После инкубации в МС иллюминация в течении 4 и 10 минут вызывала серьёзные повреждения в ИКК и малом количестве ГКМ разбросанных по краю подмышечного слоя. После 4 минутной иллюминации самыми выдающимися изменениями в ИКК были увеличение митохондрий и увеличение вакуолизации цитоплазмы (n=3). После 10 минут иллюминации (n=3, фотографии 6в) ИКК были увеличенными имели низкую контрастность цитоплазмы, отлично различимые митохондрии, несколько кавеол и отверстия в плзматических мембранах, что вероятно говорило о её разрыве. Идентификация ИКК была возможной благодаря сохранению базальной пластинки и совместно с чертами цитоплазмы (такими как число митохондрий) и сохранению взаимосвязей с глубоколежащими клетками.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Избирательное повреждение толстокишечных ИКК метиленовым синим и светом.

Авторы установили строгую очевидность того, что подмышечные ИКК незаменимы в генерации потенциалов действия медленных волн в ЦМ толстого кишечника собак непосредственно показав связь между избирательным повреждением ИКК и исчезновением медленных волн при этом. В свежих исследованиях авторы показали, что ИКК в подмышечном сплетении избирательно аккумулируют МС и что МС не вызывает каких-либо микроскопически заметных изменений в любых типах клеток, кроме он не имеет значительного эффекта на активность медленных волн. В настоящем исследовании авторы показали, что интенсивная иллюминация после инкубации в МС приводит к специфическому повреждению ИКК подтверждаемому элетронной микроскопией. Более того, когда ЦМ препараты, у которых были удалены подмышечные ИКК-ГМ сети, были инкубированы в МС с последующей иллюминацией , спонтанная и индуцируема электрическая активность не затрагивалась. Эти наблюдения указывают на то,что эффекты МС и света на ИКК-ЦМ препараты были специфичны только для ИКК, не связанных с ГМК.

Хотя устранение активности медленных волн МС и светом сопровождалось деполяризацией, последняя не была ответственна за ингибирование активности медленных волн, с того момента, как реполяризация клеток к их прежнему потенциалу покоя не восстанавливала медленные волны. Кроме того, было замечено, что медленные волныустраняются в большом диапозоне величин мембранных потенциалов, включая мембранный потенциал покоя, свойственный циркулярным мышцам, что указывает на , что изменения активности медленных волн не вызваны изменениями величин мембранных потенциалов. В противоположность этому, строфантин также деполяризует мембраны и при этом устраняет активность медленных волн (1). Тем не менее, реполяризация мембран к изначальному потенциалу покоя полностью восстанавливает активность медленных волн. Это указывает на то, что в присутствии строфантина, ингибирование активностимедленных волн - непосредственный эффект деполяризации.

Локализация аккумуляции МС внутри ИКК очень специфична. Когда преципитация МС была проведена так, что удалось избежать перемещения и образования грубых преципитатов было обнаружено, что электронно-плотные депозиты присутствуют только в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и его нет в других цитоплазматичексих компонентах (35). Это может указывать на то, что МС входит в ЭР непосредственно путём проникновения через пгладкие цистерны. Тем не менее, остаётся неясным почему МС накапливается в ЭР ИКК, но при тех же обстоятельствах не входит в ЭР ГМК. В опытных условиях настоящего исследования, изменения в конформации митохондрий так же как активности медленных волн были обнаружены при минимальной инкубации МС в течении 7 минут и минимальной иллюминации в течении 2 минут, что наводит на мысль о том, что первичной причиной устранения медленных волн является повреждение митохондрий.

Фотодинамическое цитотоксическое действие МС было известно многие годы (2). Недавно изучалась цитотоксическая эффективность фотоинактивации МС-чувствительных клеток рака желчного пузыря (10), включая и сопровождающие её ультраструктурные изменения (39). После короткого периода иллюминации (5 минут), докладывалось, что ультраструктурные изменения были идентичны данным авторов (дизинтеграция митохондрий и ранние признаки повреждения плазматических мембран) , а высокая продолжительность иллюминации вела к разрыву мембран клеточной фрагментации. В исследования фотодинамического действия МС на ДНК (23) было показано, что обратимые предповреждения ДНК, вызванные МС в темноте становятся необратимыми когда к инкубации в МС присоединяется иллюминация. Вот и в этом исследовании электрофизиологические эжффекты и ультраструктурные эффекты МС и света также были необратимыми.

