АТФ индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальцияя в нейронах неокортекса крыс

Страница 4

Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.

2.2.5 Реклассификация пуринорецепторов.

Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме классификации Ð2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе подтипов рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует пересмотра. В 1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему классификации Р2 - пуринорецепторов. Из всех Р2 - пуринорецепторов они вычленили три основных семейства: Р2Х семейство, связанное с ионотропными каналами, которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с активацией G - белков, включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство неселективных пор. Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2 - пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У - семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не остается сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo et al 1996).

Р2 - пуринорецепторы

P2Z - неселективные поры

Р2Х - семейство ионотропных рецепторов

Р2У - семейство метаботропных рецепторов

Р2Х1

Р2Х2

Р2Х3

Р2Х4

Р2Х5

Р2Х6

Р2У1

Р2У2

Р2У3

Р2У4

Р2У5

Р2У6

Р2У7

Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Подготовка препарата

Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После декапитации мозг помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура от начала декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд. Затем мозг закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома (Campden, Campden Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась холодным солевым раствором. Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм; скорость подачи лезвия - 1 см/с с частотой 10 Гц. После приготовления срезы помещались в раствор постоянно насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед загрузкой флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом растворе 30 минут при температуре 32 градуса. Окраска среза осуществлялась в течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном термостате при температуре 35 градусов. После окраски срезы отмывались 1 - 1,5 часа в постоянно оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все эксперименты проводились при температуре 32 градуса.

3.2 Характеристики кальциевого зонда

Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM (рисунок 2) (16).

На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда Фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca2+ и есть функция лишь концентрации зонда.

Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет легко рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):