Клонирование

Страница 3

Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер они использовали зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластулы.

Метод МакГрата - Солтера стал широко использоваться разными экспериментаторами. Так Манн и Ловел-Банж выделяли пронуклеусы яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживал их в энуклеированные зиготы мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же, наоборот, пронуклеусы получали из оплодотворённых яиц и пересаживали в партеногенетические и лишённые ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения.

Сурани с соавторами установили, что если добавить женские пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинация женского и мужского пронуклеусов из ранних оплодотворённых яйцеклеток мышей обеспечивает нормальное развитие, а комбинация 2-х мужских или 2-х женских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуется два набора хромосом – отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известного вида млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому же работы Хоппе и Илменсе не удалось повторить.

Однако такие исследование ещё дважды будоражили научное сообщество. В 1982 году пересадили ядра клеток партеногенетических бластул мышей в энуклеированные зиготы. Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и якобы получены четыре взрослых самки, но в свете вышесказанного эти результаты маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических и андрогенетических) зародышей у млекопитающих связана с различной активацией онтогенеза материнского и отцовских геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был назван геномным импритингом и изучался в ряде работ, где было показано, что для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома.

Другая статья Илменсе и Хоппе имела ещё больший резонанс. Авторы сообщили о пересадки ядер внутренней клеточной массы бластулы в энуклеированные зиготы мышей и получения трёх взрослых особей (двух самок и одного самца), генетически идентичной донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один приём, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластулы и пересаживали в матку самок. Из 16 пересаженных бластул три развились во взрослые особи. В следующей работе эти же авторы использовали в качестве доноров-ядер клетки эмбрионов ещё более поздней стадии (семь суток) и будто бы получили трёх половозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и достоверность результатов Илменсе и Хоппе вновь была поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластулы не обеспечивают развития in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластулы. Наибольшая часть (5%) 4-клеточных зародышей даёт возможность развиваться только до стадии морулы. В тоже время 19% реконструированных яйцеклеток 2-ядерных клеточных зародышей, смогли спокойно достичь стадии морулы или бластулы.

Эти и другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточное ядро рано теряет тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней активизацией генома зародыша – уже на стадиях двух клеток. У других млекопитающих, в частности у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активизация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16 клеточной стадии. Возможно, поэтому первые значительные успехи в клонировании животных были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.

Тем не менее, особый интерес вызывают опыты группы учёных из университета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Уилмута, о котором речь пойдёт ниже, они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощью которой можно было бы безболезненно извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в обезъядренную клетку. Кроме того, авторы использовали в качестве донорских относительно менее дифференцированные ядра клеток, окружающих ооцит. Наконец, удалось, как бы синхронизировать процессы, протекающие в яйцеклетке и трансплантируемом в нём ядре, что позволило обеспечить естественные ядерно-цитолазматические взаимоотношения между ядром и цитоплазмой, поскольку трансплантируемое дифференцированное в определённом направлении ядро и цитоплазма яйцеклетки до того работали как бы в разных режимах.

Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит (клеток так называемого cumulus oophorus), клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию, поместив в специальный раствор (так называемый HEPES-CZB), свободный от кальция, и добавляя стронций и цитохалазин.Стронций активировал яйцо, а кальций подавлял образование полярных телец. Эмбрионов культивировали до стадии 2-8 клеток, морулы или бластулы, а затем трансплантировали в матку приёмной матери, где многие из них имплантировались и некоторые из них (15-16%) продолжали своё развитие. Процент выхода рождённых мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18, 5-19-й дни беременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рождённых мышат к клеткам донора соматических клеток.Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих.

Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии млекопитающих.

Кролики и коровы.

Американские исследователи Стик и Робл, используя метод Солтера и МакГрата, получили шесть живых кроликов, пересадив ядра 8-клеточных эмбрионов одной породы в лишённые ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким способом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идёт несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, а in vivo – в перевязанном яйцеводе овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до развитого детёныша. Уиландсин предложил заключить реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он потом трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы или коровы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеводе, чем в культивированной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании in vitro.

Американцы Робл и его сотрудники использовали щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенные МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала пронуклеусы центрифигурировали, чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заострённой стеклянной пипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготы