Исследование апоптотической активности лимфоцитов периферической крови in vitro при инфекционном мононуклеозе и мононуклеозоподобном синдроме

Страница 4

В отличие от некроза, когда одновременно гибнут массы соседствующих клеток, апоптоз развивается изолированно в единичных клетках. Если в случае некроза из клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что нередко приводит к развитию или прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные проявления отсутствуют [Мушецяну К и соавт.,1965]. Клетки, подвергшиеся апоптозу (а иногда и находящиеся в процессе апоптоза), и апоптотические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофагами, но и “непрофессиональными” фагоцитами (например, мезангиальными клетками почек) [Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995].

Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований (т.п.о.), позже 30-50 т.п.о. Уже на этой стадии регистрируется конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно эти начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после осуществления которого процесс становится необратимым [Погорелов В.М., Козинец Г.И.,1995].

Следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, т.е. расщепление в результате формирования разрывов (в основном двунитевых) между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 п.о. Именно эти фрагменты выявляются в виде “лесенки” при электрофорезе ДНК апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза [Казанова Л.И.,1979; Marmur J.,1961].

Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, она зависит от температуры, требует синтеза РНК и белка de novo. Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности разных ферментов. Считают, что межнуклеосомная деградация при апоптозе обусловлена активацией резидентной ядерной Са2+Мg2+зависимой эндонуклеазы [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Выделена эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кД. Мало сведений о ферментах, обеспечивающих появление крупных разрывов ДНК. По одним сведениям, они не зависят от Са2+ (хотя и зависят от Мg2+), по другим данным, формирование крупных фрагментов ДНК так же зависит от Са2+. Феномен апоптоза неоднороден и при действии различных его индукторов, события, по крайней мере до определенного этапа, могут развиваться по разнообразным сценариям, и лишь достигнув определенной точки конвергенции, различные пути сходятся, а механизмы реализации гибели оказываются идентичными. К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию цистеиновых и сериновых протеиназ. Ингибиторы сериновых протеиназ подавляют апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами [Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995].

Наблюдаемые при апоптозе уплотнение и деформация наружной и внутриклеточной мембран, формирование устойчивого к действию детергенов покрова, сморщивание цитоплазматических гранул связывают с перекрестным сшиванием белков, обусловленным активацией Са2-зависимой трансглутаминазы типа II, что служит обязательным и характерным биохимическим признаком апоптоза. Непосредственной причиной гибели клеток при апоптозе, вероятно, служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации поли (ADP- рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961].

1.3.3. Распознавание апоптотирующей клетки макрофагами

К настоящему времени расшифровано три механизма, с помощью которых макрофаги распознают клетки, подвергающиеся апоптозу, и удаляют их.

Распознавание, а следовательно и адгезия макрофагов к клеткам, вступившим на путь апоптоза, почти полностью блокируется при добавлении в среду N-ацетилгалактозамина и галактозы. Из этого следует, что ранним мембранным проявлением апоптоза является специфическая перестройка углеводных компонентов мембраны с потерей сиаловых кислот, наружной экспрессией сахаров и снижением общего отрицательного потенциала наружной поверхности мембраны. Потеря терминальных сиаловых кислот с боковых цепей мембранных гликопротеидов влечет за собой то, что экранированные в обычных условиях ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин и галактоза приобретают возможность взаимодействовать с лектинами макрофагов [Taga H. e. a. , 1994]

Другой тип распознавания апоптотирующих клеток осуществляется с помощью макрофагального a4b3 интегринового рецептора. Тромбоспондин, синтезируемый и выбрасываемый в микроокружение макрофагами, выполняет роль молекулярной скрепки между апоптотирующей клеткой и макрофагом. Существенную роль в этом процессе играет мембранный мономер 88кД, больше известный как CD36. Третий механизм распознавания клеток, вступивших на путь апоптоза, состоит в том, что на самых ранних этапах программированной гибели клеток, еще до формирования апоптотических телец, происходит инверсия мембранных фосфолипидов. В обычных условиях наружный лепесток мембранного бислоя содержит, в основном, нейтральные фосфолипиды, сфингомиелин и фосфатидилхолин, в то время как отрицательно заряженные фосфолипиды структурированы на внутреннем лепестке мембранного бислоя. У апоптотирующих клеток эта мембранная асимметрия нарушается, и они экспрессируют наружу фосфатидсерин, который распознается специфическим макрофагальным рецептором [Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992].

Следует отметить, что тип распознавания апоптотирующих клеток макрофагами может сильно зависеть от типа клеток и от стадии процесса программированной гибели [Исаева М.П. и соавт.,1998].

1.3.4. Гены, участвующие в апоптозе

Некоторые гены важны для программирования клеток к гибели, другие необходимы для окончательного удаления мертвых клеток и, наконец, четыре гена непосредственно участвуют в процессе апоптоза [Akbar A. N. e. a., 1993].

Продукт гена nuc-1 является эндонуклеазой, расщепляющей ДНК в мертвых клетках. Клетки с мутацией в nuc-1 погибают без деградации ядерной ДНК. Неизвестно существует ли сходство между продуктом nuc-1 и Са2+Мg2+зависимой нуклеазой [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961].

Два гена- ced-3 и ced-4- необходимы для клеточной гибели. При мутациях в этих генах клетки, обычно запрограммированные на гибель, выживают. Показано, что ced-3 является протеазой, а ced-4 содержит Са2+Мg2связывающий домен. ced-9 кодирует белок, предотвращающий гибель клеток, индуцированную ced-3 и ced-4 [Akbar A. N. e. a., 1993,].

1.3.5. Необходимость изучения апоптоза

Отметим ряд наиболее важных для фармакологии направлений для изучения апоптоза.

Во-первых, поиск и разработка препаратов, угнетающих апоптоз. Клиническую перспективность могут иметь препараты, блокирующие апоптоз, индуцированный некоторыми вирусами и суперантигенами. Очевидно, что такие антиапоптотические препараты будут представлять собой первый класс иммуностимуляторов. Теоретически, ингибиторы апоптоза пригодны для лечения ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз, инсульт, травмы мозга, инфаркт миокарда [Marmur J.,1961]. Индукторы апоптоза необходимы прежде всего для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных расстройств [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Особый интерес представляют исследования, касающиеся изучения процессов запрограммированной клеточной гибели при ИМ. Исследование морфологии и анализ ДНК Т-лимфоцитов позволили установить, что вирусный интерлейкин-10 (продукт репликации EBV) ингибирует потерю клетками объема, уплотнение хроматина и фрагментацию ДНК, характеризующие апоптоз [Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992], напротив, при остром ИМ было зарегистрировано повышение Т-клеток с признаками апоптоза. Известно, что некоторые цитокины типа интерлейкинов 2, 5, 6 могут препятствовать апоптозу Т-лимфоцитов [Исаева М.П. и соавт.,1998]. Исходя из этого, авторы предположили, что апоптотическая гибель большинства Т-лимфоцитов была связана с их миграцией из участков, активно продуцирующих данные факторы, в результате антигенного воздействия, то есть апоптоз Т-клеток представляется авторами как механизм антигенуправляемой селекции лимфоцитов [Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961]. Увеличение числа апоптотических Т-лимфоцитов (APS) при ИМ также наблюдали Y. Matsuoka e. a. [1997]. Уровень APS повышался на ранней стадии ИМ и нормализовался с уменьшением числа атипичных лимфоцитов. Авторы предполагают, что апоптоз Т-клеток при ИМ способствует восстановлению части поврежденных вирусом В-лимфоцитов [Taga H. e. a. , 1994].