АЛЛEРГИЯ АСТМА И КЛИНИЧEСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ М 2000 107 С 3

49. Shmakov A., Trufakin V. e.a. // Epithelial Cell Biology. - 1996. - N 4. - P. 104-112.

ИММУНОФИЗИОЛОГИЯ -
ИСТОКИ И СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ РАЗВИТИЯ
Корнева Е.А.
Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

Реализация нейро-иммуно-взаимодействий осуществляется непосредственно на мембранах иммуноцитов и в ЦНС. Исследовали экспрессию генов c-fos и интерлейкина-2 (ИЛ-2) в клетках головного мозга крыс при ротационном стрессе (РС) или введении столбнячного анатоксина (ТТ). с-fos и ИЛ-2 мРНК измеряли методом spot- и in situ гибридизации с меченой дигоксигенином соответствующей кДНК. Индукция синтеза с-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках головного мозга была выявлена в латеральном гипоталамическом поле, таламусе и сенсо-моторной зоне коры через 2 часа после РС. Анализ экспрессии c-fos и ИЛ-2 мРНК в гипоталамических структурах головного мозга крыс выявил активацию нейронов в заднем, латеральном и переднем гипоталамических полях, а также - в дорсомедиальном, вентрамедиальном и паравентрикулярном ядрах гипоталамуса. Синтез ИЛ-2 мРНК наблюдался в более поздние сроки, нежели синтез c-fos РНК. Индукция синтеза c-fos мРНК приводила к появлению c-Fos-подобных белков в аналогичных структурах гипоталамуса и в те же, что и для c-fos мРНК сроки.
Таким образом, показаны конкретные молекулярно-генетические механизмы. являющиеся общими для реализации ответной реакции нейрональных клеток на стрессорный или антигенный стимул

