Из истории количественной цитометрии известно, что одним из первых объектов изучения были форменные элементы крови и эпителиальные клетки слизистой оболочки шейки матки. Данное обстоятельство связано с доступностью получения диагностического материала, разнообразием клеточных элементов, характеризующих нормальное физиологическое состояние исследуемых объектов, а также с трудностью морфологической идентификации их при различных патологических процессах, особенно онкологических заболеваниях.

Гинекология

Достаточно большой опыт применения количественной цитометрии в области гинекологии позволяет выделить несколько этапов в развитии количественного метода оценки морфологических особенностей эпителиальных клеток шейки матки. Первый этап характеризуется исследованиями, в которых рассматривается возможность осуществления цитоскрининга, т.е. разграничение патологических процессов на две группы «норма – рак». Второй этап связан с дифференциацией пограничных состояний шейки матки по анализу одного, двух критериев диагностики с последующим применением корреляционного анализа, построением двух- и трехпараметрических диаграмм зависимостей изучаемых признаков. Третий этап исследований направлен на углубленную идентификацию клеток с изучением их структурных особенностей (интегральная оптическая плотность, содержание ДНК), отражающих определенные состояния шейки матки при диспластических, метапластических процессах, внутриэпителиальном и инвазивных формах рака. Полученные результаты могут послужить основой изучения механизмов перестройки эпителиального пласта в процессе его озлокачествления и определения природы злокачественной трансформации клетки. Характеризуя данное направление, можно подчеркнуть значимость цитометрических исследований и в области осуществления контроля качества цитологической и гистологической диагностики заболеваний шейки матки, а также оценки степени репарации ткани в процессе лечения. Исходя из фундаментальных исследований, посвященных оценке более чем 196 качественных и количественных признаков ядра и клетки и общего фона препарата, определяют, что более значимы параметры, характеризующие морфологические особенности ядра (Б.М.Брамберга, И.Я.Зитаре, Д.П.Плегере, Э.Х.Смилтниекс,1970). Поэтому при количественном анализе препаратов обычно исходят из информативности размерных и структурных характеристик ядра: изучают его площадь, периметр, объем, диаметр, определяют коэффициент формы и оптическую плотность, содержание ДНК, РНК и белка в нем. На основании данных проточной цитометрии установлено, что среди обследуемых пациентов с различной патологией шейки матки в 74,5% случаев имеются кондиломатозные изменения. Установлен профиль типичной ДНК-гистограммы для данной патологии шейки матки с высоким содержанием ДНК в G0/G1-фазе и ранней S-фазе клеточного цикла. Полагают, что наблюдаемые изменения в ДНК-гистограмме можно рассматривать как проявление папилломо-вирусной инфекции в этиологии кондиломы шейки матки (K.C.Tsou, D.H.Hong, M.Varello et al, 1984).

Кроветворная система

При цитометрическом анализе клеточных элементов крови используют критерии, которые включают довольно широкий спектр параметров. Это в первую очередь цитометрические маркеры с использованием специфических красителей на РНК, ДНК, различных ферментативных систем (эстеразу, фосфатазу). Используются также размерные критерии, которые включают объем, площадь, периметр и диаметр ядра и цитоплазмы клеток, а также ядерно-цитоплазматическое отношение.

При исследовании диагностического материала при острых и хронических формах лейкозов методами цитометрии обнаружены некоторые различия для клеточных элементов той или иной группы гемобластозов. Используя морфометрические методы оценки размерных признаков ядра и цитоплазмы бластных клеток, обнаружена строгая корреляция величины клеток и FAB (франко-американо-британской)- классификации лейкозов. При сопоставлении количественных данных, полученных при исследовании клеточных элементов при острых лимфобластном и миелобластном лейкозах, классифицируемых по морфологическим признакам на подгруппы М1 – М6 согласно FAB-классификации, определены различия между двумя вариантами лейкозов, кроме подгруппы М2. Регистрируемые различия в размере бластных клеток связаны с фазами клеточного цикла. Установлено, что клетки при остром миелобластном лейкозе в S-фазе цикла характеризуются большим размером ядра. Для этой же форме лейкоза, но подгруппы М1 характерна более малая доля клеток в S-фазе клеточного цикла (M.Efrench, P.A.Bryon, D.Fiere et al, 1981).

