Актинобациллезная (гемофилезная)

Страница 2

По материалам диссертации опубликована 41 научная работа,

методические указания и наставления; получены два авторских свидетельства на изобретения. Опубликована в соавторстве с

М.А.Сидоровым монография «Гемофилёзы животных» (М.,Колос,1986).

Объём и структура диссертации.Диссертация изложена на 552 страницах машинописного текста и состоит из выведения, двух глав обзора литературы, материалов и методов исследований, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложения. Диссертация содержит 82 таблицы, 30 рисунков. Список литературы содержит 472 источника, в том числе 61 отечественных и 411 иностранных авторов.

Собственные исследования.

1. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена во ВНИИЭВ им. Я. Р. Коваленко и МГУПБ в период 1974—1995г.г. Выполненные исследования являлись частью плановой научной тематики ВНИИЭВ и МГУПБ. Отдельные этапы исследований проведены совместно с Сидоровым М.А., Шубиным В.А., Гумбатовым Ю.К., Мицаевым Ш.Ш., Блему Ж., Силла Ф., Лаврентьевым Н.И., Романовой Л.Я., Субботиным В.В., Пруссак—Глотовым В.Э., Логиновым И.А., Корнелаевой Р.П.

Ряд комплексных исследований проведен совместно с сотрудниками лаборатории патологической анатомии ВНИИЭВ проф. Шубиным В.А., Татришвили И.К., Андрышиным А.Н., лаборатории молекулярной биологии и биохимии ВНИИЭВ Артюхиным С.К. и Фоминым Б.А.

В работе использовали 30 штаммов типовых культур бактерий семейства Pasteurellaceae: Actinobacillus ( Haemophilus ) pleuropneumoniae

( серовары 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12, ) , Pasteurella – haemolytica – подобные бактерии, гемофильные бактерии «малой группы», таксона «С», H.influenzae, H.parainfluenzae, H.parasuis ( серовары А,В,С,Д ), P.multocida ( серовары А.В.Д ). Также использовали культуры S.aureus (шт.№СТС 8530, 209 р.), S.epidermidis (шт.АТСС14990),S.saprophyticus (шт.2284 ИГ),

В.megatherium (шт. №654), B.subtilis, S.cholerasuis (шт.№370), S.typhimurium (шт.№415).

Подробному изучению включая нумерический анализ, подвергнут 141 штамм НАД--зависимых эпизоотических культур бактерий, выделенных нами от свиней, и 160 штаммов подвергнуты серологической идентификации. Бактериологически или патологоанатомически исследованы материалы от более 2200 свиней.

При изучении вопросов пато- и иммуногенеза использовали 157 свиней, 210 морских свинок, 546 белых мышей.

Для культивирования НАД--зависимых бактерий применяли «шоколадный» агар, бульон и агар Левинталя, сывороточно-

-дрожжевой агар и бульон, кровяной агар и бульон на основе МПБ, МПА, бульона и агара Хоттингера. В качестве источников специфических ростовых факторов использовали кристаллический гемин («Реахим»), НАД («Реахим»), дрожжевой экстракт, кровь различных видов животных, питающие культуры бактерий («баккормилки»). Культивирование бактерий в жидких питательных средах осуществляли в стационарных условиях и в режиме аэрирования (лабораторный ферментер). Морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства бактерий

исследовали общепринятыми методами. В дифференциально—диагностические среды при определении ферментативной активности добавляли НАД и гемин, а также использовали СИБ и ПВДЭ—диагностические наборы производства Горьковского ИЭМ. Особенности колоний изучали в косопадающем пучке света при помощи стереоскопического микроскопа МБС—1, (Акатова Н.С.,1966).

При проведении нумерического анализа у каждого исследованного штамма бактерий определяли 57 физиологических признаков, показатели преобразовывали в числовую форму, затем при помощи ЭВМ вычисляли коэффициент несоответствия по формуле

где:

a - количество несовпадающих признаков,

b - количество совпадающих положительных признаков,

c - количество совпадающих отрицательных признаков.

