<< Пред.           стр. 3 (из 7)           След. >>

Список литературы по разделу

  0,000027
  количество ДНК на клетку
  0,009
  количество ДНК на гаплоидную клетку
  0,027
  0,017
  количество ДНК на диплоидную клетку
  1,4
  15,4
  134,2
 
  0,2
  12,0
 
  3,2
  100,0
 
  73,0
  108,0
 
  5,0
 
  2,3
 
  5,0
  6,0
  Разрешить эти вопросы оказалось возможным на основании изучения кинетики реакции ренатурации или гибридизации ДНК. Если фрагментированные молекулы ДНК в растворах подвергнуть тепловой денатурации, а затем инкубировать их при температуре несколько более низкой, чем та, при которой происходит денатурация, то идет восстановление исходной двуспиральной структуры фрагментов ДНК за счет воссоединения комплементарных цепей - ренатурация. Для ДНК вирусов и прокариотических клеток было показано, что скорость такой ренатурации прямо зависит от величины генома; чем больше геном, чем больше количество ДНК на частицу или клетку, тем больше нужно времени для случайного сближения комплементарных цепей и специфической реассоциации большего числа разных по нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (рис. 53). Характер кривой реассоциации ДНК прокариотических клеток указывает на отсутствие повторяющихся последовательностей оснований в геноме прокариот; все участки их ДНК несут уникальные последовательности, число и разнообразие которых отражает степень сложности генетической композиции объектов и, следовательно, их общей биологической организации.
  Совсем другая картина реассоциации ДНК наблюдается у эукариотических организмов. Оказалось, что в состав их ДНК входят фракции, которые ренатурируют с гораздо более высокой скоростью, чем можно было бы предполагать на основании размера их генома, а также фракция ДНК, ренатурирующая медленно, подобно уникальным последовательностям ДНК прокариот. Однако для эукариот требуется значительно большее время для ренатурации этой фракции, что связано с общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных генов.
  В той части ДНК эукариотов, которая отличается высокой скоростью ренатурации, различают две подфракции: 1) фракцию с высоко или часто повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК могут быть повторены 106 раз; 2) фракцию умеренно повторяющихся последовательностей, встречающихся в геноме 102-103 раз. Так, у мыши во фракцию ДНК с часто повторяющимися последовательностями входит 10% от общего количества ДНК на геном и 15% приходится на фракцию с умеренно повторяющимися последовательностями. Остальные 75% от всей ДНК мыши представлены уникальными участками, соответствующими большому числу различных неповторяющихся генов.
  Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и поэтому могут быть выделены в чистом виде, как так называемые фракции сателлитной ДНК. У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК - 1,700 г/мл. Эти различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. Например, у мыши в этой фракции имеется 35% Г и Ц пар, а в основном пике ДНК - 42%.
  Как оказалось, сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе основных типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан был на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК, иРНК, рРНК) не гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК нет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК, т.е. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК, не участвуют в транскрипции.
  Существует гипотеза о том, что высокоповторяющиеся последовательности, не участвующие непосредственно в синтезе белков, могут нести информацию, играющую важную структурную роль в сохранении и функционировании хромосом. К ним могут быть отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра (см. ниже), участки начала репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.
  Методом гибридизации нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ) была изучена локализация этой фракции. Для этого на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченую 3Н-уридином РНК. Затем цитологический препарат с хромосомами подвергали такой обработке, при которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура, щелочная среда и др.). После этого на препарат помещали меченную 3Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически было обнаружено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обнаруживалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).
  За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК, особенно у дрожжевых клеток. Так у S. cerevisiae центромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она состоит из двух консервативных участков (I и III) и центрального элемента (II), обогащенного АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфоидная сателлитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.н., организованных в группы димеров или пентамеров, которые в свою очередь образуют большие последовательности по 1-6 х 103 п.н. Такая самая большая единица повторена 100-1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК комплексируются особые центромерные белки, участвующие в образовании кинетохора, структуры, обеспечивающей связь хромосом с микротрубочками веретена и в движении хромосом в анафазе (см. ниже).
  ДНК с высокоповторяющимися последовательностями обнаружена также в теломерных участках хромосом многих эукариотических организмов (от дрожжей до человека). Здесь чаще всего встречаются повторы, в которые входят 3-4 гуаниновых нуклеотида. У человека теломеры содержат 500-3000 повторов TTAGGG. Эти участки ДНК выполняют особую роль - ограничивать хромосому с концов и предотвращать ее укорачивание в процессе многократной репликации.
  Недавно было найдено, что высокоповторяющиеся последовательности ДНК интерфазных хромосом связываются специфически с белками - ламинами, подстилающими ядерную оболочку, и участвуют в заякоревании растянутых деконденсированных интерфазных хромосом, тем самым определяют порядок в локализации хромосом в объеме интерфазного ядра.
  Сделано предположение, что сателлитная ДНК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК, например между репликонами (см. ниже).
  Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, которые могут быть повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями. Такими являются гены для белков хроматина - гистонов, повторяющихся до 400 раз.
  Кроме того, в эту фракцию входят участки ДНК с разными последовательностями (по 100-400 нуклеотидных пар), также многократно повторенными, но рассеянными по всему геному. Их роль еще не до конца ясна. Высказывается предположение, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.
  Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (> 106 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.
  Исходя из этих представлений становятся понятными те различия в количестве ДНК, которые наблюдаются у разных организмов: они могут быть связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так, например, у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до 80% от всей ДНК, у луков - до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной, нефрагментированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно и часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную цепь ДНК.
  Молекулы ДНК гетерогенны не только по участкам разной нуклеотидной последовательности, но и различны в отношении их синтетической активности.
  Репликация эукариотических ДНК
  Бактериальная хромосома реплицируется как одна структурная единица, имеющая одну стартовую точку репликации и одну точку терминации. Таким образом бактериальная циклическая ДНК является одним репликоном. От стартовой точки репликация идет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон репликационными вилками, что хорошо видн при электронномикроскопическом изучении вирусных и бактериальных реплицирующихся хромосом.
