животных на коммерческой основе. Уже первые шаги в этом направлении показывают, что фенокопии клонов, получаемых техникой переноса ядра соматических клеток, весьма варьируют, поскольку перкодирование генотипа в фенотип клеток зародыша жестко не контролируется в онтогенезе (фенотип СС- кошек, клонированных мышей и коз). Даже генетически тождественные организмы никогда не будут полными фенокопиями с учетом того, что фенотип любого организма изменяется во времени по мере старения. Поэтому биологический возраст донорских клеток будет существенно влиять на получаемые фенотипы клонов. Получение здорового потомства репродуктивным клонированием остается главной нерешенной проблемой. Есть предварительные данные о том, что эмбриогенез клонированных млекопитающих пока протекает с многочисленными ошибками, что приводит к болезням в постнатальном периоде. Потребуется значительное время, чтобы сделать соматический эмбриогенез подлинной наукой, на базе которой будут созданы эффективные и надежные процедуры клонирования у млекопитающих. До завершения опытов на животных невозможно начинать непресказуемые эксперименты с лабораторным воспроизведением постимплантационного эмбриогенеза человека.
 
 
  11. Мост между наукой и клиникой
 
 За последнее десятилетие, особенно после завершения программы "Геном человека" наметились заметные сдвиги в понимании роли клеток, особенно аномалий поведения клеточных популяций в патогенезе ведущих заболеваний человека. Опухолевые болезни человека рассматриваются как вариант аномального поведения стволовых/прогениторных клеток. Эти аномалии ускользают от контроля иммунных и информационных контрольных систем организма. Атеросклеротические бляшки представляют собой региональные дисплазии дериватов мезенхимы. Фиброзные дегенерации паренхиматозных органов, включая цирроз печени, рассматриваются как дисбаланс пролиферации (самообновления) стволовых клеток паренхимы и мезенхимы. Изменение относительных скоростей самообновление паренхиматозной и стромальной ткани ведет к превалированию стромы (фиброз, глиоз и т.д.). Интерес постгеномики сместился от отдельных генов с функциональным сетям генома, в которых одновременно задействованы сотни генов в тысячах разных клеток. Поведение клеток складывается из непрерывной работы митохондрий, ядра, рибосом, рецепторов, переносчиков ионов и помп. Ошибки в сигнальной сети, управляющей согласованной активностью клеток в тканях, являются частью видимых нарушений Многие заболевания возникают как поломки ""oftware", контролирующей переход, трансляцию биохимии внутриклеточных машин в целенаправленное поведение клеток. Поэтому современные подходы в биологии требуют изучения поведения клеток в культуре.
 Культура клеток - это единственно морально допустимый эксперимент на больном человеке. Артриты, эндоатерииты, ишемические болезни органов рассматривают с позиций клеточной реорганизации ткани, на базе аномалий поведения клеток, либо нарушений межклеточных коммуникаций. Средством лечения становятся стволовые клетки и soft-сигналы стволовых пространств, обеспечивающих повторную реорганизацию архитектоники эндотелия, капилляров, сосудов, баланс мезенхимальной и паренхимальной ткани. Здоровый клеточный статус органов обеспечивается за счет периодической самообновляемости клеток. Трансплантация стволовых /прогениторных клеток вместе с цитокинами и митогенами стволовых пространств ускоряет замену больных клеток на здоровые.
 Однако между важными фундаментальными находками в экспериментах на животных и их клинической апробацией сохраняется длинная дистанция. Менее 1% всех важнейших находок вокруг ЭСК находят применение у постели больного. Не вызывает сомнений, что в ближайшее время огромные финансы вместе с научными ресурсами будут затрачены на решительное сокращение расстояния между научными данными и той формой знаний и умений, которые получают "зеленый свет" в клинику.
 Крупнейшие биотехнологические компании уже "затоварены" патентами, поскольку за год удается осваивать 1-2 новых открытия. Глобальная сетевая компьютеризация биомедицинских исследований позволит упростить и стандартизировать схемы предклинических испытаний и систему критериев для переноса работы в клинику.
 Превращение стандартно выделенных ЭСК в биотрансплантат требует стандартизации всей технологической цепочки: выделения, наращивания, дифференцировки получаемых клеток по системе международных общепринятых критериев..
  GМP-протокол выделения ЭСК и их дериватов требует стандартизациа на уровне верхних критериев качества следующих этапов лабораторной работы: а) качество помещений и оборудования для проведения стерильного выращивания клеток б) качество посуды разового пользования и реагентов в) квалификация и экспертиза специалистов г) характеристика исходного материала для выделения ЭСК д) выделение клеток из тканей по системе общепринятых критериев жизнеспособности клеток, очистки, морфологической целостности, функциональной активности. GMP-протокол выделения ЭСК должен верифицировать выделение малой популяции клеток из первичного источника, избирательную пролиферацию и накопление доли интересующих жизнеспрособных, функционально активных прогениторных клеток. Первый этап GМP-протокола связан с прописью (методикой) получения желаемого количества незрелых прогениторных клеток в виде биосырья для второго биотехнологического этапа.
  Второй этап GМP- протокола содержит информацию о путях лабораторного (in vitro) получения макроколичеств (10(7)- 10 (9) моно-дифференцированных клеток в услояих культуры.
  На третьем этапе в опыте на животных демонстрируется безопасность (biosafety) пересаживаемых клеток, их терапевтическая эффективность, а также отсутствие иммунологических вторичных реакций на трансплантат. GМP-технологии стандартного единообразного повторяемого выращивания стволовых клеток являются мостом, соединяющим работу специалиста биолога в лаборатории с технологией good clinical practice (GСP), которая обязательно вопроизводится при первом, втором и третьем клиническом испытании новых биоактивных препаратов (особенно живых клеток).
 