Молочная железа

С целью повышения диагностических возможностей цитологического метода при добро- и злокачественных опухолях молочной железы, определения их гистологических вариантов, разработки прогностических критериев заболевания – также используются данные морфометрии и цитоспектрофотометрии. При объективизации цитологических препаратов исходя из информативности следующих признаков: диаметр, периметр и площадь ядра и цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое отношение, текстура хроматина, содержание ДНК и РНК. На основании цитометрических исследований установлены некоторые закономерности, характерные для злокачественных форм опухолей молочной железы. Это вариабельность ядерно-цитоплазматического отношения, нарастание размера ядра и содержания ДНК. Между двумя последними показателями обнаружена корреляционная зависимость, характеризующаяся следующими особенностями. Показано, что клетки с некоторой атипией, которая выражается в увеличении площади ядра, распределяются различно по фазам клеточного цикла. Около 21% клеток, находящихся в области 4с ДНК-гистограммы, имеют площадь ядер свыше 125 мкм2. При площади ядер от 50 до 100 мкм2 основная масса клеток находится в G1-фазе цикла и только около 5% клеток приходятся на гипердиплоидную область распределения ДНК (C.J.Cornelisse, A.J.Van Driel-Kulker, F.Meyer, J.S.Ploem, 1985). Показатель ДНК (количество ДНК в 1 клетке опухоли на количество ДНК в нормальной клетке) в различных типах злокачественных опухолей молочной железы значительно варьирует, однако чаще наблюдается тетраплоидия (60 – 80%), доброкачественные опухоли, как правило, диплоидные. Сравнительная оценка содержания ДНК в клетках молочной железы при доброкачественных и раковых процессах показала определенную зависимость между соотношением клеток по фазам цикла. Установлено, что с прогрессированием процесса количество диплоидных клеток в G1-фазе цикла убывает и при III – IV стадии ракового процесса составляет 64%. Количество тетраплоидных клеток нарастает в 2 раза и составляет около 17% общего количества клеток по сравнению с пролиферативной формой мастопатии и в 3 раза по отношению к непролиферативной форме мастопатии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, как проточная, так и статическая цитометрия позволяет исследовать многие важные параметры клеточного цикла. Наиболее распространенной задачей, решаемой с помощью данного класса приборов, является идентификация и подсчет клеток, находящихся в различных периодах клеточного цикла. В последнее время параллельно с этими параметрами с помощью цитометров исследуют также динамику экспрессии многих важных клеточных маркеров, что может иметь диагностическое и прогностическое значение. Важно отметить, что принципиальных различий между двумя типами цитометрии, по-видимому, не существует. Поэтому с помощью достаточно простых и недорогих приборов можно воспроизводить весьма эффективные методики исследования клеточного цикла, первоначально разработанные для дорогостоящих проточных цитометров. Такие системы статической цитометрии включают в себя люминесцентный микроскоп, черно-белую или цветную телевизионную камеру высокой чувствительности, устройство для оцифровки телесигнала и компьютер. В последнее время в подобных системах все более широко применяются цифровые телекамеры, которые подключаются к компьютеру через высокопроизводительные порты нового поколения (универсальный последовательный порт). Это позволяет создавать недорогие и достаточно мощные системы для статической цитометрии, которые могут успешно конкурировать как с проточными цитометрами, так с конфокальными микроскопами. В целом можно сделать вывод о перспективности данного направления в цитологии, дающего возможность широкого применения методов количественной микроскопии в научных исследованиях и клинической практике. )