  У эукариотических клеток организация репликации иного характера - полирепликоннная.. Как уже говорилось, при импульсном включении 3НТ множественная метка появляется практически во всехмитотических хромосомах. Это означает, что одновременно в интерфазной хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радиоавтографии меченых молекул, выделенных ДНК (рис. 55).Если клетки были импульсно мечены 3НТ, то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК, которые успели реплицироваться, а между ними расположены участки нереплицированной ДНК, которая не оставила радиоавтографа и поэтому остается невидимой. По мере увеличения времени контакта 3НТ с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментв можно точно рассчитать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения репликационной вилки оказалась равной 1-3 т.п.н. в мин у млекопитающих, около 1 т.п.н. в мин у некоторых растений, что намного ниже скорости репликации ДНК у бактерий (50 т.п.н. в мин.). В этих же экспериментах была прямо доказана полирепликонная структура ДНК хромосом эукариот: по длине хромосомной ДНК, вдоль нее, располагается множество независимых участков репликации - репликонов. По расстоянию между средними точками смежных метящихся репликонов, т.е. по расстоянию между двумя соседними стартовыми точками репликации, можно узнать величину отдельных репликонов. В среднем величина репликонову высших животных составляет около 30 мкм или 100 т.п.н. Следовательно, в гаплоидном наборе млекопитающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше, около 40 т.п.н. Так у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей - 400. Как говорилось, синтез ДНК в репликоне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается радиоавтографически: если клеткам после импульсной метки дать продолжить синтезировать ДНК некоторое время в среде без 3НТ, то произойдет падение включения его в ДНК, будет происходить как бы разбавление метки, и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстановленного серебра.
  Реплицирующиеся концы или вилки в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терминальной точке, общей для соседних репликонов). В этом месте реплицированные участки соседних репликонов объединяются в единые ковалентные цепи двух новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное подразделение ДНК хромосом на репликоны совпадает со структурным подразделением ДНК на домены или петли, основания которых, как уже упоминалось, скреплены белковыми связками.
  Таким образом весь синтез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счет независимого синтеза на множестве отдельных репликонов, с последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении синтеза ДНК у бактерий и эукариот. Так бактериальная монорепликонная хромосома длиной в 1600 мкм синтезируется со скоростью около получаса. Если бы сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитающих реплицировалась тоже как монорепликонная структура, то на это ушло бы около недели (6 суток). Но если в такой хромосоме расположено несколько сот репликонов, то для полной ее репликации понадобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов. Это связано с тем, что не все репликоны отдельной хромосомы включаются одновременно.
  В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала репликации, что дает возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так известно, что при дроблении яиц шпорцевых лягушек Xenopus laevis синтез ДНК занимает всего 20 минут, тогда как в культуре соматических клеток этот процесс продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК в ядре занимает 3,5 минуты, а в клетках культуры ткани - 600 минут. При этом в клетках культуры величина репликонов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.
  Синтез ДНК по длине отдельной хромосомы происходит неравномерно. Было обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные репликоны собраны в группы, репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Это следовало из анализа радиоавтографов ДНК, где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков или кластеров репликонов или репликационных единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина - 5'-бромдезоксиуридина (BrdU). Включение BrdU в интерфазный хроматин приводит к тому, что во время митоза, участки с BrdU конденсируются в меньшей степени (недостаточная конденсация), чем те участки, где включался тимидин. Поэтому те участки митотических хромосом в которые включился BrdU, будут слабо окрашиваться при дифференциальной окраске. Это позволяет на синхронизированных культурах клеток выяснить последовательность включения BrdU, т.е. последовательность синтеза ДНК по длине одной взятой хромосомы. Оказалось, что происходит включение предшественника в большие участки хромосомы. Включение разных участков происходит строго последовательно в течение S-периода. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации по своей длине, имеет свой специфический рисунок репликации.
  Кластеры репликонов, объединенные в репликационные единицы, связаны с белками ядерного матрикса (см. ниже), которые вместе с ферментами репликации образуют т.н. кластеросомы - зоны в интерфазном ядре, в которых идет синтез ДНК.
  Порядок, в котором активируются репликационные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках. Так, например, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи центромеры) реплицируются обычно в конце S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (например, X-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с рисунком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к ранореплицирующимся, G-сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-сегменты (центромера) - места самой поздней репликации.
  Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различно, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе не беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.
  Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S-периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4-5).
  Таким образом, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-периода. Но при этом происходит последовательное и асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также тем, что существует строгая последовательность появления в ходе S-периода пиков чувствительности определенных генов к мутагенам.
  Основные белки хроматина - гистоны
  Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом достаточно ясна: хранение и реализация генетической информации. Однако для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы как синтеза РНК, так и редупликации ДНК В интерфазном ядре концентрация ДНК достигает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДНК, которая локализуется в сферическом ядре со средним диаметром около 10 мкм. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна как-то быть уложена с коэффициентом упаковки 1 х 103--1 х 104. И при этом в ядре должен сохраниться определенный порядок в расположении частично или полностью деконденсированных хромосом. И кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требования не могут быть осуществлены в бесструктурной, хаотической системе.
  В клеточном ядре ведущую роль в организации расположения ДНК, в ее компактизации и в регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками, дезоксирибонуклеопротеин (ДНП), где на долю белков приходится около 60% от сухого веса. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на две группы: гистоны и негистоновые белки. На долю гистонов приходится до 80% от всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счет солевых или ионных связей и неспецифично в отношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5-7 типов молекул гистонов. В отличие от гистонов, т.н. негистоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК, очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу (несколько сот), велико разнообразие функций, которые они выполняют.
  Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса, в виде субъединиц или нуклеосом. До этого считалось, что ДНК равномерно покрыта этими белками, связь которых с ДНК определяется свойствами гистонов.
  Гистоны - белки характерные только для хроматина, обладают рядом особых качеств. Это основные или щелочные белки, свойства которых определяются относительно высоким содержанием таких основных аминокислот как лизин и аргинин. Именно положительные заряды на аминогруппах лизина и аргинина обусловливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах ДНК. Эта связь достаточно лабильна, легко нарушается, в этом случае может происходить диссоциация ДНП на ДНК и гистоны. Поэтому хроматин, дезоксирибонуклеопротеин или ще как называли раньше, нуклеогистон, является сложным нуклеиново-белковым комплексом, в который входят линейные высокополимерные молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн. копий каждого типа гистонов на ядро).
  Гистоны - наиболее хорошо биохимически изученные белки (см. табл. 5).
  Таблица 5. Общие свойства гистонов млекопитающих
 
 Гистон
 Мол. вес Основные аминокислоты, % Кислые аминокислоты, % Отношение основных аминокислот к кислым
 Лизин
 Аргинин H1
 H2A
 H2B
 H3
 H4 23 000
 13 960
 13 770
 15 340
 11 280 29
 11
 16
 10
 11 1
 9
 6
 13
 14 5
 15
 13
 13
 10 5,4
 1,4
 1,7
 1,8
 2,5
 
  Гистоны - относительно небольшие по молекулярной массе белки. Эти белки практически у всех эукариот обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга по содержанию разных основных аминокислот. Так гистоны H3 и H4 относят к аргинин-богатым, из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов как корова и горох (всего две аминокислотных замены).
  Два других гистона H2A и H2B относятся к умеренно обогащенным лизином белкам. У различных объектов внутри этих групп гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.
  Гистон H1, представляет собой не уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации. Однако их общим свойством является обогащенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.
  Для гистонов всех классов (особенно для H1) характерно кластерное распределение основных аминокислот, лизина и аргинина, на N- и C-концах молекул. Срединные участки молекул гистонов образуют несколько (3-4) ?-спиральных участка, которые компактизуются в глобулярную структуру в изотонических условиях (рис. 56). По-видимому, богатые положительными зарядами неспирализованные концы белковых молекул гистонов и осуществляют их связь друг с другом и с ДНК.
  У гистона H1 наиболее вариабельным является N-конец, осуществляющий связь с другими гистонами, а C-конец, богатый лизином, взаимодействует с ДНК.
  В процессе жизнедеятельности клеток могут происходить посттрансляционные изменения (модификации) гистонов: ацетилирование и метилирование некоторых остатков лизина, что приводит к потере числа положительных зарядов, и фосфорилирование сериновых остатков, приводящее к появлению отрицательного заряда. Ацетилирование и фосфорилирование гистонов может быть обратимым. Эти модификации значительно меняют свойства гистонов, их способность связываться с ДНК. Так повышенное ацетилирование гистонов предшествует активации генов, а фосфорилирование и дефосфорилирование связаны соответственно с конденсацией и деконденсацией хроматина.
  Гистоны синтезируются в цитоплазме, транспортируются в ядро и связываются с ДНК во время ее репликации в S-периоде, т.е. синтез гистонов и ДНК синхронизированы. При прекращении клеткой синтеза ДНК гистоновые информационные РНК за несколько минут распадаются и синтез гисонов останавливается. Включившиеся в хроматин гистоны очень стабильны, имеют низкую скорость замены.
  Подразделение гистоноы на пять групп и достаточное сходство их внутри каждой группы в целом характерно для эукариот. Однако целый ряд отличий в составе гистонов наблюдается как у высших, так и у низших эукариотических организмов. Так у низших позвоночных вместо H1, характерного для всех тканей этих организмов, в эритроцитах находят гистон H5, который содержит больше аргинина и серина. С другой стороны, наблюдается отсутствие некоторых групп гистонов у ряда эукариот, и в целом ряде случаев полная замена этих белков на другие.
  Гистоноподобные белки были обнаружены в составе вирусов, бактерий, митохондрий. Так, например, у E. coli в клетке в большом количестве обнаруживаются белки (HU и H-NS), по аминокислотному составу напоминающие гистоны.
  Функциональные свойства гистонов
  Широкое распространение гистонов, их сходство даже у очень отдаленных видов, обязательность вхождения их в состав хромосом, все это говорит об их чрезвычайно важной роли в процессе жизнедеятельности клеток. Еще до открытия нуклеосом существовало две взаимодополняющие друг друга группы гипотез о функциональной роли гистонов, о регуляторной и структурной их роли.
  Было обнаружено, что выделенный хроматин при добавлении к нему РНК-полимеразы может быть матрицей для транскрипции, однако активность его составляет всего лишь около 10% от активности, соответствующей активности выделенной чистой ДНК. Эта активность прогрессивно возрастает по мере удаления групп гистонов и может достичь 100% при полном удалении гистонов. Отсюда можно было сделать вывод, что общее содержание гистонов может регулировать уровень транскрипции. Это наблюдение совпадает с тем, что по мере удаления гистонов, особенно H1, происходит прогрессивная деконденсация, разворачивание фибрилл ДНП, что возможно облегчает взаимодействие РНК-полимеразы с матричной ДНК. Так же было обнаружено, что модификация гистонов приводит к усилению транскрипции и одновременной декомпактизации хроматина. Следовательно, напрашивается вывод о том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет на степень компактности и активности хроматина. Однако оставался открытым вопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках. Этот вопрос до сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторые обобщения: на эту роль могут претендовать те группы гистонов, которые наименее консервативны, такие как H1 или как H2A и H2B, которые могут в значительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства в определенных участках генома.
  Была очевидна и структурная, компактизирующая, роль гистонов в организации хроматина. Так постепенное добавление фракции гистонов к растворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, и наоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина, ведет к его переходу в растворимое состояние. С другой стороны, в цитоплазматических экстрактах ооцитов земноводных или яиц морских ежей, содержащих свободные гистоны, добавление любой ДНК (включая фаговую) привводит к образованию хроматиновых фибрилл (ДНП), длина которых в несколько раз короче исходных ДНК. Эти данные говорят о структурной, компактизирующей роли гистонов. Для того, чтобы огромные сантиметровые молекулы ДНК уложить по длине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров, молекула ДНК должна быть как-то скручена, компактизована с плотностью упаковки равной 1 : 10000. Оказалось, что в процессе компактизации ДНК существуют несколько уровней упаковки, первые из которых прямо определяются взаимодействием гистонов с ДНК.