 
 Рис 1-13. От GLP-технологии выделения стволовых клеток к GСP- клиническим испытаниям биотрансплантата
 
 12. Литература
 
 Репин В.С., Медицинская клеточная биология, 1998, БЭБМ, Москва
 Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка (от фундаментальной биологии к медицине), Усп. физиол.наук, 2001, 32, 3-19
 Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка, Патол. физиология и эксперим.терапия, 2001, вып.2, 3-8
 Akira S., Functional Role of STAT family proteins: Lessons from Knockout Mice, PNAS, 1999, 17, 138-46
 Andrews P.W., Przyborski S.,Thomson J.A.,Embryonal carcinoma cells as ESC, In: Stem Cell Biology, (ed. Marshak D.R., Gardner R.L., Gottlieb D.), CSH Lab.Press, 2001, 231-66
 Beddington R., Robertson E.J., Axis development and early assymmetry in mammals, Cell, 1999, 96, 195-209
 Brustle O, Jones K, Lereaish R. et al., Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinating transplants, Science, 1999; 285, 754-756
 Charkravarthy M.V., Spangenberg E.E., Booth F.W., Culture in low level of oxygen enchances in vitro proliferation potential of muscle satellite cells, Cell Mol. Life Sci., 2001, 58, 1150-58
 Chaudhary J., Johnson J., Kim J. et al., Hormonal regulation and differential action of HLH transcriptional inhibitors of differentiation (ID1,ID2,Id3,Id4) in Sertoli cells, Endocrinology,2001, 142, 1727-36
 Cho S.K., Webber T.D., Carlyle J. et al., Functional characteristics of B lymphocytes generated in vitro from mouse ESC, Proc.Natl.Acad.Sci.US,1999, 96, 9797-802
 Cibelli J.,Stice S.I., Robl J.M. et al.,Transgenic bovine chimeric offsprings produced from somatic cell derived stem -like cells, Nature Biotechnol.,1998, 16, 642-46
 Colman A., Kind A., Thrapeutic cloning: concepts and practicalities, TIBTECH,2000, 18., 192-96
 Compagnoli C., Fisk N., Tocci A. et al., Circulating stromal cells in first trimester fetal blood, Blood (Suppl.1), 94, 38a, (Abstr 157)
 Daga A., Podesta M., Capra M.C. et al., The retroviral transduction of Hox-C4 into human CD34+ cells induces the expansion an in vitro clonogenic and early progenitors, Exp. Hematol., 2000, 28, 569-74
 Dale K.J., Pourquie O., A clock-work somite, BioEssays, 2000, 22, 72-83
 Dani C., Smith A.G., Dessolin S. et al., Differentiation of ESC into adipocytes in vitro, J. Cell. Sci., 1997, 110, 1279-85
 Deans R.J., Moseley A.B., Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses, Exp.Hematol.,2000,28, 875-84
 Doevendans P.A., Kubalak S.W., An R.H. et al., Differentiating cardiomyocytes in floating embryoid bodies is comparable to fetal cardiomyocytes, J.Mol. Cell.Cardiol., 2000, 32, 839-51
 Dormady S.P., Bashayan O., Dougherty R. et al., Immortalized multipotential mesenchymal stem cells in the hematopoietic microenvironment, J.Hemotherapy, Stem Cell Res., 2001, 10, 125-40
 Du Z., Cong H., Zhen Y., Identification of putative downstream genes of Oct4 by supression-subtractive hibridization, Biochem.Biophys.Res.Comms.,2001,282, 701-6
 Fan Y., Melhem M., Chailler R., Forced expression of Hox-gene Pem blocks differentiation of ESC, Dev. Biol., 1999,210, 481-96
 Flake A.W., Fate Mapping of Stem Cells, In: Stem Cell Biology, (ed. Marshak D.R., Gardener R.L.,Gottlieb D.), CSH Lab.Press, 2001, 375-98
 Freedman S.B., Isner J.M., Therapeutic angiogenesis for coronary artery disease, Ann. Int. Med., 2002, 136, 54-71
 Friedenstein A.J., Chailachyan G.K., Latsinik N.V. et al., Stromal cellss responsible for transfering the microenvironment of the hemapoietic tissue. Cloning in vitro and retrotransplantation in vivo.,Transplantation,1974,17, 331-340
 Friedenstein A.J., Owen M. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic progenitors,CIBA Found.Symp.,1988, 136, 42-60
 Gage F., Mammalian Neural Stem Cells, Science, 2000, 287, 1433- 42
 Geiger H., Sick S., Bonifers C. et al., Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult hepopoietic stem cells into mouse blastocysts, Cell, 1998, 93, 1055-65
 Gook D.A., Osborn S.M., Johnston W.I., Parthenogenetic activation of human oocytes following cryopreservation using propandienol, Human Rep., 1995, 10, 654-8
 Guo X., Ying W., Wan J. et al., Proteomic characterization of early-stage differentiation of mouse ESC into neural cells induced by retinoic acid in vitro, Electrophoresis, 2001, 22, 3067-75
 Harder F., Henschler R., Junghahn I., Human hematopoiesis in murine embryos after injection human cord blood derived hemopoietic stem cells into murine blastocyst, Blood, 2002, 99, 719-21
 Indamar M., Koch T., Rapoport R. Et al., Yolk-sac-derived murine macrophage cell line has a counterpart during ES cell differentiation, Dev.Dyn.,1997, 210, 487-97
 Jackson K.A., Mi T., Goodell M.A., Hematopoietic potential of stem cell isolated from murine skeletal muscle, PNASUS, 1999, 96, 14482-86
 Kaido T., Yamaoka S., Tanaka J. et al., Continous HGF supply from HGF-expressing fibroblasts transplanted into spleen prevens CCl4-induced acute liver injury in rats, Biochem.Biophys.Res.Comms., 1996, 218, 1-5
 Kanzler B., Dear T.N., Hox11 in spleen development, Dev. Biol., 2001, 234, 231-43
 Kappen C., Disruption of Hox-B6 genes results in increased numbers of f early erythrocyte progenitors in mice, Am.J. Hematol., 2000, 65, 111-118
 Kato Y.,Tani T., Sotomaru Y. et al., 8 calves cloned from somatic cells of single adult, Science, 1999, 288, 2095-98
 Kawazaki H., Suemori H., Mizuseki K. et al., Generation of DOPA-neurons and pigmented epithelia from primate ESC by stromal cell-derived inducing activity, Proc.Natl.Acad.SciUS, 2002, 99, 1580-5
 Kehat, I., Kenyagin-Karsenti D., Snir M. et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J. Clin. Invest., 2001, 108, 407-414
 Kelli D.L., Rizzino A.; DNA Microarray analysis of genes regulated during the differentiation of embryonic stem cells; Mol.Reprod.Devel.,2000, v.56, 113-23.
