ысокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге. Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но и после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализов этот осадок надо несколько раз обработать различными реактивами и повторить ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить концентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для наблюдений в электронно-оптических приборах. В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как, например, центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше время стандартное оборудование почти каждой научно-исследовательской вирусологической лаборатории — электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат. Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом ультратонких срезов Фиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается тончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов одну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость. Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания) , внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронного микроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются с раствором фосфовольфрамовой кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе позитивного окрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности вирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо различимые в электронном микроскопе) . Общие методы изучения вирусов О присутствии вируса в организме как при спонтанном заболевании, так и при экспериментальном заражении хозяина судят по появлению тех или иных патологических симптомов. Всякий раз, когда возникает подозрение о присутствии вируса в изучаемом объекте, приходится подбирать определенный комплекс условий — подходящий организм и соответствующий способ заражения, — при котором вирус вызывает в зараженном организме распознаваемые изменения. Так что вирусологам приходится затрачивать большие усилия на разработку методов получения экспериментальных инфекций. Как известно, для доказательства того, что данное заболевание действительно вызывается определенным микроорганизмом, необходимо выполнить так называемые постулаты Коха: 1) показать, что данный микроорганизм регулярно обнаруживается в больном организме; 2) получить культуру этого микроорганизма на искусственной питательной среде; 3) воспроизвести данное заболевание заражением экспериментального животного выделенной культурой и, наконец, ;4) повторно выделить данный микроорганизм, но теперь уже из организма искусственно зараженного хозяина. Те же постулаты mutatis mutandis справедливы и для диагностики вирусных заболеваний. В этом случае, согласно Риверсу, постулаты формируются следующим образом: 1) выделение вируса из организма больного, 2) культивирование вируса в организме или в клетках экспериментального животного, 3) доказательство фильтруемости инфекционного агента (чтобы исключить патогенные агенты большего размера, например бактерии) , 4) воспроизведение подобного заболевания у другого представителя данного или родственного вида и, наконец, 5) повторное выделение того же вируса. Культивирование и идентификация вирусов — основные вирусологические методы, используемые в практической вирусологии при диагностике вирусных заболеваний. Материал, в котором подозревается наличие вируса, например лизат бактерий, кусочек ткани или биологическая жидкость, при необходимости измельчают или гомогенезируют с тем, чтобы при контролируемых условиях перевести его в суспензированное состояние. Большие фрагменты клеток, а также возможные загрязняющие материал микроорганизмы удаляют при помощи центрифугирования и фильтрования. Такую очищенную суспензию вводят подходящему хозяину, либо добавляют к суспензии клеток, либо наносят на монослой соответствующих клеток. В результате в слое чувствительных клеток, таких, как бактерии, растущие в чашке с агаром, или клетки животных, растущие на поверхности стекла, могут появиться локальные поражения, так называемые бляшки, которые характерны для данного вируса Бляшки образуются в результате заражения расположенных в данной области клеток, размножения в них вируса и их полного или частичного лизиса. Если размножение вируса не ведет к образованию визуально выявляемых дискретных бляшек, вирус может быть обнаружен и охарактеризован по изменениям, вызываемым им в культуре клеток, или по повреждению слоя клеток либо при помощи других тестов. Если исследуемый материал не наносят на слой культивируемых клеток, а вводят в организм хозяина, то цель эксперимента — выявление общих реакций организма, свидетельствующих о развитии инфекции: появление симптомов заболевания, гибель животного или какие-либо иные специфические реакции, например образование антител. Наконец, если ни заражение культуры клеток, ни введение материала в организм хозяина не ведут к появлению каких-либо симптомов вирусной инфекции, вирусологи прибегают к так называемым «слепым пассажам» , т.е. к повторным переносам исследуемого материала, что часто приводит к повышению вирулентности вируса или к увеличению его титра. Общий химический состав вирусов Непременным компонентом вирусной частицы является какая-либо одна из двух нуклеиновых кислот, белок и зольные элементы. Эти три компонента являются общими для всех без исключения вирусов, тогда как остальные двалипоиды и углеводы — входят в состав далеко не всех вирусов. Вирусы, состоящие только из белка нуклеиновой кислоты и зольных элементов, чаще всего принадлежат к группе простых, так называемых минимальных, вирусов, лишенных дифференциации, собственных ферментов или каких-либо специализированных структур. К такого рода вирусам принадлежат вирусы растений, некоторые вирусы животных и насекомых. В то же время практически все бактериофаги, которые по химическому составу, безусловно принадлежат к группе минимальных вирусов, на самом деле являются очень сложными и высокодифференцированными структурами. Вирусы, в состав которых наряду с белком и нуклеиновой кислотой входят также липоиды и углеводы, как правило, принадлежат к группе сложно устроенных вирусов. Большая часть вирусов этой группы паразитирует на животных. Белки вирусов Аминокислотный состав вирусных белков Белок всех исследованных до настоящего времени вирусов построен из обычных аминокислот, принадлежащих к естественному L-ряду. D-аминокислот в составе вирусных частиц не найдено. Соотношение аминокислот в вирусных белках достаточно близко к таковому в белках животных, бактерий и растений. Вирусные белки не содержат обычно большого количества основных аминокислот (аргинина, муцина) , т.е. не принадлежат к группе белков типа гистонов и протаминов с ярко выраженными щелочными свойствами. Не учитывая нейтральных аминокислот, можно сказать, что в вирусном белке преобладают кислые дикарбоновые кислоты. Это справедливо как для вирусов с низким содержанием нуклеиновой кислоты, так и для вирусов с высоким содержанием РНК и ДНК. Вирусная ДНК Главной структурной особенност )