  Первый уровень компактизации ДНК: структурная роль нуклеосом
  В ранних биохимических и электронномикроскопических работах было показано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата.
  На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллы толщиной 30 нм. Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы и приемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК и гистонов в хроматиновых фибриллах.
  Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разными способами нуклеосом - дискретных частиц хроматина. Так при осаждении на подложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочных условиях при низкой ионной силе, можно было видеть, что нити хроматина представляли собой что-то, напоминающее "бусы на нитке": небольшие, около 10 нм, глобулы, связанные друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм (рис. 57, 58). Эти наблюдения совпадали с результатами фракционирования хроматина после частичного нуклеазного переваривания.
  Было найдено, что если подвергнуть действию нуклеазы микрококков выделенный хроматин, то он подвергается распаду на регулярно повторяющиеся структуры. Так ДНК, полученная из хроматина, обработанного нуклеазой, состояла из серии отрезков, кратных 200 парам оснований; встречались отрезки в 200, 400, 600, 800 и больше пар нуклеотидов (п.н.). Это говорит о том, что нуклеазной атаке в составе хроматина подвергаются участки ДНК, расположенные примерно через каждые 200 п.н. При этом в кислоторастворимую фракцию (низкополимерная) ДНК уходит всего 2% ядерной ДНК. Кроме того после такой нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования удается выделить фракцию частиц со скоростью седиментации 11S (S - единица Сведберга, определяющая скорость седиментации частиц, равна 1 х 10-13 с), а также частицы кратного этой величине размера: димеры, тримеры, тетрамеры и т.д. Оказалось, что частицы 11S содержат ДНК около 200 п.н. и восемь гистонов (октамер) по две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и одну копию гистона H1. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила название нуклеосомы. Более подробный анализ этой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом: октамер гистонов образует белковую основу-сердцевину (от англ. core, часто в нашей литературе этот термин используется без перевода: кор, коровая частица), по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая 1,75 оборота; остальные 54 п.н. ДНК образуют участок, несвязанный с белками сердцевины - линкер, который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Гистон H1 связывается частично с основной, сердцевиной и с участком линкера (около 30 п.н.). Следовательно, полная нуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.н.- сердцевина, 30 п.н. - участок линкера в комплексе с гистоном H1, 30 п.н. - свободная ДНК), октамер сердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона H1 (рис. 59). Молекулярная масса полной нуклеосомы - 262000 Да. Рассчитано, что на весь гаплоидный геном человека (3 х 109 пар оснований) приходится 1,5 х 107 нуклеосом.
  Сердцевина или коровая частица (или минимальная нуклеосома) очень консервативны по своей структуре: они всегда содержат 146 п.н. ДНК и октамер гистонов. Линкерный участок может значительно варьировать (от 8 до 114 п.н. на нуклеосому).
  Используя метод рассеяния нейтронов удалось установить форму и точные размеры нуклеосом. При грубом приближении - это плоский цилиндр или шайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке для электронного микроскопирования они образуют "бусины", глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДНК. На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки, остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по периферии гистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в рэгби, в состав которого входит тетрамер (H3 * H4)2 и два независимых димера H2A * H2B. На рис. 60 представлена схема расположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.
  В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен, а продолжая спираль ДНК на поверхности нуклеосомной частицы,связывает соседние нуклеосомы так, что образуется как бы сплошная нить, толщиной около 10 нм, состоящая из тесно расположенных нуклеосом (рис. 61). При этом за счет дополнительной спирализации ДНК (1 отрицательный супервиток ДНК на 1 нуклеосому) происходит первичная компактизация ДНК, с плотностью упаковки равной 6-7 (200 п.н. длиной 68 нм, уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почти двух витков ДНК по периферии сердцевин нуклеосомы происходит, как считается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности октамера гистонов с фосфатами ДНК. N- и C-концевые участки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами, вероятно, служат для дополнительной стабилизации структуры нуклеосомы.
  Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компактизации ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулируя последовательность добавления гистонов и ДНК, удалось получить полную реконструкцию нуклеосом. В этом процессе не играет никакой роли источник, откуда была взята ДНК: это может быть ДНК бактерии и даже циклическая ДНК вирусов. Оказалось, что для образования нуклеосом гистон H1 не требуется, он участвует в связывании уже готовых нуклеосом друг с другом и в образовании более высоких уровней компактизации ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоны H3 и H4. При этом вначале ДНК связывается с тетрамером (H3 * H4)2 к которому позжеприсоединяются два димера H2A * H2B. Вероятно, высокая консервативность в строении гистонов H3 и H4 отражает их ведущую структурную роль на первых этапах компактизации ДНК при образовании нуклеосом.
  Нуклеосомы при репликации и транскрипции