 Kikyo N., Wolffe, Reprogramming niclei: insights from cloning, nuclear transfer and heterokaryons, J. Cell Sci., 2000, 113, 11-20
 Knezevic V., Mackem S., Activation of epiblast gene expression by the hypoblast layer in the prestreak chick embryos, Genesis,2001, 4, 264-73
 Kobayashi Y., Hamanoue M., Ueno S. et al., Induction of hepatocyte growth by intraportal infusion of HGF into beagle dogs, Biochem.Biophys. Res. Comms.,1996, 220, 7-12
 Kollet O., Aviram R., Chebat J. et al., The soluble interleukin-6 (IL-6) receptor/IL-6 fusion protein enchance in vitro maintenance and proliferation of human CD34+,CD38-(low) cells capable of repopulating SCID mice, Blood, 1999, 94, 923-31
 Korbling M., Katz R.L., Khanna A. et al.,Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells, N.Engl.J.Med., 2002, 346, 770-2
 Kramer J.,Hegert C., Guan K. et al., ESC-derived chondrogenic differentiation in vitro: the role of BMP-2 and BMP-4, Mech.Dev., 2000, 92, 193-205
 Kuznetsov S.,Mankani M., Gronthos S. et al., Circulating skeletal stem cells, J. Cell Biol., 2001, 1133-39
 Labosky P.A., Weir M.P., Grabel L.B., Hox genes in teratocarcinoma embryoid bodies: a possible role of Hox-12 (Hox-4.7) gene in establishing extraembryonic endoderm lineage in the mouse, Dev. Biol., 1993, 159, 232-44
 LaCelle P.T., Polakowska R.R., Human Hox-A7 regulates reratinocytes transglutaminase I and inhibits differentiation, J. Biol.Chem.,2001, 276, 32844-53
 Lazarus H.M., Haynesworth S.E., Gerson S.L. et al., Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells: implication for therapeutic use, Bone Marrow Transpl.,1995, 16, 557-60
 Leahy A.,Xiong J.W., Kuhnert F. et al, Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation, J. Exp.Zool., 1999, 284, 67-81
 Lemischka I., The power of stem cell reconsidered ? Proc.Natl. Acad.Sci.US, 1999, 96, 14193-95
 Liechy K.W., MacKenzie T.C., Shaaban A.F. et al., Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep, Nature Med, 2000, 6, 1282-86
 Liang L., Bickembach J.R., Somatic epidermal cells can produce multiple cell lineages during development, Stem Cells, 2002, 20, 21-31
  Ling V., Neben S., In Vitro differentiation of ESC, J. Cell Physiol, 1997, 171, 104-15
 Liu S.,Qu Y.,Stewart T.J. et al., Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation, Proc.Natl. Acad. Sci US; 2000, 97, 6126-31
 Long K.D., Kennedy G., Balaban E., Transfering an inborn auditory perceptual predisposition with onterspecies brain transplants, Proc.Natl.Acad.Sci US, 2001, 98, 5862-7
 Lumelsky N., Blondel O., McKey R. et al, Differentiation of ESC to insulin-secreting structures similar to Pancrearic Islets, Science,2001, 292,1389-93
 Martin G.R., Isolation of pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in the medium conditioned by teratocarcinoma stem cells, Proc.Natl. Acad. Sci. US, 1981,78,7634-38
 Marshak D.R.,Gottlieb D.,Gardner R.L.,Introduction: Stem Cell Biology, In: Stem Cell Biology,2001, CSH Lab.Press, N.Y., p.3
 McBrearty B.A.,Clark L.D.,Zhang X.M. et al.,Genetic analysis of mammalian wound-healing traits, Proc. Natl. Acad.SciUS, 1998, 95, 11792-97
 McKey R., Stem cells in the Central Nervous System, Science, 1997, 276, 66-71
 Mirobara T., Therapeutic vasculogenesis using human cord blood-derived endothelial progenitors, Trends Cardiovasc. Med., 2001, 11., 303-7
 Mountford P., Nichols J., Zevnik B. et al., Maintenance of pluripotenr ESC be stem cell selection, Reprod.Fertil. Dev.,1998, 10, 527- 33.
 Morrison S.J., Shah N.M., Anderson D.J., Regulatory mechanism in stem cell biology, Cell, 1997, 88, 287-98
 Muller U., 10- y of gene targeting biology: targeted mouse mutans, from vector design to phenotype analysis, Mech. Dev., 1999, 82, 3-21
 Nicols J.,Zevnik B., Anastassiades K. Et al., Formation of pluripotent cells in the mammalian embryos depends on the POU ytanscription factor, Cell, 1998, 779-91
 Nishikawa S., Hirashima M., Nishikawa S. et al., Cell biology of vascular endothelial cells, 2001, 947, 35-41
 Nishimoto M., Fukushima A., Okuda A. Et al., The gene of ESC cell coactivator gene UTF1 carries a regulatory element which selectively interacts with complex of Oct4/Sox-2,
 Mol. Cell Biol., 1999,19, 5453-65
 Nogueira M.M., Mitjavila-Garcia M.T., LePadteur F. tt al., Regulation of ID gene expression during ESC-derived hemapoietic stem cell differentiation, Biochem.Biophys.Res.Comms.,2000, 276, 803-12
 Odorico J.S., Kaufman D.S., Thomson J.A., Multilineage differentiation from human ESC lines, Stem Cells, 2001, 19, 193-204
 O'Shea K.S. Embryonic Stem Cell Models of Development, Anat.Rec.,1999, 257, 32-41
 Patrick P., Tam L., Gad .L.M., et al., Morphogenetic tissue movement and the establishment of body plan during development from blastocyst to gastrula in the mouse, BioEssays, 2001, 23, 508-17
 Pera M.F., Human pluripotent stem cells: a progress report, Curr.Opin.Genet.Dev., 2001, 11, 595-99
 Petit-Zeman S., Regenerative Medicine, Nature Biotechnol.,2001,19,201-205
 Quaini F., Urband K., Bertrani A. et al, Chimerism of the transplanted heart, N.Engl.J.Med.,2002, 346, 55-6
 Rathjen J., Lake J.A., Bettesse M.D. et al., Formation of primitive ectoderm like cell population from ESC in response to biologically derived factors, J.Cell Sci.,1999,112, 601-12
 Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C. et al., ESC lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro, Nature Biotechnol., 2000, 18, 399-404
 Reyes M., Dudek A., Jahagridar A. et al., Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow, J.Clin. Invest.,2002, 109, 337-46
 Rhoton-Vlasak L., Lu P.Y., Barud K.M. et al., Efficacy of Ca++ ionophore A23187 oocyte activation for generation of parthenotes for human embryo research, J.Assist. Repr.Genetic., 1996, 13, 793-6
 Robertson E.J., Embryo-derived stem cell lines, In: Teratocarcinoma and ESC: a practical approach,Oxford,IRL Press, 1987, 71-112
