Комбинированное действие солей тория, свинца и гамма-излучения на мужские половые клетки лабораторных мышей

Страница 5

§ ранние доминантные летали (РДЛ) = сумма эмбрионов и резорбций / количество желтых тел.,

§ поздние летали (ПДЛ) = количество резорбций / количество желтых тел.,

§ общая эмбриональная смертность (ДЛМ) = количество эмбрионов / количество желтых тел.

По 10 самцов через 35 суток после снятия воздействия забивали для определения уровней АГС. При приготовлении использовали стандартную методику (Soares et al., 1979) в модификации А.О. Ракина: эпидидимус самца измельчали на часовом стекле в 2-3 каплях физраствора, затем прибавляли 2-3 капли 10%-го воднорастворимого эозина, после чего пипеткой отделяли эмульсию и переносили ее на препаровальное стекло, распределяли по нему и высушивали при комнатной температуре. Готовый препарат анализировали под микроскопом, подсчитывали количество аномалий в выборке из 500 спермиев.

Статистическую обработку данных проводили с применением стандартного пакета программ "Microsoft Excel – 7", для определения достоверности различий использовали критерий малых доз Фишера (Плохинский, 1980).

3. Результаты и обсуждение

Исследование генотоксической эффективности ионов свинца, вводимых в организм в субвитальных концентрациях (1 – 10% ЛД50/30) (Левина, 1972), было сосредоточено на наиболее уязвимой стадии сперматогенеза – этапе формирования сперматоцитов (померанцева и др., 1988). В этом отношении сроки тестирования ДЛМ и АРГ должны обеспечивать детекцию мутационных событий, имеющих сходные механизмы реализации (Мендельсон, Сергеева, 1990). Необходимо отметить, что применяемые нами концентрации нитрат-иона не являются мутагенными (Ракин, 1990), что позволяет рассматривать в качестве генотоксического фактора только содержащийся в соединении свинец.

Доминантные летальные мутации. Поскольку доимплантационная (ранние доминантные летали) (РЛД) и постимплантационная гибель эмбрионов (поздние доминантные летали) (ПДЛ), как правило являются результатом нарушения различных наследственных механизмов, то мы сочли необходимым разделить их на анализ.

1). В таблице 1 и на рисунке 1 представлены результаты определения уровней РДЛ, ПДЛ и суммарных леталей (ДЛМ) у групп самцов, подвергнутых затравке свинцом в различных концентрациях. Как из представленных данных, РДЛ в 1-м, 3-м и контрольном вариантах показатели опыта практически не отличаются. Исключении составляют результаты анализа этих параметров в варианте 2, частота РДЛ. В этом случае достоверно ниже таковой в контроле (Р<0,001). Поскольку физиологическое состояние интактных самок, использованных в эксперименте было одинаковым, то можно предположить, что у самцов из варианта 2 происходит снижение оплодотворяющей способности спермиев или внесение в зиготу таких нарушений генома, которые препятствуют дроблению яйца (Шевченко, Померанцева, 1985). Таким образом, по критерию РДЛ генетически эффективной оказалась концентрация свинца 0,1 г/кг.

При анализе ПДЛ, являющихся по мнению многих исследователей истинными доминантными леталями (Ватти, 1965; Мендельсон, Сергеева, 1990; Ракин, 1990; Померанцева, Рамайа, 1993; и др.), была обнаружена тенденция снижения эффекта по мере роста концентрации свинца. Наименьшая частота ПДЛ зафиксирована в варианте 1 (5,7%), а наибольшая – в варианте 3 (12,1%) (Р<0,05). при этом значения леталей в контроле не имеют достоверных различий с данными, полученными при анализе результатов каждого отдельно взятого варианта опыта. Можно отметить, что генотоксичность минимальной концентрации затравки больше, чем максимальной, а по отношению к контролю эффективность свинца (по критерию ПДЛ) несущественна.

При рассмотрении суммарных значений ДЛМ прослеживается дозовая динамика нарушений, схожая с таковой РЛМ, когда концентрация свинца 0,1 г/кг индуцирует статистически достоверно меньше повреждений, чем при спонтанном мутагенезе (Р<0,05). Повышение частоты ДЛМ в вариантах 1 и 3 по сравнению с контрольным значением параметра не достоверны.

Подобные нелинейные эффекты выхода генетических нарушений были весьма показательны и в других исследованиях (Петин, 1997; Гераськин, 1996). В нашем случае при концентрации свинца в интервале от 0,03 до 0,1 г/кг, вероятнее всего был превышен "порог поражаемости" для типа нарушений, влекущих за собой формирование ДЛМ (реципрокные транслокации и крупные хромосомные аберрации) (Шевченко, Померанцева, 1985). При дальнейшем повышении концентрации затравки репаративные системы уже не справлялись с возрастающим количеством мутационных событий, что привело к повышению уровня нарушений.