  Как же происходит образование нуклеосом при репликации ДНК, какова судьба нуклеосом в вилке репликации, как распределяются новые и старые нуклеосомы или их белки - все эти вопросы еще до конца не разрешены.
  При электронномикроскопическом исследовании реплицирующегося хроматина было обнаружено, что обе новообразованные фибриллы содержат нуклеосомы.
  Если учесть скорость синтеза ДНК эукариот (20 нм в секунду),то новые нуклеосомы при удвоении хромосомных фибрилл должны возникать со скоростью 3-4 сек. Такая высокая скорость образования нуклеосом связана с тем, что в момент синтеза ДНК существует уже пул синтезированных гистонов всех классов, готовых войти в состав нуклеосом. Гистоновые гены, относящиеся к фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК, представлены в виде множественных копий для каждого гистона. Они активируются вместе с началом синтеза ДНК, поэтому по мере продвижения репликационной вилки, новые участки ДНК могут сразу взаимодействовать с новосинтезированными гистонами. Новосинтезированные гистоны и старые гистоны в составе предшествующих нуклеосом не смешиваются при образовании нуклеосом во время репликации ДНК. Вместо этого октамеры гистонов, присутствующие до репликации остаются интактными и переходят на дочерний дуплекс ДНК, в то время как новые гистоны собираются в совершенно новые кор-частицы на свободных от нуклеосом участках ДНК. Старые и новые октамеры гистонов распределяются между дочерними дуплексами ДНК случайным образом.
  Что происходит со старыми нуклеосомами в вилке репликациии ДНК до конца не ясно. Согласно одной из гипотез, каждая из нуклеосом при подходе к ней репликативной вилки как бы расщепляется на две "полунуклеосомы", а нуклеосомная ДНК разворачивается, чтобы дать пройти этот участок ДНК-полимеразе. После этого новосинтезированная цепь ДНК связывается со свободными гистонами, которые есть в избытке в ядре, и образуются новые нуклеосомы на второй цепи ДНК.
  Как уже упоминалось, для активно функционирующих зон хроматина характерно деконденсированное, диффузное,состояние. На этом свойстве хроматина основан один из методов получения фракций активного хроматина, когда с помощью центрифугирования удается осадить конденсированный хроматин из гомогенатов ядер, отделив его тем самым от диффузного хроматина, обладающего высокой транскрипционной активностью. Фракции активного хроматина обладают рядом характерных свойств: повышенной чувствительностью к нуклеазам, повышенным уровнем модификации гистонов (особенно ацетилированием гистона H1), повышенным содержанием некоторых негистоновых белков.
  Биохимические данные показывают, что во время транскрипции часть нуклеосомнвх белков остается связанной с ДНК. Нуклеосомы как частицы видны на хроматиновых фибриллах как до места отхождения транскрипта, так и после него при редкой посадке РНК-полимеразы, фермента вдвое большего, чем нуклеосома. При частой посадке этого фермента (например при транскрипции рибосомных генов, или генов в других активных локусах), частицы РНК-полимеразы располагаются тесно друг к другу и между ними нуклеосомы не видны (рис. 101). Вероятнее всего нуклеосомные белки при прохождении РНК-полимеразы не теряют связи с ДНК, а сама ДНК в составе нуклеосомы разворачивается. Предлагаются два варианта изменения структуры нуклеосом при синтезе РНК. При одном их них нуклеосома "расщепляется" на две полу-нуклеосомы, а ДНК разворачивается; при другом - нуклеосома частично декомпактизируясь, сохраняет тетрамер H3-H4, а два димера H2A-H2B временно отходят, а затем, после прохождения РНК-полимеразы, возвращаются, при этом восстанавливается исходная нуклеосома.
  Второй уровень компактизациии - 30 нм фибрилла
  Таким образом первый, нуклеосомный, уровень компактизации хроматина играет как регуляторную, так и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК приблизительно в 6-7 раз.
  Однако во многих электронномикроскопических исследованиях было показано, что как в митотических хромосомах, так и в интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина с диаметром 30 нм (рис. 57в, 62). Хроматиновые фибриллы такого диаметра были видны как на ультратонких срезах после фиксации глутаровым альдегидом, так и на препаратах выделенного хроматина и выделенных хромосом в растворах, содержащих хотя бы низкие концентрации двухвалентных катионов. Было показано, что 30 нм фибрилла хроматина может обратно менять свой диаметр, становится фибриллой с толщиной 10 нм, если препараты хроматина переводить в деионизованную воду или в растворы, содержащие хелатон ЭДТА. С другой стороны, даже частичная экстракция гистона H1 переводит исходные 30 нм фибриллы хроматина в 10 нм нити, имеющие типичный нуклеосомный уровень организации. При добавлении к ним гистона H1восстанавливается первоначальный диаметр фибрилл.
  Все это говорило о том, что нуклеосомные цепочки хроматина каким-то специфическим образом уложены так, что возникает не хаотическая агрегация нуклеосом, а правильная нитчатая структура с диаметром 30 нм.
  Относительно характера упаковки нуклеосом в составе 30 нм фибриллы хроматина существует, по крайней мере, две точки зрения.