 Rodewald R.G., Paul S., Haller S. et al, Thymus medulla consists of epithelial islets ferived from a single progenitor, Natue, 2001, 414, 763-8
 Saburi S, Azuma S, Sato E, et al., Developmental fate of single embryonic stem cells microinjected into 8-cell-stage mouse embryos. Differentiation, 1997, 62, 1-11
 Shamblott M.J.,Axelman J.,Gaerhart J.D. et al., Derivation of pluripotent stem cells from cultured primordial germ cells, Proc.Natl.Acad.Sci.US, 1998, 95, 13726-31
 Schamblott M.J., Axelman J.,Littlefield J.W., et al., Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensivelly in vitro. Proc.Natl.Acad. Sci.US, 2001, 98, 113-18
 Schuldinger M., Yanuka O., Itskovitz-Eldor J. et al., Effects of 8 growth factors on the differentiation of ESC, Proc. Natl. Acad. Sci US, 2000, 97, 11307-312
 SevantesR.B., Stringer J.R., Shao C., et al., ESC and somatic cells differ in mutation frequency and type, Proc.Natl.Acad.Sci.US, 2002, in press.
 Sheenan S.M., Tatsumi R., Temm-Grove C.J. et al., HGF is an autocrine growth factor for skeletal muscle satellite cells in vitro, Muscle@Nerve, 2000, 23, 239-45
 Schnabel C.A., Yacobs Y., Clearly M.L., HoaA9-mediated immortalization of myeloid progenitors requiers functional interactions with TALE cofactors Pbs and Meis, Oncogene,2000, 19, 608-16
 Smith A.G., Embryo-derived Stem Cells: of Mice and Men, Ann.Rev. Cell Dev. Biol.,2001,17, 435-62
 Smyth N., Vatansever H.S., Murray P. et al., Targeting of the LAMC1 gene results in embryonic lethality due to failure of endoderm differentiation, J.Cell Biol., 1999, 144, 151-60
 Soria B., Roche E., Berna G. et al., Insulin-secreting cells derived from ESC normalize glycemia in diabetic rats, Diabetes, 2000, 49, 157-62
 Surani M.A., Parthenogenesis in Man, Nature Genet., 1995, 11, 164-9.
 Talbot N.C., Carrett W.M., Ultrastructure of ESC of the 8-day pig blastocyst before and after manipulation, The Anat.Rec., 2001,264, 101--13
 Terskykh A.,Easterday M., Linheng L. et al., From Hematopoiesis to neuropoiesis: evidences of overlapping genetic progremme, Proc.Natl.Acad.Sci.US, 2001, 98, 7934-39
 Thomson J.A.,Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al., Embryonic stem lines derived from human blastocyst, Science, 1998, 282, 1145-47
 Toma J.G., Akhavan M., Fernandes K.J. et al., Isolation of adult multipotent stem cells from the dermis of mammalian skin, Nature Cell.Biol., 2001, 9, 778-84
 Toyoda M., Takayama H., Horiguchi N. Et al, Overexpression of HGF|SCF promotes vascularization and granulation tissue formation in vivo, FEBS Letters, 2001, 509, 95-100
 Tremain N., Korkko J., Ibberson D. Et al., MicroSAGE analysis of 2353 expressed genes in a single cell derived colony of of human mesenchymal stem cells reveals mRNA of multiple cell lineages, Stem Cells, 2001, 19, 408-18
 Tsutsumi S., Shimazu A., Miyazaki K. et al., Retention of multilineage potential of MSC during proliferation in response to bFGF, Biochem.Biophys.Res.Comms.,2001, 288, 413-19
 Ueki T., Kaneda Y., Tsutsui H. Et al., HGF gene therapy of liver chirrosis in rats, Nature Med., 1999, 5, 226-30
 Voss T., Thomas T., Petrou P. et al., Taube Nuss - a novel gene essential for the survival of pluripotent cells of early mouse embryos, Developm., 2001,127, 5449-61
 Xiong J.W., Battaglino R., Leahy A. et al., Large-scale screening for developmental genes in ESC, Devel.Dyn.,1998,212, 181-97
 Xu C., Inokuma M.S., Denham J. et al., Feeder-free growth of undifferentiated human ESC, Nature Biotechnol.,2001, 19, 971-74
 Yang J., Liu Y., Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by HGF prevents renal interstitial fibrosis, J. Am. Soc.Nephrol., 2002, 13, 96-107
 Yen Y., Manova K., Benezra R., Each member if Id gene family exhibits an unique expression pattern in mouse gastrulation and neurogenesis, Dev.Dyn., 1997, 208, 92-106
 Young H.E., Duplaa C., Young M. et al, Clonogenic analysis reveals reserve stem cell in postnatal mammala, Anat.Rec., 2001, 263, 350-360
 Young H.E., Steele T..Bray R.A. et al, Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissue of sceletal muscle and dermis, The Anat Rec,2001, 264,51-62
 Vieille I., Roullot V., Courtis G., Lineage and stage specific expression of Hox-1 gene in the human hemopoietic system, Biochem.Biophys.Res.Comms.,1992, 183, 1124-30
 Wakayama T., Tabar V., Rodrigues I. et al., Differentiation of EC lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer, Science, 2001, 292, 740-43
 Wakayama T., Rodrigues I., Perry A.C. et al., Mice cloned from embryonic stem cells, Proc.Natl.Acad.Sci.US, 1999, 98, 14984- 89
 Wang S., Gaerhart J.D., Human pluripotent stem cells, Pediatrics in Rev, NeoRev, 2000, 1, e132-e136
 Watt F.M., Hogan B. Out of Eden: Stem Cells and Their Niches, Science, 2000, 287, 1427-33
 Wei G., Schubiger G., Harder F. et al., Stem cell plasticity in Mammals, Stem cells, 2000, 18, 409-19
 Weiss M., Orkin S.D., In vitro differentiation of murine ESC, J. Clin. Invest., 1996, 146., 591-96
 Weissman I., Translating Stem and Progenitor Cell Biology to the Clinic: Barriers and Opportunities, Science, 2000, 287, 1442-1446
 Wernig M., Brustle O., 50 ways to make a neuron: shifts in stem cell hierarchy and their implication for neuropathology and CNS reapir, J. Neuropathol..Exp.Neurol., 2002, 61, 101-10
 Willing A.E., Cameron D.F., Sanberg P.R., Sertoli cell transplants: their use in the treatment of neurodegenerative disease, Molecular Medicine ToDay, 1998, 4, 471-77
 Zimmerman F., Rich I.N., Mammalian Hox-B6 expression correlates with erythropoietin productio n and erythropoiesis, but not with isolated stem cell populations
 Blood,1997, 89, 2723-35
 Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al., Multilineage lines from adult adipose tissue: implications for cell based therapy, Tissue Eng., 2001,7, 211-28
 Zvaifler N., Marinova L., Adams G. et al., Mesenchymal precursors in the blood of normal individuals, Arthriris Res., 2000., 2, 477-88
 
