Из работ, посвященных хромосомному анализу, известно, что при использовании однолазерной проточной системы может быть идентифицировано около 15 хромосом человека, исключая Y-хромосому. Применение двухлазерной системы (FACS-11) позволяет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хромосом в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать маленькие аутосомы человека (M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman, S.A. Latt, 1985). В этом случае помимо флюорохромов Но 33258 и хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводится третий краситель: нетропсин или дистамицин А. Это способствует получению дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению структурных особенностей нормальных и атипических хромосом. В результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и идентификацией аномальных.

Проточный бивариантный анализ, используемый для кариотипа хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и экспериментального материала, включая опухоль прямой кишки, культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови и фибробластов человека (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).

4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла.

При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду, что позволяет очень быстро получить достоверные результаты. Однако таким способом можно анализировать только очень разбавленные клеточные суспензии. Солидные ткани необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождается нарушением морфологии. Клетки монослоя обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА.

Дезагрегация свежих солидных опухолей

Методы дезагрегации клеток можно подразделить на три группы:

– методы, основанные исключительно на механической обработке;

– ферментативные методы;

– методы выделения ядер

Самые простые и быстрые методы дезагрегации включают только механическую обработку тканей. Эти методы особенно хороши для рыхлых тканей (например, лимфатических узлов) и позволяет получать густые суспензии клеток за несколько минут. Для получения неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты солидных опухолей, взятые с помощью шприца.

Ферментативный метод позволяет получить достаточно концентрированную клеточную суспензию из разнообразных опухолей, но при больших затратах времени.

Для выделения ядер (обычно из тканей, частично дезагрегированных механическим путем) разработаны различные методы, основанные на использовании ферментов, детергентов или тех и других. Детальная процедура дезагрегации тканей, окрашивания препаратов, получения результатов и их анализа для суспензии ядер разработана Винделовом и др. (L.L.Vindelov, I.J.Christensen, 1990).

Цель дезагрегации состоит в получении с высоким выходом суспензии интактных изолированных клеток или ядер, достаточно хорошо соответствующей исходному образцу ткани. Выбор способа дезагрегации зависит от типа ткани, размеров препарата, целей исследования, а иногда от быстроты и стоимости метода.

Суспендирование архивных препаратов, залитых в парафин

Методика исследования ДНК с помощью проточной цитометрии суспензии ядер, полученной из заключенных в парафин архивных препаратов, была впервые описана в 1983 г. (D.W.Hedley, M.L.Friedlander, I.W.Taylor, 1983). Эту методику можно использовать в модифицированном виде для анализа самых разнообразных опухолей. Это дает целый ряд преимуществ:

– можно проводить обширные ретроспективные клинические исследования;

– значительно упрощается изучение редко встречающихся патологий;

– парафиновые срезы легко транспортировать, что позволяет проводить цитометрические исследования в специальных центрах.

Недостатки метода состоят в том, что:

– качество получаемых результатов, как правило, не очень высокое;

– нельзя использовать внутренний ДНК-стандарт.

Качество результатов можно повысить, если немного усовершенствовать фиксацию тканей (C.E.Gillett, R.S.Camplejohn, S.M.O´Reily, 1990). Хороший эффект дает фиксация в формалине при нейтральном рН при 4ºС в течение ночи. Следует избегать нагревания ткани (если только оно не является абсолютно необходимым при ее обработке) или неоправданно длительной фиксации.

Окрашивание ДНК

При окрашивании клеточной ДНК с целью последующего определения ее содержания с помощью проточной цитометрии следует учитывать:

– специфичность красителя по отношению к ДНК;

– его спектральные характеристики: интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимися в продаже приборами;

– стоимость и удобство в работе (растворимость, стабильность и т.д.)

Этим требованиям отвечает целый ряд флуорохромов. Детальное их описание дано в работах Waggoner A.S. (1990), Crissman H.A., Steincamp J.A. (1990), Laff S.A., Langolis R.J. (1990). В проточной цитометрии для окрашивания ДНК чаще других флуорохромов используется иодистый пропидий (ИП) даже несмотря на то, что он не строго специфичен по отношению к ДНК. С помощью ИП можно окрашивать также двухцепочечную РНК. Спектральные характеристики ИП очень удобны для проточной цитометрии: для возбуждения флуоресценции используется обычный аргоновый лазер с рабочей длиной волны 488 нм, а максимум флуоресценции находится вблизи 620 нм, что позволяет параллельно использовать флуоресцеин при проведении многопараметрических измерений.

Независимо от красителя последний должен находиться с ДНК в стехиометрических соотношениях, т.е. количество связанного с ДНК красителя должно быть пропорционально содержанию ДНК в клетке. Чтобы красителем были заняты все доступные для связывания места, его следует брать в некотором избытке.

Большинство флуоресцирующих красителей, связывающихся с ДНК, в том числе и ИП, не могут проходить через мембраны интактных клеток. Чтобы повысить проницаемость мембран, клетки либо фиксируют спиртом, либо обрабатывают детергентами.

Использование другой ДНК в качестве стандарта.

Содержание ДНК, которой отвечает один из пиков на ДНК-гистограмме для исследуемого препарата, можно оценить, сравнив этот пик с пиком для другой ДНК, содержание которой известно. Так, сравнение левого пика на рис.1 с пиком, отвечающим ДНК диплоидных лимфоцитов периферической крови человека, говорит о том, что мы имеем дело с диплоидными клетками. В докладе Комитета по номенклатуре в аналитической цитометрии рекомендуется использовать лимфоциты в качестве независимого стандарта ДНК. Известны и другие случаи, когда стандартом служат ядерные эритроциты не млекопитающих, а других животных.

Если используются ядра, выделенные из заключенных в парафин препаратов, то независимые ДНК-стандарты применять нельзя. Это связано с неодинаковым окрашиванием ДНК в ядрах, выделенных из разных парафиновых блоков, вследствие различий в процедурах фиксации и обработки тканей. Если на ДНК-гистограммах препаратов, заключенных в парафин, наблюдается два G1-пика, то левый из них условно считается соответствующим диплоидным клеткам (рис.1, Б). Это не мешает выявлению анеуплоидных клеток, поскольку все образцы содержат внутренний контроль – диплоидные клетки (лимфоциты, эндотелиальные клетки и т. д.). Но в результате некоторые образцы ошибочно классифицируются как «гиперплоидные», хотя на самом деле являются «гипоплоидными». Клиническая значимость такой неправильной классификации неизвестна, но в любом случае ее вероятность невелика.

5.Применение цитометрии в молекулярной клинической диагностике.

На первых порах основным стимулом к развитию проточной цитометрии послужило желание автоматизировать цитологические методы, использующиеся для диагноза заболеваний, но большинство опубликованных к настоящему времени работ посвящено применению этого метода для прогностических целей. Интенсивное развитие автоматизированных диагностических систем сканирующего и проточного типов способствовало быстрейшему внедрению цитометрического метода исследования в клиническую практику. В процессе развития и освоения метода происходит его специализация по трем ведущим направлениям. Первое – это массовые профилактические осмотры населения с целью выявления ранних стадий заболевания, второе – дифференциальная диагностика пограничных состояний и злокачественного роста, третье – контроль динамики опухолевого заболевания в ходе проведения лекарственной, лучевой и комбинированной терапии, а также хирургического метода лечения. Особенно плодотворно ведутся цитометрические исследования в области гематологии, гинекологии, урологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, метод также используется для диагностики патологических процессов молочной и щитовидной желез. )