Получение моноклональных антител

Введение

Для многих исследований, связанных с изучением биологических структур большую ценность представляют реагенты, способных специфически взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом, обладающим указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря на то, что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только с антигеном, то есть с молекулой способной вызвать иммунный ответ, для большинства структур удается подобрать условия, при которых они становятся антигенами и индуцируют выработку комплиментарных антител (например, при конъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большое распространение иммунологических методов, связанных с использованием антител, в различных областях биологии и медицины.

Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификации и количественного определения антигенов в различных областях исследований представляет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность антител.

История создания метода

Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокогомогенный аппарат антител с узкой специфичностью. Кроме того, возможно слияние плазмацитомы (опухоли, возникшей из антителообразующей клетки или ее предшественника) с клетками селезенки иммунизированного животного, получив таким образом гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки – синтезировать антитела предопределенной специфичности.

Предпосылками для возникновения метода получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух методологических подходов:

1) получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне организма;

2) метод соматической гибридизации клеток.

У мышей довольно легко получить миеломы (плазмацитомы). Эти опухоли являются потомками одной клетки (то есть имеют моноклональное происхождение) и секретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из которых могут взаимодействовать с известными антигенами. Опухоли индуцируют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика. Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус животного, и только у двух линий инбредных мышей экспериментаторам удалось получить такие опухоли.

Миеломные клетки мыши оказались чрезвычайно удобными для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для понимания структуры, механизмов секреции и их функции. Однако, миеломная система как источник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей – не удавалось иммунизировать животных, а затем получить мышиные миеломы, продуцирующие антитела к иммунизирующие антигену. Из тысяч миеломных опухолей, индуцированных у мышей, лишь единичные вырабатывали иммуноглобулины, которые реагировали с известными антигенами, что было обнаружено путем грубого скринирования с множеством потенциальных антигенов. Таким образом, миеломные белки оказывались с неизвестной антигенной специфичностью.

Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явилась техника гибридизации соматических клеток, разработка которых широко проводилась после открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер – гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров – образуется гибридная клетка. Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить, использовав ряд агентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль.

Даже при использовании агентов, повышающих слияние, частота образующихся гибридов крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды, позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее время разработано несколько принципов селекции гибридных клеток. Одним из наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы, содержащей гипоксантин, амидоптерин и тимидин (система ГАТ).

Селекция гибридных клеток основана на том, что в ГАТ среде родительские миеломные клетки погибают, а нормальные клетки селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования, так что выживают и размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.

Подготовительные этапы перед проведением слияния

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы:

ﭼ иммунизация животных;

ﭼ подготовка клеток к слиянию;

ﭼ слияние;

ﭼ отбор индуцирующих специфические антитела клонов;

ﭼ клонирование и реклонирование;

ﭼ массовая наработка гибридомных клеток;

ﭼ получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;

ﭼ выделение антител.

Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3-4 месяца.

Организация работы и оборудование. Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это помещение надо оснастить следующим оборудованием:

1. Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицы крупнее 0,3 мкм.

2. Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температура и концентрация СО2.

3. Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с охлаждением.

4. Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.

5. Холодильник на +4 и на –200 С.

6. Водяная баня на +37 и +560 С.

Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700 С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридом нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения иммуноферментного и радиоиммунологического анализов, среды для культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).

Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Основными средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Выбор экспериментального животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных.

Другие животных практически не используются.

При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки антигена.