Термин - иммунофизиология - был предложен, как синоним появившихся за рубежом понятий - иммуномодуляция и психонейроиммунология. Впервые он упоминается в дискуссии по поводу предложенного Хербертом Спектором названия Международного научного общества ("Нейроиммуномодуляция") в 1985 году.
Предлагая этот термин, мы использовали его для определения круга исследований, направленных на изучение механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем в самых разных вариантах проявления этих взаимодействий: не только изучения влияния нервной системы на иммунную, но и роли иммунной системы или сигналов, приходящих от иммунной системы, в функциях нервной системы.
Основы иммунофизиологии были заложены в конце прошлого века российскими исследователями - Савченко И.Г. [1], а затем и Лондоном Е.С. [2], показавшими, что при удалении определенных областей мозга или перерезке проводящих путей у животных изменяется течение инфекционных заболеваний и чувствительность к возбудителям инфекционного процесса.
Однако, проблема возможной связи функций нервной системы и активности защитных процессов в организме была поставлена намного позже и эта заслуга принадлежит также российскому исследователю С. Метальникову [3], который, будучи учеником И.П. Павлова и выросший на свойственных российской физиологической школе идеях нервизма, впервые поставил этот вопрос и попытался ответить на него экспериментально. Именно С. Метальников официально признан основателем иммунофизиологии (нейроиммуномодуляции) и медаль его имени является наградой Международного научного общества по Нейроиммуномодуляции.
Дальнейшее развитие иммунофизиологии так же в большой мере связано с работами отечественных исследователей - Сперанского А.Д. [4], Адо А.Д. [5], Здродовского П.Ф. [6], которые в разных вариантах продемонстрировали экспериментально необходимость целостности нейроэндокринного аппарата регуляции для осуществления полноценной работы имммунной системы. В эти годы появились и единичные исследования по данной проблеме за рубежом [7, 8].
Важным этапом в развитии проблемы явилось изучение роли строго определенных структур мозга в модуляции интенсивности иммунного ответа [9]. Впервые в условиях строгого нейрофизиологического эксперимента и гистологического контроля локализации повреждений мозга были показаны эффекты повреждения определенных структур гипоталамуса на динамику и интенсивность формирования иммунного ответа при использовании максимально чувствительных и строгих для того времени тестов определения уровня антигена и антител в крови. Хотя к этому времени в мире уже появились исследования, принципиально доказывающие роль центральной нервной системы в модуляции функций иммунной системы [10].
Первый Симпозиум, собравший исследователей различных стран мира для обсуждения проблем иммунофизиологии, прошел в Ленинграде в 1975 году. На этом Симпозиуме впервые встретились такие известные специалисты как: R. Ader, H. Besedovsky, B. Jankovic, V.Pierpaoli, G. Solomon, N. Spector. Именно они в последующем и явились организаторами двух Международных научных обществ - по Нейроиммуномодуляции и Психонейроиммунологии и двух журналов по данной проблеме - "Brain, behavior and immunity" и "Neuroimmunomodulation" и в течение длительного времени являлись лидерами этого научного направления. Позднее над этой проблемой работали многие специалисты [11, 12].
В настоящее время исследования в области иммунофизиологии, привлекают внимание многочисленных специалистов во всех развитых странах мира, и можно было бы назвать три основные линии этих исследований:
* Изучение молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем.
* Изучение эффектов влияния иммунной системы, в том числе цитокинов, на функции нервной системы.
* Клиническая аппликация нейроиммуномодулирующих приемов в целях профилактики и лечения заболеваний различной природы.
В настоящей работе речь пойдет лишь об одном из примеров использования современных подходов для анализа механизмов взаимодействия нервной и иммунной систем, а именно, исследовании экспрессии c-fos и IL-2 генов в клетках иммунной и нервной систем при действии раздражителей различной природы - антигенного и неантигенного характера.
Применение методов молекулярно-биологического анализа позволяет оценить механизмы нейро-иммуного взаимодействия на уровне экспрессии генов, исследуя процессы реализации реакций нейрональных или иммунокомпетентных клеток на определенный информационный сигнал. При этом особое значение приобретает наличие специфического маркера, отражающего изменения метаболизма клетки. К таким маркерам можно отнести белки c-Fos и интерлейкин-2 (ИЛ-2). Первый является продуктом протоонкогена c-fos и выполняет функцию ростового фактора, формируя комплексы с белками- транс-факторами (AP-1, NF-AT) ряда индуцибельных генов, в том числе и гена ИЛ-2 [13]. Из литературы известно, что индукция синтеза белкового продукта гена с-fos в нейрональных клетках происходит под влиянием самых разнообразных стимулов неантигенного характера [14-16].
В настоящее время известно, что ИЛ-2 и его рецепторные структуры присутствуют не только в лимфоидных клетках, но и в клетках головного мозга [17, 18]. Таким образом, экспрессия гена ИЛ-2 может отражать степень активации клеток иммунной и нервной систем, равно как и экспрессия гена c-fos может отражать активацию не только нейрональных клеток, но и клеток лимфоидного ряда, где также происходит синтез c-Fos белка [15].

Влияние ротационного стресса на экспрессию генов с-fos и ИЛ-2
в клетках головного мозга крыс