2). При гамма-излучении животных выявлено значительное увеличение уровней эмбриональной смертности (на всех этапах) по сравнению с контролем (Р<0,001) (см. Табл. 3 и рис. 3). Это явно свидетельствует о высокой мутагенной активности ИИ данной интенсивности. Очевидно, что репаративные системы клеток не способны были полностью компенсировать повреждающее действие гамма-излучения.

3). Комплексное воздействие ИИ в дозе 1,8 Гр и свинца в концентрациях 0,3 и 0,1 г/кг (см. Табл. 3 и рис. 3) выявило значительный генотоксический потенциал сочетаний данных мутагенов по критериям РДЛ и ДЛМ (Р<0,05). В то же время результаты обработки мышей свинцом в концентрации 0,03 г/кг в совокупности с гамма-облучением позволяют сделать вывод о низкой мутагенной активности данного сочетания воздействующих факторов. Таким образом можно с уверенностью сделать вывод, что "порог поражаемости" сперматогониев меньшей по критериям РДЛ и ДЛМ при воздействии гамма-излучения в дозе 1,8 сГр находится в промежутке концентраций свинца 0,1 и 0,03 г/кг. Анализ уровней ПДЛ во всех вариантах комплексной обработки мышей не выявил статистически достоверных различий с частотой этих нарушений в контрольной группе, что позволяет сделать заключение о низкой генетической эффективности сочетанной затравки при индукции постимплантационной гибели.

Исследование монотонностей дозовых зависимостей выхода РДЛ н ДЛМ однозначно свидетельствует об их линейном характере (r рдл = 0,9011 (P<0,01); r длм = 0,9468 (р<0,001)). В случае же анализа ряда ЛДЛ прямая дозовая зависимость не прослеживается (r = 0,1491). Таким образом, можно с уверенностью сделать вывод о том, что индуцируемые комплексом комутагенов ПДЛ не зависят от затравки в данном диапазоне концентраций свинца и при указанной дозе гамма-излучения.

Нами был произведен расчет коэффициентов сочетанного действия (Ракин, 1991) по формуле:

S = (Q-q)/Q, (Q = m + l – (nM + nL); q = k – nK),

где m, l и k - значения параметра при действии соответственно факторов М, L и М+L, а nM, nL и nK - спонтанные уровни. Необходимо отметить, что применение формулы не корректно в случае Q » 0, как и при значеяиях m, l и k близких n. Расчет значений S с неприменением регрессионного анализа позволяет выделить "интервал аддитивности", в который не попадают данные, отражающие антагонистические (< 0) или синергические эффекты (> 0).

Данные, представленные в Таблице 3 свидетельствуют, в основном об антагонистическом и аддитивном эффектах сочетанного действия обозначенных факторов. Исключение составляет вариант обработки мышей облучение + 0,1 г/кг Рb по критерию РДЛ, где прослеживается явный синергический эффект. Индукция же ПДЛ во всех случаях комплексной обработки имеет антагонистический характер. Таким образом можно заключить, что истинный показатель генотоксичности сочетаний гамма-облучения и указанных концентраций свинца – постимплантационная гибель эмбрионов – снижается при комплексном воздействии мутагенов, в отличии от вариантов их раздельного на сперматогонии мышей. Это согласуется с данными других исследователей (Витвицкий и др., 1996). То есть, предположительно, "включение" механизмов репарации более высокого уровня обеспечивает более низкий уровень выхода генетических нарушений.

В таблице 2 (рис. 2) представлены частоты РЛМ, ПЛМ и ДЛМ у групп самцов подвергнутых затравке торием и гамма-облучением.

Уровни РЛМ статистически достоверно превышали контрольные значения, как видно на иллюстрациях, при максимальных и минимальных нагрузках при обработке животных g-излучением и торием порознь (P<0.01). Максимальная степень воздействия индуцировала возникновение практически схожих частот леталей (17,6 и 17,4% соответственно) при обработке торием в совокупности с облучением в дозе 1,8 сГр (P<0,05). При анализе дозовой зависимости выходы нарушений по критерию РЛМ во всех вариантах эксперимента не наблюдали линейного характера, что подтверждается статистическими методами. Однако, некоторая схожесть дозовых динамик нарушений была выявлена при попарном анализе частот РЛМ при раздельной обработке мышей ИИ и торием (r = 0.881±0.10), при воздействии радиации и тория в совокупности с облучением в дозе 1,8 сГр (r = 0,8387 ± 0,09) и при сравнении результатов затравки торием и торием в сочетании с облучением в дозе 1,8 сГр (r = 0,8785 ± 0,07) (во всех случаях P < 0,01). Если принять во внимание, что схожесть дозовых динамик была отмечена при сопоставлении частот АГС, индуцированных воздействием тория и тория в сочетании с облучением в дозе 1,3 сГр (см. выше), то в данном случае можно говорить о том, что при затравке торием и минимальной радиационной нагрузке отмечается синхронность в процессах формирования повреждений генного характера, реализуемых в АГС и РЛМ.