Генная инженерия

Страница 10

Однако первые попытки применить описанный выше подход для клонирования млекопитающих были безуспешными и даже скандальными. Сенсационные результаты Illmensee по рождению мышей, развившихся после пересадки кариопластов из разных частей предимплантационных эмбрионов мыши в энуклеированные яйца, не были подтверждены другими исследователями. Эти результаты вызвали еще большие сомнения после заявления лаборанта Illmensee, что результаты опытов Illmensee были фальсифицированы. В начале 80-х годов эксперименты по трансплантации ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйца или ооциты показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 2-го деления-дробления. Другой экспериментальный подход для изучения тотипотентности эмбрионов был основан на разделении бластомеров на ранних стадиях развития (до 16-клеточной стадии) и независимой их трансплантации приемным матерям. Результаты этих экспериментов показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 4-клеточ-ной стадии, хотя у овец такая потеря происходит на более поздней стадии развития (после 16-клеточной стадии). Открытие импринтинга и его существенной роли в развитии млекопитающих сделало еще более проблематичной возможность клонирования млекопитающих, поскольку выяснилось, что материнский и отцовский геномы имеют разный вклад в нормальное развитие эмбриона, причем эти функциональные различия родительских геномов формируются в процессе овогенеза и сперматогенеза, импринтируются и реализуются в течение всего онтогенеза.

Тем не менее, исследования тотипотентности и плюрипотентности в эмбриональном развитии продолжались с использованием новых экспериментальных подходов. Уже в конце 80-х годов стало очевидным, что ооцит на стадии М2 (второе меойтическое деление) обладает факторами, способными репрограммировать геном клеток, полученных из внутренней клеточной массы бластоцисты после их трансплантации в энуклеированный ооцит М2. Здесь следует отметить значительный вклад в разработку этой техники шотландской группы исследователей под руководством Ian Wilmut и американских исследователей Keefer, Mathews и First. В 1996 г. вышли две публикации по успешному рождению ягнят и развитию эмбрионов коров до 80-85 дней беременности в экспериментах по трансплантации кариопластов, полученных из клеток культуры эмбриональных стволовых клеток, в энуклеированные ооциты М2 (Campbell et al., 1996; Keefer et al., 1996). По-видимому, эти успехи подтолкнули Ian Wilmut и его коллег попытаться использовать в качестве доноров ядра (кариопласты) дифференцированных клеток, взятых от эмбрионов или взрослых животных. Результатом этих экспериментов явилось рождение Dolly, овцы, развившейся из ооцита М2, у которого было заменено собственное ядро на ядро клетки из культуры эпителиальных клеток, полученной из молочной железы взрослой лактирующей овцы. Вне всяких сомнений, это выдаюшийся успех в клонировании животных. Впервые предложен, хотя и сложный в техническом отношении, способ получения генетических копий млекопитающих. Несомненно также и то, что клонирование станет сильнейшим стимулом для развития нового направления в биотехнологии животных и откроет широкие возможности в селекции сельскохозяйственных животных.

В теоретическом плане работа группы Ian Wilmut показала, что в процессе развития геном не претерпевает каких-либо необратимых изменений, по крайней мере, в части высокодифференцированных соматических клеток. Более того, возможно репрограммирование генома соматических клеток путем трансплантации его в цитоплазму ооцита М2. Фактически это исследование заложило теоретическую базу клонирования животных, хотя здесь имеется много неясностей и нужны дополнительные экспериментальные исследования.

Уместно в этом контексте упомянуть недавние результаты, полученные в лаборатории генетических основ онтогенеза Института цитологии и генетики СО РАН. Здесь были впервые получены гибридные клетки путем слияния высокоплюрипотентных стволовых эмбриональных клеток с клетками селезенки взрослой мыши. Некоторые клоны гибридных клеток имели нормальный диплоидный набор хромосом и дополнительную Х-хромосому, происходящую из высокодифференцированной клетки. В экспериментах по микроинъекциям гибридных клеток в полость бластоцисты была получена серия химерных животных, что показало сохранение высокой плюрипотентности в гибридных клетках. Однако самым впечатляющим результатом этих опытов было обнаружение функциональной "соматической" Х-хромосомы (происходящей от дифференцированной клетки) в разных тканях и органах химер. Показана возможность репрограммирования индивидуальной хромосомы, происходящей от дифференцированной клетки, при введении ее в геном плюрипотентных эмбриональных клеток. Иными словами, получены сходные данные по обратимости дифференцировки на уровне индивидуальных хромосом генома дифференцированной клетки, подобно реактивации целого генома в опытах Ian Wilmut. Другим следствием этого исследования является возможность переноса индивидуальных хромосом от одного животного в геном другого этого же или близкого вида. Таким образом, открывается перспектива использовать плюрипотентные гибридные клетки в качестве носителей-векторов для переноса индивидуальных хромосом между животными и создавать уникальные генотипы, не существующие в природе, поскольку их невозможно получить обычным половым путем.