Страница 3
мую Олайнским заводом химических реактивов. Предлагаемая методика широко апробирована на кафедре микробиологии ЛСГМИ и по качеству результатов не уступает общепринятой. Поэтому мы приводим ее подробное описание. Для приготовления рабочего раствора ДНК, навеску нуклеиновой кислоты из расчета 10 мг/мл помещают в дистиллированную воду, добавляют 0,5 мл 0,2% (или 0,8%) раствора NaOH на каждые 10 мл воды. Для лучшего растворения ДНК смесь либо нагревают до кипения в водяной бане при постоянном перемешивании стеклянной палочкой, либо оставляют на ночь при 37 °С в термостате. К расплавленному и остуженному до 50 °С МПА добавляют рабочий раствор ДНК из расчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА—1 мл раствора ДНК) , перемешивают, разливают по10л(л в пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или в автоклаве при 0,5 атмосферы в течение 20 мин. Срок хранения— 1—2 мес. При постановке опыта столбики агара с ДНК растапливают, в водяной бане добавляют 0,1 мл официнального стерильного 10% р-ра СаСЬ, перемешивают и выливают на слой хорошо подсушенного питательного агара в чашки Петри и вновь подсушивают. Суточную агаровую культуру засевают маленькими бляшками (диаметр равен 2—2,5 мм) или штампом-репликатором не более 20—25 бляшек, во избежание слияния зон деполимеризации ДНК. После 18—20-часовой инкубации поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3—5 мин учитывают зоны просветления. Реакции оценивают в крестах. При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у исследуемых стафилококков в жидких средах. Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный метод Кристи с сотр. Среда Кристи—Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт—0,45 г, пептон—0,75 г, хлористый натрий—1,2 г, агар—2,75 г, вода—130 мл, рН среды == 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок. Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15—20% стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане при 65—70°С в течение 2— 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается в чашки. Испытуемые культуры засевают “пятнами” по 15—20 на чашку. Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки. Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в комплексе с другими признаками активности. Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949) . Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат: гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15—20 мин. Затем в каждую пробирку добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации гиалуроновой кислоты микробным ферментом. Для изучения токсигенности стафилококков удобно пользоваться методом, предложенным Илеком и Леви (1950) , позволяющим определить типы гемолизинов. С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека. На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1—2 мл от края полоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после чего учитывают результаты. Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами Бета-гемолиз на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это “тепло-холодовый” токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен. Дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Однако образование дельта-гемоли-зина на этих чашках может быть замаскировано действием альфа-токсина и поэтому его следует проверять на средах с эритроцитами человека или лошади. Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизинов достаточно использовать эритроциты барана и человека или лошади. Для определения вирулентности стафилококков существуют несколько различных методов заражения белых мышей. Наиболее простым является введение 0,1 мл суточной бульонной культуры испытуемого стафилококка в хвостовую вену. Учет гибели животных осуществляется в течение 10 суток, регистрируют наличие абсцессов в почках. Удобно пользоваться способом Badenski и сотр. (1958) , Суточная бульонная культура центрифугируется при 3000 об/мин — 30 мин. Полученный осадок ресуспендируется в половинном объеме декантата и в количестве 0,05 мл вводится 6 мышам позади глазного яблока в окологлазничную клетчатку. Культуру, вызывающую гибель половины и более зараженных мышей в течение 6 дней, считают вирулентной. При этих методах заражения вирулентной культурой у животных развивается общин септический процесс с преимущественным поражением почек. Основная гибель мышеи происходит на 3—5-й день после заражения. Другие способы заражения белых мышей (внутрибрюшинный и интраназальный) требуют в десятки раз большей заражающей дозы, максимум гибели мышей приходится на 1—2-е сутки, что характеризует преимущественно токсический компонент процесса (С. А. Анатолий, И. И. Антоновская, 1967) . В то же время ряд исследователей отдают предпочтение более простому технически внутрибрюшинному способу заражения мышей, который одновременно позволяет изучать клеточные и гуморальные механизмы развития инфекции. Сопоставление вирулентности стафилококков для белых мышей с отдельными факторами их патогенности показало, что вирулентность штаммов, по данным большого числа исследователей, коррелирует с уровнем альфа-гемотоксина. Что касается других признаков патогенности и их корреляции с вирулентностью, то получены разноречивые сведения. Так, по данным С. А. Анатолия (1969) , вирулентность штаммов коррелировала с продукцией бета-гемолизина, летального фактора, лецитовителлазы, гиалуронидазы и коагулазы. А. К. Акатов (1968) не отмечает корреляции вирулентности с коагулазной, лециговител-лазной, фибринолитической активностью, не установлена корреляция с дельта-токсигенностью. Для сравнения вирулентности стафилококковых культур можно использовать их способность вызывать дермонекротическую реакцию у кроликов. Готовят 4-миллиардную взвесь суточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе, а из полученной густоты делают разведения, чтобы получить 2- и 1-миллиардные взвеси. Из каждого разведения в объеме 0,1 мл, что составляет 100,200,400 миллионов микробных тел, вводят кролику в выстриженную или депилированную накануне кожу. На одном кролике можно одновременно поставить до 8 внутрикожных проб. Ежедневно отмечают проявления дермонекротической реакции, а окончательно на 4-е сутки. За минимальную дермонекротическую дозу принимают то наименьшее количество культуры, которое дает некроз на 4-е сутки (Г. В. Выгодчиков, 1963) . Список использованной литературы 1 А. М. Смирнова, А. А. Трояшкин, Е. М. Падерина: микробиология и профилактика стафилококковых инфекций – “Медицина” , 1977. 2 Стафилококков
|