 
  ГЛАВА ВТОРАЯ
 
 
 Стволовые клетки в эмбриогенезе мозга млекопитающих
 
  "Природа работает в любых масштабах, если она этого пожелает"
  К. Бонне (1764 г )
 
 
  1. Модели на стыке клеточной биологии и геномики
 
  Истоки всех сил развития ЦНС изначально концентрируются в монослое нейроэктодермы зародыша. Начальный морфогенез мозга представляет диалог "soft-сигналов" с провизорными клетками нервной трубки, включающий скрытый латентный период преобразования soft-signals в новые молекулярные устройства и новый фенотип клеток. Программы меняют устройство клеток через набор транскрипционных факторов. Устройство клеток определяет их судьбу и функции. Эмбриогенез ЦНС - это многократный рост численности с одновременным кардинальным обновлением клеток. Одиночные стволовые клетки превращались в сеть прогениторных клеток, которые в ходе миграции дифференцировались в специализированные линии нейронов и глии. В ходе гаструляции монослой примитивной нейроэктодермы (эпибласта) превращается в три зародышевых листка: экто-, мезо- и эндодерму. Значительная часть первичной эктодермы трансформируется в нейроэктодерму - провизорный орган и временный банк основной массы некоммитированных стволовых клеток. Три зародышевых слоя генерируют плюрипотентные стволовые клетки. Образование эктодермы и мезодермы происходит in vitro из тотипотентных клеток тератокарциномы или ЭСК. Удаление из среды культивирования LIF и слоя фидера вело к остановке пролиферации. Постмитотические незрелые клетки дифференцировались в эмбриоидные тельца. Варьируя комбинацией ростовых факторов/индукторов, направляли дифференцировку агрегатов ЭСК в сторону эктодермы или мезодермы. Хотя НСК удавалось получить из ЭСК в культуре, этот путь , как мы увидим , методически труден и пока работает лишь в микромасштабе. Вырастить нейросферы из клеток первичной нейроэктодермы пока также не удалось. В то же время культуру НСК получили практически без проблем из всех отделов развивающегося мозга. Интересен механизм роста клонов НСК. Прогениторные клетки, покидающие клон, подвергались рестрикционному созреванию. Часть клеток вне клона направленно мигрировала в развивающемся мозге. Незаменимую роль в миграции прогениторных клеток играла сеть радиальной глии (РГ), которая опережающе возникала из нейромезенхимы, а также стволовых клеток хориоидного сплетения. Большинство дефинитивных структур мозга млекопитающих и человека собрано из пришлых клеток.
  Быстрый прогресс в методах выращивания ЭСК и НСК был обусловлен несколькими обстоятельствами. Во-первых, метод двойной рекомбинантной делеции (нокаута) материнской и отцовской аллели гена в ЭСК приоткрыл роль многих "ранних" генов органогенеза и нейруляции. С помощью knockout-мутаций составлена карта расположения главных генов на хромосомах, реестр их функций, место и время действия в нервной трубке, прозо- и ромбомерах. Во-вторых, пересадки стабильно меченых НСК/прогениторных клеток в мозг развивающихся зародышей дали метод количественного подсчета founder cells в коре, мозжечке, гиппокампе. С помощью меченых НСК составлена карта "миграции" клонов в растущем развивающемся мозге. В-третьих, культура эксплантатов помогла расшифровке эпигеномных механизмов нейрогенеза (индукция нервной пластинки, регионализация нервной трубки, селекция клеток апоптозом, направленная миграция прогениторных популяций, терминальная дифференцировка постмитотических клеток ).
 Стволовые клетки начинают все программы поэтапного развития мозга как у млекпитающих, так и у человека. Software созревания нейрональных стволовых клеток in situ и in vitro остается ключем к практическим целям, имея в виду направленную регенерацию поврежденного спинного и головного мозга.
  НСК мозга млекопитающих и человека характеризуются следующими особенностями: 1) возникают естественным путем в нервной трубке 2) имеют "минимальный" белковый фенотип 3) делятся ассимметрично, либо симметрично в клонах 4) сохраняют потенцию к максимальному числу делений в незрелом состоянии
 5) сохраняют плюрипотентность - способность дифференцироваться в любую специализированную линию нейронов, олигодендроцитов или астроглии 6) сохраняют мультипотентность в реципиентной ткани 7) сохраняют фенотипическую гетерогенность в разных отделах мозгах (в том числе к сигналам пролиферации и дифференцировки) 7) хорошо выживают в изолированной мозговой ткани при +4 С 8) Имеют ограниченный набор "маркерных" молекул для идентификации. Белковый репертуар и антигенный "профиль" НСК много беднее, чем нейронов и глии.
 