  Одна из них защищает, т.н. соленоидный тип укладки нуклеосом. Согласно этой модели, нить плотно упакованных нуклеосом диаметром 10 нм образует в свою очередь спиральные витки с шагом спирали около 10 нм. На один виток такой суперспирали приходится 6 нуклеосом (рис. 62). В результате такой упаковки возникает фибрилла спирального типа с центральной полостью, которая иногда на негативно окрашенных препаратах бывает видна как узкий "канал" в центре фибриллы. При частичном разворачивании, декомпактизации такой фибриллы и нанесении ее на подложку хорошо видно "зигзагообразное" расположение нуклеосом вдоль фибриллы. Считается, что гистон H1 обеспечивает взаимодействие между соседними нуклеосомами, не только сближая и связывая их друг с другом, но и обеспечивая кооперативную связь нуклеосом так, что образуется довольно плотная спираль из 10 нм фибриллы. Удаление, даже частичное, гистона H1 вызывает переход 30 нм фибриллы в 10 нм фибриллу, а полное удаление его вызывает разворачивание последней в структуру типа "бусин-на-нити". Такой соленоидный тип упаковки ДНК приводит к плотности упаковки равной приблизительно 40 (т.е. на каждый мкм нити приходится 40 мкм ДНК). Эти представления получили подтверждение при анализе структуры хроматина с помощью дифракции рентгеновских лучей и нейтронов. Здесь необходимо отметить, что представление о соленоидном типе укладки получены из анализа вторично конденсированного хроматина. Вначале были получены препараты хроматина в присутствии ЭДТА или выделялись в растворах низкой ионной силы в присутствии ионов магния. Во всех этих случаях первоначально хроматин деконденсировался до уровня "бусин на нити", где отсутствует или дестабилизируется контакт между нуклеосомами.
  Если же исследовать хроматин в составе ядер или в виде выделенных препаратов, но при поддержании определенной концентрации двухвалентных катионов (не ниже 1мМ), то можно видеть дискретность в составе 30 нм фибрилл хроматина: она состоит как бы из сближенных глобул того же размера, из нуклеомеров. В зарубежной литературе такие 30 нм глобулы или нуклеомеры получили название сверхбусин ("супербиды") (рис. 57в, 62). Было обнаружено, что если в условиях, когда нуклеомерная структура фибрилл хроматина сохраняется, препараты хроматина подвергнуть нуклеазной обработке, то часть хроматина растворяется. При этом в раствор выходят частицы, имеющие размер около 30 нм с коэффициентом седиментации равным 45S в растворах, содержащих 1 мМ магния. Если такие выделенные нуклеомеры обработать ЭДТА, удалить ионы магния, то они разворачиваются в нуклеосомные цепочки, содержащие 6-8 нуклеосом. Таким образом, в состав одного нуклеомера входит отрезок ДНК, соответствующий 1600 парам оснований или 8 нуклеосомам.
  Компактность нуклеомера зависит от концентрации ионов магния и наличия гистона H1. Негистоновые белки в конформационных превращениях нуклеомеров не участвуют.
  Таким образом основная 30 нм фибрилла хроматина представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК (рис. 62). Вероятно, что гистоны H1, находясь в центральной зоне этой крупной частицы, взаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность. В пользу этого говорят данные о кооперативном связывании гистонов H1 в группе по 6-8 молекул.
  Противоречие между соленоидной и нуклеомерной моделью упаковки нуклеосом в составе фибрилл хроматина может быть снято, если принять модель нерегулярного соленоида: число нуклеосом на виток спирали не является строго постоянной величиной, что может привести к чередованию участков с большим или меньшим числом нуклеосом на виток.
  Нуклеомерный уровень укладки хроматина обеспечивает 40 кратное уплотнение ДНК, что важно не только для достижения целей компактизации гигантских молекул ДНК. Компактизация ДНК в составе 30 нм фибрилл хроматина может налагать дополнительные функциональные ограничения. Так было обнаружено, что в составе 30 нм фибриллы хроматина ДНК становится практически недоступной для взаимодействия с таким ферментом как метилаза ДНК. Кроме того резко падает способность хроматина связываться с РНК-полимеразой и рядом регуляторных белков. Таким образом второй уровень компактизации ДНК может играть роль фактора, инактивирующего гены.
  В заключении необходимо еще раз напомнить, что как нуклеосомный, так и нуклеомерный (супербидный) уровни компактизации ДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков, которые участвуют не только в образовании нуклеосом, но и в их кооперативном объединении в виде фибрилл ДНП, где ДНК претерпевает дополнительную сверхспирализацию. Все остальные уровни компактизации связаны с дальнейшим характером укладки 30 нм фибрилл в новые компактизационные уровни, где ведущую роль играют негистоновые белки.
  Негистоновые белки
  Негистоновые белки составляют около 20% от всех белков хроматина. По определению, негистоновые белки - это все белки хроматина, кроме гистонов, выделяющиеся с хроматином или хромосомами. Это сборная группа белков, отличающихся друг от друга как по общим свойствам, так и по функциональной значимости. Около 80% из негистоновых белков относится к белкам ядерного матрикса, обнаруживаемых как в составе интерфазных ядер, так и митотических хромосом. Эта группа белков будет отдельно рассмотрена в разделе, посвященном комплексу структур, входящих в состав ядерного матрикса: фиброзный слой или ламина ядерной оболочки и внутренний ядерный матрикс, интерхроматиновая сеть, матрикс ядрышка.
  Во фракцию негистоновых белков может входить около 450 индивидуальных белков с различной молекулярной массой (5-200 кД). Часть этих белков водорастворима, часть растворима в кислых растворах, часть непрочно связана с хроматином и диссоциирует при 0,35 М концентрации солей (3 М NaCI) в присутствии денатурирующих агентов ( 5 М мочевина). Поэтому характеристика и классификация этих белков затруднена, а сами белки еще недостаточно изучены.
  Среди негистоновых белков обнаруживается целый ряд регуляторных белков как стимулирующих инициацию транскрипции, так и ингибирующих ее, обнаружены белки специфически связывающиеся с определенными последовательностями на ДНК. К негистоновым белкам относят также ферменты, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот (ДНК-полимеразы, ДНК-топоизомеразы, метилазы ДНК и РНК, РНК-полимеразы, РНКазы и ДНКазы и т.д.), белков хроматина (протеинкиназы, метилазы, ацетилазы, протеазы и др.) и многие другие.