Полученную матрицу коэффициентов подвергали кластерному анализу с представлением конечных данных в виде дендрограммы, отображающей распределение штаммов по кластерам ( фенонам ).

Для генетической характеристики ( исследования проведены совместно с Артюхиным С.К. и Фоминым В.А. ) эпизоотических и референтных штаммов ДНК выделяли по методу Marmur (1961 ). Нуклеотидный состав определяли спектрофотометрически по тепловой денатурации с помощью спектрофотометра «Спекорд М-40».

Меченые препараты ДНК получали с помощью реакции НИК - трансляции ( Маниатис и соавт.,1985 ). Реакцию ДНК – ДНК гибридизации проводили по методу Денхардта ( 1966 ). Степень подобия нуклеоидных последовательностей ДНК определяли, принимая за 100% радиоактивность гомологической реакции.

При изучении антигенной структуры бактерий использовали кроличьи гипериммунные сыворотки на цельные микробные клетки. Пробирочную и пластинчатую РА ставили по Mittal K. и соавт. ( 1984 ),

при постановке РА с 2 - меркаптоэтанолом ( 2МЭ ) серийные разведения сыворотки делали в растворе с 0,1М -2МЭ. Эритроцитарные антигенные диагностикумы для РНГА готовили по методу Сидорова М.А. и Агаевой Э.М. Ставили РНГА и учитывали результаты общепринятым способом. Антительные диагностикумы для реакции коагглютинации готовили по Mittal K. и соавт. ( 1987 ). Реакцию иммунофлуоресценции в двух ступенчатом варианте проводили с использованием коммерческих меченых ФИТЦ, антикроличьих сывороток и люминесцентного микроскопа МЛ - 2.

Реакцию ставили в классическом варианте, при исследовании свиных сывороток крови – по Nicolet J. (1971 ) с добавлением в комплемент сыворотки крови крупного рогатого скота.

При оценке вирулентности бактериальных культур определяли

по Риду и Менну. Остаточную токсичность инактивированных вакцин определяли, используя тест прироста живой массы мышей. При определении специфической активности экспериментальных вакцин рассчитывали , индекс и коэффициент эффективности препарата ( Безденежных И.С., Леонтьева Л.Г.,1969 ).

Цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики ( Ашмарин И.П., Воробьёв А.А., 1962; Терентьев П.В., Ростова Н.С.,1977 ).

2. Результаты исследований.

2.1. Свойства возбудителей, таксономическое положение и разработка лабораторной диагностики актинобациллёзной (гемофилёзной) плевропневмонии и гемофилёзного полисерозита свиней . 2.1.1. Питательные среды и культивирование A.pleuropneumoniae и H.parasuis.

Конструирование питательных сред для культивирования A.pleuropneumoniae и H.parasuis предполагает учёт потребности данных видов в НАД. Минимальный уровень зоны оптимума у обоих видов бактерий близок и составляет 1,8 - 3,6 НАД в 1 среды. Верхний пороговый уровень имеет видовые и штаммовые различия, причём он ниже у H.parasuis (15,62 – 31,25 мкг/), чем у A.pleuropneumoniae (250мкг/) и, в свою очередь, он меньше в пределах вида H.parasuis у свежевыделенных эпизоотических штаммов, нежели у адаптированных музейных культур. Полученные данные позволили обоснованно конструировать питательные среды свиноводства учётом возможных штаммовых потребностей в НАД. Из естественных источников НАД наиболее доступен и эффективен дрожжевой экстракт. Переживающие животные ткани также содержат достаточное для роста V - зависимых бактерий количество НАД. Наиболее удобно в этом случае использовать кровяной сгусток на агаре Цинссера или сывороточном агаре.

Испытание различных видов питающих культур бактерий как продуцентов НАД показало, сто ростовой фактор экскретируют в достаточных количествах интенсивно растущие виды бактерий (эшерихии, сапрофитные бациллы, стафилококки), которые обеспечивают зону от 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14мм в зависимости от вида бактерий и типа питательной среды.