По данным литературы, слабый ротационный стресс, в противоположность иммобилизационному, стимулирует активность иммунной системы [19]. В исследованиях по влиянию ротационного стресса на экспрессию генов немедленного (c-fos) и раннего (ИЛ-2) ответа в лимфоцитах селезенки мышей, подвергнутых pотационному стpессу, в нашей предыдущей работе была показана стимуляция синтеза с-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК [20, 21].
Представляло интерес выяснить - происходят ли изменения экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 под влиянием неантигенного стимула в клетках нервной системы, какие структуры головного мозга реагируют в ответ на стресс, какова динамика реализации этих реакций во времени, происходит ли экспрессия гена ИЛ-2 под действием стресса в головном мозгу и, наконец, имеет ли место при этом корреляция процессов активации генов c-fos и ИЛ-2.
Присутствие ИЛ-2 в клетках головного мозга дает возможность проследить влияние pотационного стpесса ( крысы линии Wistar, самцы, 200 г весом, в ротационной установке при 78 об. /мин., 4 раза по 10 мин. с интервалом в 5 мин) на экспpессию обоих генов по индукции синтеза с-fos мPНК и ИЛ-2 мPНК в различных стpуктуpах головного мозга. Известно, что синтез c-fos мРНК начинается в нейрональной клетке уже через 5 мин после применения стимула, и достигает максимума к 90 минутам, после чего происходит снижение активности гена [ 15 ]. Однако, через 2-4 ч экспрессия протоонкогена в активированной клетке еще продолжается. Вместе с тем, ИЛ-2 мРНК экспрессируется (как это было показано на Т лимфоцитах) [22], не ранее, чем через 2 ч после воздействия индуктора. Поэтому, для анализа синтеза мPНК обоих генов в клетках головного мозга одного и того же животного, был выбpан общий сpок забоpа ткани и пpиготовления сpезов, а именно, 4 ч после стpессоpного воздействия. Содержание с-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК в клетках ткани головного мозга определяли методом гибридизации in situ мРНК- Dig- кДНК на срезах головного мозга и подсчитывали количество Dig -меченых клеток, содержащих мРНК, на единицу площади среза (0.2 мм2). Анализ экспрессии гена с-fos в клетках ткани головного мозга крыс показал, что ротационный стресс повышает количество содержащих с-fos мРНК клеток в гипоталамических структурах в 10 раз, в таламических - в 4 раза и в сенсо-моторной зоне коры головного мозга - в 2,5 раза через 2-4 ч после воздействия (рис. 1). У интактных животных во всех перечисленных структурах мозга выявлялись единичные c-fos мРНК содержащие клетки.

Рис.1. Количество клеток, продуцирующих c-fos мРНК и ИЛ-2 мРНК, в структурах головного мозга крыс через 2 часа после ротационного стресса (на единицу площади - 0.2 мм2)
По оси абсцисс - структуры головного мозга: 1 - LHA, 2 - cortex, 3 - thalamus
По оси ординат - количество c-fos мРНК - или ИЛ-2 мРНК - позитивных клеток
* - Р < 0. 05; ** - P < 0.01 ( по отношению к контролю)

Параллельно в тех же структурах головного мозга исследовали экспрессию гена ИЛ-2 после ротационного стресса. Содержание ИЛ-2 мРНК в клетках мозга контрольных животных, не подвергавшихся стрессорному воздействию, либо крайне низко (единичные клетки), либо ИЛ-2 мРНК вообще не обнаруживается. Через 2 часа после ротационного стресса количество ИЛ-2 мРНК-содержащих клеток во всех исследуемых структурах головного мозга повышалось в 2-3 раза. Наиболее интенсивная экспрессия обоих генов при стрессе происходила в латеральном гипоталамическом поле (LHA) и коре головного мозга. Меченые клетки выявлены также и в таламусе, причем, если в таламусе ИЛ-2 мРНК обнаруживается только через 4 часа после стрессорного воздействия, то в коре головного мозга индукция синтеза ИЛ-2 мРНК была отмечена уже через час (более 70 клеток/ 0.2 мм2 среза).
Сравнение полученных данных по анализу экспрессии гена с-fos и гена ИЛ-2 в клетках головного мозга крыс позволяет заключить, что содержание с-fos мРНК у контрольных животных значительно превышает содержание ИЛ-2 мРНК, и, что влияние ротационного стресса более выражено в отношении активации экспрессии гена с-fos, чем экспрессии гена ИЛ-2.
В настоящей работе проводили также анализ пространственно-временных параметров процесса реализации реакции клеток гипоталамуса в ответ на введение антигена (столбнячного анатоксина) на основе исследования экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 (крысы - самцы линии Sprague-Dawley весом 275-300 грамм). В качестве антигена использовали нетоксичный столбнячный анатоксин, который вводили в хвостовую вену (в/в) крысы в количестве 200 мг/кг (титр антител в сыворотке крови был равен 4). Контролем служил апирогенный физ. р-р. Исследование осуществляли через 30 мин, 2, 6 и 16 ч после введения вещества.
Исследование экспрессии генов c-fos и ИЛ-2 в структурах гипоталамуса проводили по синтезу мРНК, а также иммунохимическим методом определяли синтез c-Fos-подобного белка в заднем (PHA), переднем (AHA) гипоталамических полях, LHA, дорсомедиальнмо (DMH) вентромедиальном (VMH), супраоптическом (SO), паравентрикулярном (PVN) и аркуатном (Arc) ядрах.