Роль ИКК в генерации медленных волн.

Настоящее исследование подкрепляет гипотезу о том, что ИКК незаменимы для генерации активности водителя ритма в кишечнике. В подобных исследованиях, использующих тонкий кишечние мышей иллюминация светом красного лазера устраняла внутриклеточно записанную активность медленных волн после инкубации в МС (36). Было показано, что активность медленных волн поражается в препаратах где ИКК окрашивались МС и не поражается, где ИКК не окрашивается. В другом исследовании (37), спонтанная сократительная активность медленных волн была сохранена, когда в культурируемых кусочках мускулатуры тонкого кишечника мышей окрашенные МС ИКК были просмотрены под микроскопом в очень тусклом свете, но эти кусочки быстро становились неподвижными при сильном освещении.

Настоящее исследованиеспецифически устанавливает решающую роль ИКК в генерации медленных волн в толстом кишечнике собак как показывалось прежде (12,18,19,21,29). Авторы выдвигают гипотезу о том, что циклическая внутриклеточная активность периодически активирует токи водителя ритма. В этом случае ИКК могут являться или биохимическими часами или одновременно биохимическими часами и ионными каналами, отвечающими за генерацию тока водителя ритма. Хотя спонтанные осциляции, записанные в изолированных ГМК (25) и клетках близких по описанию к ИКК (17,26), и устранялись блокаторами кальциевых каналов L-типа и следовательно не отражают медленные волны, как компонент водителя ритма, которые в принципе этими блокаторами не устраняются (14). Таким образом, спонтанно происходящие осциляции не имеют характеристик медленных волн.

Следующий вопрос касается роли ГМК в генерации медленных волн, как компонента водителя ритма. Ветвистые ГМК, которые интимно соединяютс с ИКК соединительными щелями представляют особый интерес. Если ИКК единственные клетки ответственные за генерацию токо водителя ритма, то величина тока, которую каждая ИКК должна генерировать, чтобы деполяризировать все соседствующие с ней клетки с высоким сопротивлением поверхности, должна быть огромной. Возможно и другое: ИКК – это биохимические часы и ИКК посылают внутриклеточные метаболиты через соединительные щели в интимно соединённые с ними ГМК. Благодаря такой метаболической связи (8) ассоциированные ГМК могут находиться в синхронии с ИКК, когда каналы водителя ритма и в ИКК и в ассоциированных с ними ГМК – активированы. Обоснование этой части гипотезы требует идентификации каналов водителя ритма и доказательства существования таких каналов в ИКК и ГМК. Интересен тот факт, что в присутствии тетраэтил аммония, BaCl2 и карбохола, изолированный слой ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК генерирует потенциалы действия, которые идентичны по частоте с медленными волнами, но устраняются блокаторами кальциевых каналов L-типа (D-600) (18). Это и последующее исследование (20) показали, что ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК может генерировать потенциалы с характеристиками подобными активности медленных волн.

Активность медленных волн также исчезает после обработки тканей Родалином 123 в полнослойных препаратах мышц (38). Родалин 123 – специфический маркёр митохондрий, и таким образом он не специфичен для ИКК, хотя ИКК особенно богаты митохондриями. После проникновения в митохондрии, Родалин 123 становится цитотоксичным благодаря разрушению АТФ (24). Следовательно, эффект Родолина 123 наводит на мысль о том, что активность медленных волн находится в строгой зависимости от внутриклеточного метаболизма. Это согласуется с наблюдениями о том, что активность медленных волн чувствительна к высоким температурам (1), блокируется ингибиторами метаболизма, такими как динитрофенол и карбонил цианид (H. Preiksaitis и J.D. Huizing, неопубликованные данные) и поражается при изменении конформации митохондрий (настоящее исследование). Это поддерживает гипотезу авторов о том, что компонент медленных волн водителя ритма образуется благодаря внутриклеточному метаболизму. )