  Наиболее подробно изучены неистоновые белки т.н. группы с высокой подвижностью (HMG - high mobility group, или "белки Джонса"). Они хорошо экстрагируются в 0,35 М NaCI и 5% HCIO4 и обладают высокой электрофоретической подвижностью (отсюда их название). Основных HMG-белков четыре: HMG-1 (м.в. = 25500), HMG-2 (м.в. = 26000), HMG-14 (м.в. = 100000. HMG-17 (м.в. = 9247). Эта группа наиболее богата представлена среди негистоновых белков: в клетке их около 5% от всего числа гистонов. Особенно часто эти белки встречаются в активном хроматине (примерно 1 молекула HMG-белка на 10 нуклеосом). Белки HMG-1 и HMG-2 не входят в состав нуклеосом, а связываются, видимо с линкерными участками ДНК. Белки HMG-14 и HMG-17 связываются с сердцевинными белками нуклеосом, что обеспечивает, вероятно, изменение уровня компактизации фибрилл ДНП, которые становятся более доступными для взаимодействия с РНК-полимеразой. В этом случае HMG-белки выступают в качестве регуляторов транскрипционной активности. Было обнаружено, что фракция хроматина, обладающая повышенной чувствительностью к ДНКазе I, обогащена HMG-белками.
  Петлевые домены ДНК - третий уровень структурной организации хроматина
  Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов - нуклеосом и 30 нм фибрилл - еще мало что дает для понимания основ трехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе. Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральном характере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для получения реального (1 х 104) уровня уплотнения ДНК. Следовательно должны существовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечном счете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли или домены. Таким образом следующие более высокие уровни компактизации ДНК связаны не с ее дополнительной спирализацией, а с образованием поперечной петлистой структуры, идущей вдоль интерфазной или митотической хромосомы.
  Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариот организована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшим количеством специальных белков.
  Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокруг ядра возникнет т.н. "гало", состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название "нуклеоида" (это только терминологическое сходство с ядерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такого нуклеоида) состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых на периферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основание которых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Тем самым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК, связаны с т.н. "матриксом" или "скэффолдом" - негистоновым белковым остовом интерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этим остовом, имеют особое сродство к негистоновым белкам, их состав изучен, они получили название MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) участков.
  Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca++ ) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н. хромомеры. Если такие хромомеры препаративно выделить, а затем экстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видеть розетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят от центрального плотного участка. Количество петель в такой розетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК.
  Признаки петлевой доменной организации хроматина можно наблюдать с помощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом в солевые растворы низкой ионной силы (0,01 М NaCI) в присутствии низких концентраций двухвалентных катионов ( 1 мМ). В этих условиях не происходит депротеинизации хроматина, он сохраняет свою нормальную химическую композицию, но значительно разрыхляется и представлен стандартными фибриллами толщиной 30 нм. При этом в некоторых местах можно видеть, что отдельные сгустки конденсированного хроматина выявляют особую структуру. Это - розетковидные образования, состоящие из многих петель30 нм фибрилл, соединяющихся в общем плотном центре. Средний размер таких петлистых розеток достигает 100-150 нм. Подобные розетки фибрилл хроматина - хромомеры - можно видеть в ядрах самых разнообразных объектов, животных, растений, простейших (рис. 63).
  Особенно демонстративно такие хромомеры выявляются на тотальных препаратах хроматина из макронуклеусов инфузории Bursaria. В этом случае можно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочка розетковилных структур (рис. 64).
  Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковые участки их не содержат (рис. 65). При деконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia), для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромонемных нитей.
  Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видеть также при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и растений. Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в виде петлистых розетковидных структур, претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компактизации ДНК (рис. 66).
  Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает с размером средних репликонов и может соответствовать одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но и организует функциональные единицы хромосом - репликоны и транскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурно-функциональной организации хроматина, относится к белкам ядерного матрикса.
 Глава 6. Ядерный белковый матрикс
  Общий состав ядерного матрикса
  Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов - хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов или матрикс. Необходимо сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще "ядерным скелетом".
  Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты - нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие "ершика для чистки бутылок" (см. рис. 67).
  Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был предложен термин "ядерный матрикс" для обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные липопротеидные мембраны.
  Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. табл. 6).
  Таблица 6. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения ядерного белкового матрикса
 Обработка Фракция Белок ДНК РНК Фосфолипиды 1.Изолированные
  ядра
 2. 0,2 мМ MgCl2
 3. 2 M NaCl
 4. 1% Тритон Х-
  100
 5.ДНКаза+РНКаза
 N
 LS
 HS
 