 
  2. Нервная трубка - первоисточник провизорных стволовых клеток
 
 Подобно другим провизорным органам, нервная трубка является временным вместилищем стволовых клеток ЦНС. Нервная система зародыша человека возникает из трех областей нейроэктодермы: 1) нервной пластинки (ЦНС, соматические мотонейроны и преганглионарная часть вегетативной нервной системы) 2) клеток нервного гребня ( периферическая автономная нервная система) 3) эктодермальной плакоды (сенсорные ганглии краниальных нервов, гипофиз, нейроэпителий внутреннего уха и глаза). Процесс закладки и формирования нервной трубки протекает в несколько стадий. Сперва по краям нервной пластинки появляются мигрирующие нервные складки, которые, сливаясь по срединной линии, дают нервную трубку. Белковый продукт гомеозисного Sox-1 гена выявлялся в первичной нейроэктодерме, хотя мРНК всего семейства HMG-(high mobility group) Х-хромосомы гораздо раньше накапливались в зрелых яйцеклетках и сохранялись в ранних зародышах. Белки-репрессоры Sox-генов контролируют плотную упаковку хроматина с удержанием плюрипотентности генома клеток нейроэктодермы (Vriz S., Joly C., Boulekbache H. et al., 1999 ). Sox-1, Sox-2, Sox-3 гены уже экспрессированы в нейроэктодерме на стадиях образования первых сомитов Второй парой генов, контролирующих плюрипотентность генома нейроэктодермы, являются Xdbx и Xash3. Избыточная экспрессия этой пары генов в нервной трубке вызывала остановку созревания и избыточную пролиферацию незрелых клеток. Продукты последних двух генов блокировали эктопический нейрогенез НСК после пересадки кусочков нейроэктодермы в мозг реципиентов (Gershon A.A., Ridnick J., Kalam L. et al., 2000). Семейство Zic- генов также экспрессировано в начале нейрогенеза. В дорзальной части нервной трубки экспрессированы мРНК Zic-1 гена. После закрытия нервной трубки Zic-1 ген экспрессирован в клетках нервного гребня, включая мигрирующие прогениторные популяции, покидающие гребень.
 
 
 
  Рис 2-1. Схема направленной миграции прогениторных клеток мозга эмбрионов по матриксу радиальной глии
 
  Рецепторы клеточной адгезии играли решающую роль в направленной миграции клеток нервной трубки. Передняя часть нервной трубки трансформировалась в головной мозг. Нервная трубка над нотохордой превращалась в спинной мозг. Первый прорыв был связан с расшифровкой механизма действия организатора, описанного в 20-х годах ХХ века Шпеманном и Мангольдом. Трансплантация нотохорды перепела в эмбрион цыпленка вызывала образование дополнительной нервной трубки. Это подтвердило эквипотенциальность организатора у разных видов. Эктопический гомотрансплантат клеток с сильно экспрессированным геном goosecoid индуцировал образование второй оси развития зародыша, причем донорские клетки "навязывали" зародышу-реципиенту экстра- нейруляцию. Опыты доказали ключевую роль гена goosecoid в запуске нейруляции (Boncinelli E., Mallamaci A., 1995). На следующем этапе транскриптаза goosecoid запускала второй эшелон регуляторов. Секретируемые окружающей тканью белки noggin, chordin, follistatin, Xnr3 инактивировали действие ВМР-7/ВМР-4, блокируя превращение плюрипотентной незрелой эктодермы в мезодерму. Стимуляторы нейруляции ( FGF -2, FGF-5, Wnt1, Wnt3, Sonic Hedgehog - SHH-A) направляли созревание плюрипотентных клеток в линии нейронов/глии. Мутация SHH-/- блокировала сегментацию и образование прозомеров в передней части нервной трубки мышей. Избыточная экспрессия транскриптазы Wnt-1 вела к региональной экспансии незрелых клеточных масс.
  Баланс концентрации противоположных по эффекту сигналов направлял созревание нейроэпителия. Главным "вентральным" сигналом был белок SHH, секретируемый нотохордой. (Рис 2-2). Зародыши Mash-1 -/- мышей погибали из-за тотального блока развития нервной трубки, нарушения созревания гранулярных клеток мозжечка, рецепторных клеток внутреннего уха, краниальных сенсорных нейронов, обонятельных нейронов, адренэргических нейронов базальных структур мозга и периферической нервной системы. У Math1-/- мышей было блокировано развитие гранулярных нейронов мозжечка и рецепторных нейронов внутреннего уха. Этот же ген, видимо, выключал созревание гранулярных клеток мозжечка и рецепторных клеток вестибулярного аппарата и внутреннего уха (Helms A.W., Abney A.L., Ben-Arie N. et al., 2000).
 
