Секвенирование (Генная инженерия)

Страница 5

Программы специального назначения создаются для решения более специальных и часто более сложных задач и представляют инте­рес для более узкого круга специалистов. Так, например, они могут выполнять ряд функций: вычисление длины фрагментов ДНК на осно­вании их электрофоретической подвижности в гелях; выбор гибридизационных зондов; предсказание вторичной структуры РНК; локали­зация нуклеотидов в гене, которые могут быть изменены (без измене­ния аминокислотной последовательности) с целью введения сайта уз­навания эндонуклеазы рестрикции; нахождение участков с потенци­ально возможной структурой Z-формы ДНК; выявление функциональ­но значимых участков в неизвестной вновь расшифрованной структуре на основании ранее выведенного консенсуса (в результате сравнитель­ного анализа ряда известных структур с одинаковой функцией); лока­лизацию участков, кодирующих белки, и т.д.

Для примера представлено меню пакета программ MICROGENIE, из которых следует, какие функции общего или специ­ального назначения может выбрать исследователь при работе с нуклеотидными последовательностями.

Программа общего назначения "COMMON" обеспечивает ввод последовательности в ЭВМ, а также проверку введенных данных в диалоговом режиме. Они позволяют также редактировать нуклеотидные последовательности: вводить замены и вставки, исключать нуклеотиды, вырезать, встраивать и объединять нуклеотидные последова­тельности и таким образом моделировать гибридные и мутантные мо­лекулы ДНК. Ввод последовательностей в память машины можно осу­ществлять вручную с клавиатуры, но в последнее время созданы при­боры для автоматического сканирования авторадиограмм и секвениру-ющих гелей, полученных при использовании флуоресцентных меток , передачи данных сразу в компьютер и последующего анализа последовательности с помощью специальных программ. В не­давно вышедшей в издательстве IRL (Оксфорд) книге "Анализ сиквенса нуклеотидных кислот и белков" подробно описываются как конструк­ция сканирующих устройств, так и программы для чтения авторадиог­рамм. Созданы программы для восстановления первичных структур высокомолекулярных ДНК на базе данных сиквенса фрагментов, полученных при ее Неспецифическом расщеплении (например, ультра­звуком,). Родство между любой парой фрагментов ДНК выявляется на основании совпадения последовательности нуклеотидов в их структурах, причем эти совпадающие последовательности и являются местом перекрывания и такие два фрагмента могут быть объединены в более протяженную структуру. Процесс отбора фрагментов и стыковки продолжается до. тех пор, пока не будет восстановлена вся первичная структура исследуемой ДНК. Одной из такого рода программ является "CONTIG" (существует ее вариант для компьютера IBM PC), созданная в лаборатории Ф.Сангера (Кембридж, Англия). Ниже приводятся основные операции, которые позволяет осуществ­лять программа "CONTIG":

1) хранение сиквенса каждого фрагмента;

2) отбор смежных фрагментов и сборка последовательностей из них;

3) сравнение данных, полученных при чтении новых авторади­ограмм, с уже установленными последовательностями;

4) объединение двух фрагментов с помощью третьего, представ­ляющего собой область перекрывания первых;

5) поиск участков ДНК, комплементарных уже установленным, что является проверкой правильности сборки полной структуры ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Метод Максама-Гилберта и метод Сэнгера основаны на одном принципе. В первом используется специфическое расщепление ДНК, обусловленное природой оснований, во втором - статистический синтез ДНК, заканчивающийся на каком-либо одном из 4 нуклеотидов. Таким образом, основой обоих методов является получение полного (статистического) набора фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырёх нуклеотидов.

Химический метод (метод Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исс­ледуемая ДНК не слишком велика (200-500 звеньев). В том случае, если речь идет о секвенировании высокомолекулярной ДНК, лучше применять метод полимеразного копирования (метод Сэнгера) , чтобы не вводить про­цедуру рестриктазного расщепления с выделением индивидуальных фрагментов. При энзиматическом секвенировании протяженных одно­цепочечных ДНК (например, бактериофагов) можно применять набор олигонуклеотидов-затравок, синтез которых в настоящее время не тре­бует больших затрат времени и труда. Для двутяжевых высокополимерных ДНК наиболее удобен метод слепого энзиматического секвенирования с применением универсальной затравки (их вы­пускают многие фирмы) и обработки данных с помощью ЭВМ. Хими­ческий метод также может быть применен, но в этом случае необходи­мо вырезать из вектора исследуемые фрагменты ДНК, и это усложняет всю процедуру.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Жарких А.А. Методы филогенетического анализа генов и белков //Молек.биология. (Итоги науки и техники. ВИНИТИ; М. 1985)

2. Компьютерный анализ генетических текстов / А.А.Александров, Н.Н.Александров, М.Ю.Бородовский И ДР. М.: Наука.

3. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Отв. ред. Р.И.Салганник.-Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990.

4. Молекулярная клиническая диагностика.Методы: Пер. С англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж.Макги. – М.: Мир, 1999.

5. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компанентов. – М.: Химия, 1978.

6. Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухин А.С. Химические основы генной инженерии: Учебное пособие . – М.: Изд-во МГУ, 1994.

7. Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислот / Подред. М.А.Прокофьева. – М.: Изд-во МГУ, 1985.