Рис.2. Микрофотография срезов VMH головного мозга крысы с c-fos мРНК-позитивными клетками у интактных животных (B) и после введения физ. р-ра или столбнячного анатоксина через 2 ч (С, D) и 6 ч (E, F), соответственно. А - (уровень среза мозга - 28, согласно картам мозга крысы по атласу Swanson'a [24]

Экспрессия c-fos и ИЛ-2 мРНК в клетках гипоталамических структур крыс
после введения антигена

У интактных животных интенсивность синтеза c-fos мРНК определяется на весьма низком уровне (единичные c-fos мРНК-позитивные клетки). Введение физ. р-ра несколько повышает количество c-fos-позитивных клеток в таких структурах как LHA, DMH и VMH через 2-6 ч после иньекции. Через 30 мин после введения столбнячного анатоксина наблюдалась тенденция к увеличению количества c-fos мРНК-продуцирующих клеток по сравнению с реакцией на введение физ. р-ра. Введение столбнячного анатоксина через 2 ч индуцировало синтез c-fos мРНК в PHA, LHA, AHA, DMH, VMH и PVN, причем, для PHA (36?12 клеток), LHA (51?17) и DMH (41?7) максимум изменений отмечался через 2 ч после введения антигена. К 6 ч происходило снижение индукции экспрессии с-fos гена и к 16 ч c-fos мРНК-позитивные клетки в исследуемых структурах встречались в единичном количестве. Исключение составляли такие структуры как AHA (27?2 клеток), VMH (15?4) и PVN (22?2), где максимальное количество клеток обнаруживалось к 6 часам после введения столбнячного анатоксина. Анализ распределения c-fos мРНК меченых клеток в Arc и SO ядрах гипоталамуса не выявил достоверных различий между эффектами действия антигена и физ. р-ра в отношении индукции синтеза c-fos мРНК. Микрофотография (рис. 2) представляет срез VMH, содержащий c-fos мРНК-позитивные клетки после инъекции физ. р-ра или столбнячного антигена.
Различие в степени индукции синтеза c-fos мРНК и времени ее реализации после иньекции физ. р-ра или столбнячного анатоксина можно видеть на рис. 3, где приведены результаты анализа активации нейрональных клеток в PHA, LHA и AHA гипоталамуса.
Анализ экспрессии гена ИЛ-2 в клетках гипоталамуса позволил выявить индукцию синтеза ИЛ-2 мРНК под действием анатоксина в тех же структурах гипоталамуса, в которых была отмечена индукция синтеза c-fos мРНК. В качестве примера приведена микрофотография, демонстрирующая синтез ИЛ-2 мРНК в вентрамедиальном ядре гипоталамуса (рис. 4).

Экспрессия c-fos -подобного белка в клетках гипоталамических структур крыс
после внутривенного введения антигена