 Стимуляторы пролиферации
 SHH
 Chordin
 Noggin
 Follistetin
 Xnr3
 FGF-2
 FGF-5
 Wnt-1
 Wnt-3 Блокаторы пролиферации
 
 BMP4 BMP7
 дорзалин
 TGF-?
 
 
 Абортивный ранний нейрогенез
 
  Рис 2-2. Схема экспрессии генов нейруляции
 
 
  На больших растояниях эффект SHH уравновешивался Gli3- транскриптазой. С дорзальной стороны эпидермис генерировал три сигнала - ВМР-4, ВМР-7 и дорзалин (дериват TGF-beta). Латеральная экспрессия Рах-3 и Рах-6 в мезодерме необходима для нормального развития нервной трубки. Рах-3/Рах-6 метят прогениторные пролиферирующие клетки. Замыкание нервной трубки завершало образование монослоя нейроэпителия - эпендимы. У зародышей мышей Lim1-/- блокировано закрытие нервной трубки. Noggin, chordin, follistatin служили костимуляторами формирования нервной трубки. SHH множественными путями участвовал в нейруляции с разными группами плюрипотентных клеток. В ранних провизорных и стволовых клетках была выявлена изоформа SHH-A, которая напрямую связана с митотическим каскадом МАРК и с рецептором тирозиновой киназы RPTK ( Conti L., Sipione S., Magrassi L. et al , 2001). В новорожденном мозге SHC-A локализован исключительно в герментативном слое ЦНС. В постмитотических нейронах идентифицирована другая изоформа -SHC-C. Активаторы цАМФ и протеинкиназы С также стимулировали образование нервной трубки. Первичная нейруляция сопровождалась образованием нервного гребня из клеток нейромезенхимы .
  В эпендиме/субэпендиме концентрировались главные пулы стволовых клеток нервной трубки, что верифицировано прокраской срезов развивающегося мозга мышей и крыс антителами к нестину. Количество нестин+ клеток (дериватов нейроэпителия трубки) экспоненциально нарастало по всем областям растущего мозга. Антитела к нестину окрашивали новообразованные клетки радиальной глии (РГ). Рост нестин+ клеточной массы визуально прослеживали на макросрезах головного мозга у трансгенных животных .
 
 
 
 
  Рис 2-3. Визуализация нестин+ стволовых/прогениторных клеток в головном и спинном мозге зародыша мыши 16 дня развития
 
 
  У трансгенных зародышей c вставленной конструкцией флуоресцентного GFP-белка под нестиновым промотером подавляющая часть светящихся клеток собрана вокруг перивентрикулярной области мозга. Слои GFP-окрашенных клеток радиально разрастались in situ, заполняя все быстро растущие области головного мозга. Зоны интенсивного роста состояли из клонов НСК, клетки которых делились и направленно мигрировали в новые отделы и ядра мозга. ( Рис. 2-3). На поздних стадиях созревания нейробластов градиент SHH достаточен для вентральной дифференцировки мотонейронов. С дорзальной стороны ВМР-4, ВМР-7 и дорзалин направляли дифференцировку сенсорных нейронов. В постнатальном периоде НСК сохранялись в эпендиме и субэпендимальном слое вокруг желудочков, а также в гиппокампе, обонятельной луковице, коре и других структурах (Dalstrand J., Lardelli M., Lendahl U.,1995).
  Перивентрикулярная область взрослого мозга млекопитающих остается "реликтом" эмбрионального мозга с остатками стволовых ниш. В этих зонах сохранились гетерогенные популяции плюрипотентных клеток (Doetsch, F., Caille, I., Lim, D.A., et al., 1999). Эти клетки in situ прокрашивались антителами к нестину, виментину, GFAP и Noggin. Локальные инъекции Noggin стимулировали разрастание перивентрикулярных клонов прогениторных клеток в мозге взрослых животных (Lim D.A., Tramontin A.D.,Trevejo J.M. et al., 2000). Локальные инъекции bFGF, EGF стимулировали не только пролиферацию реципиентных, но и донорских НСК, трансплантированных в фетальный и постнатальный мозг млекопитающих (Abe K., Saito H., 2001; Fricker-Gates R.A., Winkler C., Kirik D. et al.,2000) Один из главных эффектов Noggin связан с нейтрализацией ВМР-4. В мозге взрослых животных локальные концентрации эндогенных стимуляторов пролиферации, по-видимому, уравновешивались высокой концентрацией ВМР-4 и ВМР-7. Эти условия тормозили обновление нервных клеток в перивентрикулярной области мозга взрослых. Практически в каждом послеоперационном образце субвентрикулярной ткани взрослых людей выявляли мелкие и крупные нейросферы, окруженные плотным матриксом и слоем астроглии, которая окрашивалась антителами на GFAP. Авторы предположили, что глия вокруг нейросфер играет роль фидера, формирующего стволовую нишу (Kukekov V.G., Laywell E.D., Suslov O. et al, 1999).
 Вторым источником стволовых клеток является эпендима хориоидных плексусов. Ранее предполагали, что региональные сосудистые сплетения выполняет лишь трофическую функцию, секретируя в ликвор все необходимык ростовые и поддерживающие факторы. Питание стволовых перивентрикулярных пространств осуществляется через ликвор со стороны эпендимы (Leventhal C., Rafii S., Rafii D., et al, 1999). Сосудистые сплетения эмбрионального мозга имеют множественные зоны пролиферирующего эпителия, напоминающие по фенотипу стволовые клетки ( Коржевский Д.Е., 1999). У зародышей хориоидное сплетение играет роль поставщика нейральных стволовых клеток. Если нейроэпителий сплетения возникает из нервной трубки, то сосудистая мезенхима играет роль фидера, сохраняющего плюрипотентность НСК ( Kitada M., Chakrabortty S., Matsumoto N. et al.,2001). Эпендимальные клетки сосудистых сплетений были изолированы в культуру от так называемой "зеленой" трансгенной мыши, в которой ген флуоресцентного белка был поставлен под актиновый промотор. Практически это означало, что в культуре или после трансплантации клетки эпендимы светились флуоресцентной меткой. Исходные клетки эпендимы не прокрашивались антителами к виментину, нестину, GFAP, GLT-1, beta-tubulin III, MBP. После пересадки этих клеток в зону повреждения спинного мозга появлялись GFAP+, vimentin+ клетки, которые через 2-3 недели дифференцировались в типичные астроциты, но не нейроны. Часть НСК покидала сплетение и мигрировала в мозг ( Catala M., 1998). Однако выделить НСК в виде клонов in vitro из ткани хориоидных сплетений пока не удалось ( Gabrion J.B., Herbute S., Bouille C. et al., 1998)
 Третьим источником НСК является "реликты" нейроэпителия, сохраняющегося в спинном мозге. Такие ранние нейроэпителиальные клетки при плотности 100-300 клеток/мл росли суспензионными клонами (нейросферами) на бактериальных чашках ( клоногенность = 1-2,5%) ( Kalyani A., Hobson K., Rao M.S., 1997). Клетки дезагрегированных нейросфер прикреплялись к дну чашек , покрытых ламинином, и дифференцировались в нейроны, глию и олигодендроциты. Нейросферы пассировали в селективной среде с bFGF и EGF. В отличие от НСК мозга ранние нейроэпителиальные клетки спинного мозга культивировали и размножали в прикрепленном недифференцированном состоянии в минимальных плотностях в среде с bFGF + экстракт зародыша цыпленка. Часть прикрепленных клеток окрашивалась антителами к нестину, 1-5 % клеток окрашивались антителами к GFAP. Часть клеток принадлежала к стволовым/прогениторным клеткам нервного гребня. Из этих предшественников дифференцировались шванновские клетки и периферические нейроны при добавлении цАМФ, сыворотки в среде, содержащей EGF,bFGF, NGF ( Kalyani A., Hobson K., Rao M.S., 1997). Пока не ясно, как обнаруженные особенности профиля НСК в спинном мозге связаны с особенностями эмбриогенеза. Нервная трубка спинного мозга детерминирована генерировать только сенсорные и моторные нейроны. На примере прогениторных клеток спинного мозга разработана иерархическая схема дерепрессии генов эмбриогенезов по сегментам спинного мозга. В исходных незрелых прогениторных клетках функционируют 5 комплексов репрессии генома. Последовательная дерепрессия открывает лишь один из 5 возможных способов активации хроматина. К примеру, SHH- зависимая активация гена Рах-6 открывает путь к дерепрессии только одного из 5 репрессоров второго эщелона -Nkx2.2/2.9. Первичная дерепрессия гена Irx вызывает селективную вторичную дерепрессию лишь Olig2. Селективная дерепрессия Dlbx2 вызывает комплементарную дерепрессию NKX6.1, а Dlbx1 активирует Nkx6.2. Такая сегментарно собранная сеть транскрипционных факторов позволяет в полуавтоматическом режиме обеспечивать сборку нервных сетей, собранных из мото - и сенсорных нейронов разного фенотипа. Исходно вся сеть собрана из общих ранних предшественников ( Lee S.K., Pfaff S.L.,2001).
 
