Избирательное повреждение интерстициальных клеток Кэйждела (ИКК) метиленовым синим и светом ведёт к потере медленных волн

Инкубация в 50 ммоль метиленового синего (МС) и последующая интенсивная иллюминация приводит к исчезновению активности медленных волн в ИКК подмышечного слоя циркулярных мышц в препаратах толстого кишечника собак. Это часто сопровождается снижением потенциала покоя мембран. Реполяризация клетки к исходным –70мВ не восстанавливает активность медленных волн, что указывает на то, что МС непосредственно прерывает образование медленных волн. После инкубации МС, 2-х минутная иллюминация изменяет конформацию митохондрий в ИКК от очень конденсированной до ортодоксальной, без индуцирования каких-либо других видимых изменений в гладкомышечных клетках. После 4-10 минутной иллюминации, ИКК начинают прогредиентно разрушаться увеличенными и разорванными митохондриями, теряют цитоплазматическую контрастность и детальность, появляются разрывы плазматических мембран. В то же время не выявляются повреждения в гладкомышечных и нервных клетках. Ультраструктура соединительных щелей сохраняется. Интенсивная иллюминация без преинкубации МС приводит к утрате медленных волн, при этом не нарушается ультраструктура в препаратах ИКК. В препаратах гладких мышц, без подмышечного слоя ИКК, МС и свет не изменяют электрической активности. Авторы считают, что корреляция между избирательным повреждением подмышечных ИКК и избирательной утратой активности медленных волн указывает на то, что ИКК играют незаменимую роль в генерации медленных волн.

Концепция регуляторной роли интерстициальных клеток Кэйджела в функционировании желудочнокишечного тракта (ЖКТ) впервые была выдвинута Stach в 1972 (30), Duchon et al. В 1974 (6), и Faussone-Pellegrini в 1977 (9). И только в 1982 году была выдвинута гипотеза – ИКК играют роль в генерации ауторитмичности ЖКТ (Thunberg). Очевидность того, что ИКК способствуют генерации активности синусового узла и последующей генерации медленных волн было установлено на ряде тканей, включая тонкий кишечник и толстый кишечник. Важно и то, что ИКК обнаруживаются в тех областях (подмышечные сплетения толстого кишечника), где образуются медленные волны.

В толстом кишечнике собак, очевидность роли ИКК в генерации активности синусового узла вытекает из следующего:

1. Когда сети ИКК удаляются, слой циркулярных мышц (ЦМ) не может генерировать активность медленных волн

2. В очень тонких препаратах, состоящих из сети ИКК и связанных с ними гладкомышечных клеток, постоянно записываются спонтанные медленные волны.

Авторы показали, что электрическая активность записанная на поверхности подмышечного слоя – следствие электрического взаимодействия между телом ЦМ и подмышечной сетью ИКК вместе с гладкомышечными клетками (ГМК). В результате излишних пар ИКК к ГМК с помощью соединительных щелей, роль каждого типа клеток в генерации медленных волн не может быть определена точно в электрофизиологических исследованиях с применением изолированных мышечных лоскутов.

До появления электронной микроскопии, большинство селективных методов для распознования ИКК основывались на способности последних аккумулировать краситель МС вне физиологических условий. Взависимости от условий МС может первично связываться ИКК или нервной тканью. В пршлом идентификация ИКК с использованием прижизненного окрашивания МС применялась только на тонком кишечнике мышей, гвинейских свиней и кроликов. В свежих публикациях, авторы демонстрируют способность аккумуляции ИКК толстого кишечника собак. В том же исследовании, авторы показали, что в подавленном свете МС не вызывает изменений ультраструктур в окрашенных ИКК и знчительно не изменяет медленных волн.

В предварительном исследовании, авторы выяснили, что активность медленных волн тонкого кишечника мышей исчезает , когда селективно окрашенные ИКК освещаются. Более того, иллюминация МС-окрашенных ИКК в культурируемых кусочках тонкого кишечника мышей приводила к потере спонтанной ритмичной контрактильной активности, это эффект был обратимым на короткий период при иллюминации низкой интенсивности, но необратимым в других случаях.