Как известно, синтез c-fos мРНК не всегда заканчивается синтезом белка c-Fos. Вместе с тем, именно c-Fos-белок принимает участие в регуляции экспрессии ряда индуцибельных генов, в частности, генов, кодирующих структуру цитокинов, играющих важную роль в обеспечении функциональной активности иммунной системы.
Поэтому представляло интерес проследить корреляцию процесса транскрипции гена c-fos и процессов трансляции c-fos мРНК в исследуемых структурах гипоталамуса. Иммунохимический анализ синтеза c-Fos-подобного белка после введения животным антигена показал, что индукция синтеза c-Fos- подобного белка происходит в тех же структурах гипоталамуса, что и c-fos мРНК, однако, менее интенсивно. Так, максимальное количество c-Fos-позитивных клеток при введении столбнячного анатоксина наблюдали в PHA (20?13 клеток) и VMH (25?13), в то время как максимальная индукция c-fos мРНК была отмечена в PHA (36?12 клеток), LHA (51?17) и DMH (41?7). Наиболее интенсивный синтез c-Fos -подобного белка, как и синтез c-fos мРНК, был зафиксирован через 2 ч после введения антигена, и также, как и при анализе количества меченых клеток, содержащих гибрид c-fos мРНК-c-fos кДНК, в таких структурах гипоталамуса как AHA и PVN наблюдали усиление синтеза c-Fos-подобного белка через 6 ч после иньекции антигена.
На микрофотографии (рис. 5) в качестве примера, иллюстрирующего индукцию Dig*-c-fos мРНК-меченых или c-Fos-иммунореактивных клеток, приведен срез VMH с клетками, содержащими c-fos мРНК- и c-Fos-подобные белки, через 2 и 6 ч после в/в введения апирогенного физ. р-ра или столбнячного анатоксина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, анализ экспрессии генов немедленного - c-fos- и раннего - ИЛ-2 - ответа позволил впервые установить, что эффекты использованных неантигенных и антигенных стимулов реализуются на генном уровне как в иммунной [20], так и в нервной системах.
Изложенные факты еще раз подчеркивают общность молекулярно-биологических механизмов, работающих в нервной и иммунной системах на уровне реализации стресс или антиген -индуцированных реакций.
Как следует из приведенных материалов, в настоящее время начато исследование достаточно нового и важного аспекта иммунофизиологии, а именно, исследование экспрессии генов цитокинов и их трансактивирующих факторов в головном мозгу и их роли в его работе. На этом пути сделаны лишь первые шаги, но уже сейчас ясно, что практически весь спектр цитокинов представлен в мозгу, и многие из них экспрессируются не только глиальными клетками, но и нейронами. Частично показано их участие в развитии регуляторных процессов. Применение двух способов тестирования экспрессии гена по синтезу мРНК и белка позволяет судить, с одной стороны, о наиболее ранних проявлениях реакции на стресс или антиген в структурах головного мозга на генном уровне, а с другой стороны, - о процессе реализации полученного информационного сигнала в виде конечного продукта экспрессии гена - кодируемого им белка.
Выбор гипоталамуса для анализа реакций клеток мозга на неантигенный или антигенный стимул в различных его структурах во временном диапазоне обусловлен тем, что, именно гипоталамус является областью мозга, регулирующей вегетативные функции: водно-солевой обмен, уровень температуры тела и другие физиологически значимые процессы [23]. В гипоталамуса происходят нейросекреторные процессы (продукция нейропептидов, стероидных и пептидных гормонов). Различные зоны гипоталамуса активируются под влиянием стресса. Поэтому, для изучения механизмов взаимодействия иммунной и нервной систем гипоталамические структуры представляют особый интерес.
Проведенные исследования позволили показать существование тесной связи между механизмами активации клеток иммунной и нервной системами на генном уровне; определить пространственно-временные характеристики активации структур гипоталамуса крыс, участвующих в процессах реализации реакции на неантигенный и антигенный стимулы на уровне экспрессии генов немедленного и раннего ответа : c-fos и ИЛ-2.
А

В

Рис. 4. Микрофотография срезов VMH головного мозга крысы с ИЛ-2 мРНК-позитивными клетками у интактных животных (B) и после введения физ. р-ра или столбнячного анатоксина через 2 ч (С, D) и 6 ч (E, F), соответственно. А - (уровень среза мозга - 28, согласно картам мозга крысы по атласу Swanson'a).

<< Пред. стр. 3 (из 8) След. >>

Список литературы по разделу