 
 3. Стволовое пространство обонятельного нейроэпителия
 
  Эпендима как орган регенерации мозга привлекла к себе внимание после исследований эмбриогенеза и регенерации спинного мозга рыб. У многих видов рыб выявлена высокая скорость обновляемости нервных клеток даже в зрелом периоде. В эпендиме постоянно образовывались новые клоны НСК, из которых клетки мигрировали в зоны повреждения головного и спинного мозга. Мозг певчих птиц оказался второй удачной моделью для изучения обновления стволовых пространств эпендимы. Мозг канареек, снегирей выделялся высокой скоростью обновления клеток ( около 1.5% клеток подвергались смене каждые 24 часа у взрослых особей). Как правило, миграторные незрелые клетки теряли N- кадхерин. Исследования были облегчены открытием в прогениторных нейронах птиц РНК-связывающего белка Hu, который исчезал в зрелых постмитотических нейронах С помощью антител к Hu- белку было показано, что первое поколение дочерних стволовых клеток оставались в субэпендиме до 4-5 дней перед началом миграции. Этим регенерация взрослой мозговой ткани отличалась от нейрогенеза эмбрионов, у которых дочерние стволовые клетки немедленно покидали субэпендиму. Возможно, что лаг-фаза необходима для потери N-кадхерина. Антитела к нейрональному NCAM блокировали адгезию прогениторных клеток. Однако большинство новообразованных клеток располагались между субэпендимой желудочков и центром пения (дорзомедиальный неостриатум). НСК после деления оставались в субэпендиме, тогда как дочерние клетки экспрессировали рецепторы навигации и устремлялись в паренхиму высших отделов головного мозга. Прогенторные клетки мигрировали по специальным каналам, которые были выстланы слоем вытянутых глиальных клеток. Последние инкрустировали каналы миграции специальными белками, которые направляли миграцию незрелых клеток.
 Обонятельный эпителий имел как правило трехслойную архитектуру. Апикальный слой состоял из зрелых специализированных нейроэпителиальных клеток. Каждый зрелый нейрон имел лишь один тип обонятельного рецептора (ОР), экспрессированного на внешней поверхности плазматической мембраны сильно поляризованных клеток. Зрелый эпителий насчитывал до 1000 типов клеток, несущих разный рецептор. Зрелые нейроны определяли не только по положению , но маркерным рецепторам, включая белок ОМР. Созревающие нейроны промежуточного фенотипа располагались ниже несколькими слоями. Еще ниже располагались пролиферирующие прогениторные слои клеток.

<< Пред.           стр. 2 (из 4)           След. >>

Список литературы по разделу