Содержание аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах здоровых детей и страдающих инсулинзависимым сахарным диабетом

Страница 4

Реактивы:

1. 2.10 М унитиол (0.84 мл 5% раствора ампулированного препарат в 100 мл 0.2 М фосфатного буфера рН 7.0. хранить не более суток).

2. 5% трихлоруксусная кислота (ТХУ). Хранить в холодильнике не более двух недель.

3. 85% раствор серной кислоты (100 мл воды + 900 мл концентрированной серной кислоты).

4. 2% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 9Н серной кислоте, содержащей 0.25% тиомочевины (хранить в холодильнике не более 1 месяца).

5. 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия (краска Тильманса). Хранить в темноте не более 1 недели.

6. 0.9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор).

Ход определения.

В три пробирки помещали по 0.5 мл упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов с известным гематокритом. В первую прибавляли 0.25 мл физиологического раствора и 0.25 мл унитиола. После пятнадцатиминутной инкубации при периодическом помешивании суспензии отбирали 0.5 мл экстракта, к которому прибавляли 1.5 мл ТХУ.

В две другие пробирки также прибавляли по 1.5 мл ТХУ.

В две пробирки вносили по 0.75 мл супернатанта, полученного при центрифугировании смеси упакованных эритроцитов с ТХУ. В одну из пробирок добавляли по каплям 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия до появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд. В третью пробирку помещали 0.75 мл супернатанта, полученного после центрифугирования смеси упакованных эритроцитов с физиологическим раствором, унитиолом и ТХУ. Во все пробирки добавляли по 0.25 мл 2,4- динитрофенилгидразина и доводили объём до 1.25 мл дистиллированной водой, инкубировали при 100 0 С в течение 10 минут и охлаждали в ледяной бане. В каждую пробирку добавляли небольшими порциями 1.25 мл 85% раствора серной кислоты, охлаждая в ледяной бане после каждой порции. Окрашенные растворы фотометрировали через час при длине волны 540 нм.

Концентрацию кислот определяли по формуле:

С = (3*А)/0.085; где

С – концентрация кислот, мг%

3 – концентрация стандартного раствора, мг%

А – оптическая плотность пробы

0.085 – оптическая плотность стандартного раствора

2.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты исследований обрабатывались статистически (Лакин И.А., 1976).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Целью исследования являлось определение содержания аскорбата и его окисленных форм – ДАК и ДКГК в общей эритроцитарной массе взрослых, страдающих ИЗСД, со стажем болезни более 10 лет; сравнение и сопоставление полученных результатов с данными, полученными ранее, в ходе работы со здоровыми детьми и страдающими ИЗСД. В эксперименте участвовал 21 взрослый в возрасте от 25 до 40 лет, 37 больных детей и группа контроля, включающая 10 здоровых детей. Результаты исследований отображены на диаграммах.

Рис.1. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и детей, страдающих ИЗСД (мг%)

Рис. 2. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых, страдающих ИЗСД (мг%)

Как следует из полученных результатов, в эритроцитах детей и взрослых, страдающих ИЗСД, наблюдается увеличение содержания окисленной форма АК-ДАК, что может свидетельствовать о нарушении процесса восстановления АК в ДАК, большем участии АК в метаболических процессах, нарушении транспорта АК в клетке.

Процентное содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК также демонстрирует превалирование окисленных форм АК над восстановленной.

Рис. 3. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах здоровых детей и страдающих ИЗСД (%). Рис. 4. Содержание общей АК, АК, ДАК и ДКГК в эритроцитах взрослых, страдающих ИЗСД (%).

Все полученные данные согласуются с данными литературы об изменении общего количества АК в организме при патологии (нормальное содержание составляет 5 – 15 мг%) и соотношения «окисленная форма АК/восстановленная форма АК» в сторону увеличения первой.

ВЫВОДЫ

1. Содержание общей АК в эритроцитах детей и взрослых, страдающих ИЗСД, составляет 19.52 мг% и 6,47 мг%, в эритроцитах здоровых детей – 12.48 мг%.

2. Содержание восстановленной АК в эритроцитах больных детей и взрослых составляет 4.1 и 2,01 мг% (20.5 и 31% от общей АК), в эритроцитах здоровых детей – 4.28 мг% (33%).

3. Содержание окисленных форм АК – ДАК и ДКГК в эритроцитах больных детей и взрослых составляет 15.5 и 4.46 мг% (79.5 и 69% от общей АК), в эритроцитах здоровых детей – 8.36 мг% (67%).

4. В общей эритроцитарной массе больных детей соотношение окисленная форма АК/ восстановленная форма АК составляет 4/1, что свидетельствует о превалировании окисленной формы АК над восстановленной.

5. В общей эритроцитарной массе здоровых детей это соотношение равно 2/1, т.е., налицо тенденция к росту содержания восстановленной АК.

Заключение

Уже давно доказали тот факт, что аскорбиновая кислота является постоянной составной частью тканей и органов человека. Важность выполняемых ею физиологических функций не подлежит сомнению. Некоторые из них давно известны и хорошо изучены. Например, то, что витамин С оказывает благоприятное воздействие на работу иммунной системы, нормализует эритропоэз и продукцию коллагена, является компонентом антиоксидантной системы клетки. Однако многочисленные исследования недавнего времени показали, что возможности этого вещества гораздо шире, чем представлялось до сих пор. К примеру, было обнаружено ценное свойство аскорбата нормализовать уровень сахара в крови, оказывая положительное воздействие на углеводный обмен. При выполнении этой и других биохимических функций аскорбиновая кислота обратимо окисляется в ДАК, при последующем воздействии окислителя необратимо переходит в ДКГК. По данным литературы, соотношение «окисленная форма АК/восстановленная форма АК» может изменяться при различных патологиях, как и ее общее содержание в организме. Одной из распространенных патологий является инсулинзависимый сахарный диабет. Поскольку ИЗСД является эндокринной патологией, протекающей с нарушением углеводного обмена, в регуляции которого аскорбат играет немаловажную роль, было бы логичным предположить, что его содержание в организме больного окажется иным, чем у здорового человека. Экспериментальные данные подтвердили это предположение. В организме больного ребенка содержание общей АК повышено на 37 % по сравнению с общей АК и составляет 19,52 мг%, тогда как нормальным считается наличие от 5 до 15 мг% аскорбата. Среднее значение АК у здорового ребенка – 12,48 мг%. В то время как содержание ДКГК в процентном соотношении практически не изменено и составляет у больных и здоровых детей 46 и 49,4 % соответственно (6,16 мг% и 8,96 мг%), концентрация ДАК у больных детей повышена против здоровых почти вдвое и составляет 33,5 % вместо 17,6 % (6,54 мг% и 2,2 мг%). Основные различия выявляются в процентном содержании восстановленной формы АК. Ее содержание у здоровых детей составляет 33 % общей АК (4,28 мг%), тогда как у больных детей оно ниже на 13 % и составляет 4,1 мг%. Таким образом, соотношение «окисленная форма АК/восстановленная форма АК» у больных детей составляет 4:1, в отличие от здоровых детей, у которых оно равняется 2:1.