Задачей авторов было обнаружить метод специфического повреждения ИКК толстого кишечника собак. Фототоксические свойства МС использовались для изучения вероятных эффектов на активность медленных волн и изменения ультраструктуры различных типов клеток связанных с подмышечной сетью ИКК.

МЕТОДЫ.

Ткани и препараты.

Собаки обоих полов были убиты передозировкой калиевой соли фенобарбитала (100 мг/кг). Примерно 5 см проксимального отдела толстой кишки было взято от каждой собаки, отступя 5 см дистальнее от илеоцекального сочленения. Затем толстый кишечник вскрывался продольным разрезом. Затем очищенный сегмент прикреплялся ко дну диссекционной чаши Сильгарда наполненной постоянно оксигенированным (95% кислорода и 5% СО2) раствором Кребса.

Чтобы изучить специфичность действия МС и света, авторы исследовали действия МС и света и на препаратах ИКК-ЦМ (подмышечная сеть ИКК и ЦК) и на препаратах ЦМ (ЦМ, отделённые от подмышечного слоя ИКК и гладкомышечных клеток.

Примерно 2 кв. мм. Ткани, с подмышечной поверхностью, обращённой вверх прикреплялся ко дну переносного держатель. Затем ткан была разрезана вдоль прикреплённых краёв, исключая один край, где была вырезана полоса длиной 10 мм, шириной 3 мм вдоль длинной оси ЦМ клеток. Свободный конец полосы был взят на хирургический шёлк (0,5 мм в диам). Держатель перемещали в разделённую камеру причём прикреплённую ткань – в записывающую камеру, свободный конец в стимулирующую камеру. Свободный конец также соединяли с сильным преобразователем.

Лекарства и растворы.

Все растворы вводимы в раздельную камеру были нагреты до 37 гр и оксигенированы кислородом 95% - СО205%. Состав раствора Кребса был такой: 120,3 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 20,2 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4 и 11,5 глюкозы. МС (сигма) был расстворён в растворе Кребса.

Внутриклеточные записи.

Внутриклеточные записи были сделаны микроэлектродами имевшими пиковое сопротивление 30-50 ом. Микроэлектроды были заполнены 3 М KCl. Заполненные микроэлектроды подключались к держателю соединённому с электрометром. Данные электрометра отражались на осцилоскопе и записывались на принтер. Электрические импульсы подавались на мышечный лоскут. Сила электрического поля отражалась на осцилоскопе и записывалась на принтере. Мышечные лоскуты подлежащие воздействию импульсами продолжительно оксигенировались раствором Кребса с частотой 500 мл/час в разделительной камере как минимум 2 часа при температуре 37 град перед началом эксперимента.

Во время инкубации МС (50 ммоль) интенсивность света была низкой. Затем препараты мылись раствором Кребса примерно 5 минут. Препараты иллюминировались оптическими волоконными лампами (максимальная интенсивность составила 50 мВ/кв.см. поверхности ткани удалённой от источника света на 3,5 см). интенсивность света измерялась цифровым фотометром. После эксперимента лоскуты немедленно помещали в формалин.

Световая и электронная микроскопия.

После экспериментальной процедуры Сильгард отделяли отдержателя с тканью, фиксированной формалином. Лоскуты хранились при температуре 4 град. Каждый лоскут делили на 4-6 кусочков ткани. Перед дальнейшей процедурой степень связывания МС определялась стереомикроскопией. Затем ткань мылась 0,1 м фосфатным буфером, фиксировалась 2% осмической кислотой в 0,1 М фосфатном буфере в течении 1 часа. Ультратонкие образцы фиксировались спиртовым ацетатом мочевой кислоты и исследовались в электронном микроскопе.

Статистический анализ.

Статистическая значимость данных внезависимости от различных условий была установлена Student’s тестом.

Результаты.

Электрофизиологические исследования.

Эффекты света на МС окрашенные ИКК-ЦМ препараты. Инкубация ИКК-ЦМ препаратов в 50 ммоль МС + 45 мин деполяризация клеток повышают продолжительность медленных волн. Чтобы уменьшить неспецифические экстрацеллюларные эффекты МС вовремя иллюминации, ткань мылась раствором Кребса. Во время этого устранялись эффекты МС на активность медленных волн. Эта часть эксперимента выполнялась в подавленном свете.