 NM
 NPM
 0
 52
 83
 
 90
 90
 0
 75
 97
 
 97
 99
 0
 19
 66
 
 71
 98
 0
 2,5
 6,4
 
 97,8
 98
  Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-HCI буфера и 5 мМ MgCI2помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2 М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1% фосфолипидов.
  Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у различных объектов (см. табл. 7).
  Таблица 7. Состав ядерного белкового матрикса
  Объект Белок ДНК РНК Фосфолипиды Крыса, печень 97 0,1 1,2 1,1
  Клетки HeLa 92,3 1,2 0,05 6,9
  Тетрахимена 97 0,1 1,2 0,5
  По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой - ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и "остаточное" ядрышко (рис. 68).
  Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией "поровый комплекс - ламина" (PCL - "pore complex - lamina"). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.
  Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер. Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.
  Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.
  Наконец, третий компонент ядерного матрикса - остаточное ядрышко - плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.
  Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.
  Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные ядрышки.
  Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.
  Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра - белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов. Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.
  Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.
  Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра даже после удаления ядерных мембран.
  В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов, и вновь полимеризоваться при их дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.
  Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или "скэффолд") практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.
  ДНК ядерного белкового матрикса
  Рассматривая особенности ДНК, входящей в состав ядерного матрикса, необходимо еще раз подчеркнуть, что эта остаточная ДНК представлена в минимальном количестве (0,1-1% от сухого веса фракции) составляет лишь менее 1% от всей ДНК ядра. Эта ДНК оказалась устойчивой к действию нуклеаз, вероятно за счет ее существования в виде прочных ДНК-белковых комплексов.
  Большой интерес представляет изучение фрагментов ДНК, входящих в состав ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах существует от 60000 до 125000 участков ДНК, защищенных от действия нуклеаз и эти участки могут быть расположены на всех трех компонентах ядерного матркса.
  Подробно изучена ДНК ядерного матрикса клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей. Так были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные фрагменты размером около 10 т.п.н., они составляли всего 0,02% от исходного количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор хромосом, т.е. всего2-3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на хромосому. Эти фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и были связаны с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.
  Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.н., представляющих собой, вероятно петли основной массы хроматина (рис. 69). Функциональное значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том, что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при его активации.
  Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено, что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR - matrix attachment regions или SAR - scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н. и располагаются друг от друга на расстоянии 5-112 т.п.н. У дрозофилы на ядро приходится по крайней мере 10 000 таких MAR (или SAR) областей.
  Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомеразой II, которая играет основную структурную и ферментативную роль в образовании петель хроматина. Более того один из белков матрикса ("скэффолда") митотических хромосом, белок Scl оказался просто топоизомеразой II. С помощью иммунофлуоресценции было показано, что на интерфазных хромосомах Scl локализуется в основании петель ДНК.
  При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК. Было обнаружено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку, связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание считать, что на ядерном матриксе происходит инициация и собственно репликация ДНК. Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом, оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса обнаружена ДНК-полимераза ?, основной фермент репликации ДНК. Кроме него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II. Высказана гипотеза о том, что репликация ДНК осуществляется таким образом, что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе репликационные комплексы (рис. 70). Было обнаружено, что участки начала репликации ДНК располагаются вблизи (или совпадают с ними) участков постоянного прикрепления ДНК к ядерному матриксу.
  В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, включающей в себя как гетерогенную высокомолекулярную РНК, так и рибосомную РНК, и РНК ядерных малых РНП. На возможность связи элементов матрикса с процессами транскрипции указывали данные о том, что при коротком мечении матрикс обогащался быстро меченной гетерогенной РНК. Было обнаружено, что в состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II, ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом клеток яйцеводов кур оказалась связанной большая часть (95%) новосинтезированных пре-мРНК овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к заключению, что ядерный матрикс может выполнять структурную роль в синтезе, процессинге и транспорте РНК в ядре.
  С ядерным матриксом связаны собственно транскрибирующиеся гены. Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричной ДНК относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мя РНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе сплайсинга (см. ниже). Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые сплайсосомами, собраны в группы или кластеры, связанные с белками ядерного матрикса.
  Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции транскрипции. Так участки MAR обычно связаны с такими регуляторными последовательностями на ДНК как энхансеры и сайленсеры, определяющими интенсивность транскрипционных процессов. На ядерном матриксе локализованы белки-рецепторы для ряда стероидных гормонов.
  Относительно связи ДНК с элементами ядерного матикса на сегодня сложились представления о том, что эта связь может отражать различные функциональные особенности. Так связь ДНК с ламиной может отражать структурную, постоянную ассоциацию ДНК, а связь с внутренними элементами - функциональную, связанную как с синтезом ДНК, так и РНК,
  Поведение белков ядерного матрикса во время митоза изучено еще далеко недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ее компоненты разбираются, частично переходя в цитоплазму, частично (ламин В) оставаясь в связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса сведений меньше: известно, что часть этих белков входит в состав матрикса ("скэффолда") митотических хромосом.
  Четвертый - хромонемный уровень упаковки хроматина
  Исследуя структурную организацию хроматина и хромосом можно определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ДНК. Первый - нуклеосомный, дающий 7-кратное уплотнение ДНК в составе фибрилл ДНП, второй - 30 н.м. фибрилла или нуклеомерный уровень с40--70-кратной степенью упаковки, третий - доменно-петлевой или хромомерный приводящий к 600-700-кратному уплотнению ДНК в составе этих структур. Для поддержания первых двух уровней компактизации было достаточно участие только гистоновых белков, тогда как петлевые и розетко-подобные доменные структуры уже требовали участия негистоновых белков, и перехода от спирального или соленоидного типа укладки ДНК к образованию компактных глобулярных структур, состоящих из петель хроматиновых 30-нм фибрилл, к структурам типа хромомеров, имеющих уже размеры 0,1-0,2 мкм.
  Однако еще в классических работах цитологов начала ХХ века как в интерфазных ядрах, так и, особенно, в митотических хромосомах описывались нитчатые структуры - хромонемы, имеющие толщину 0,1-0,2 мкм. Их удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках. Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердило наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (рис. 71).
  При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромсом необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина. Хромонему - нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0,1-0,2 мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в телофазе. Причем такие хромонемы выявляются как в клетках растений, так и животных (рис. 72, 73).
  Изучение профазных хромосом как животных, так и растений показывает, что процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный этап - образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур, являющихся единицей последующей хромосомной структуризации.
  В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно видеть признаки хромонемной организации хромосом. В поздней анафазе, когда хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной 0,2 мкм. При этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей деконденсации митотических хромосом. Эта начальная стадия деконденсации связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением, обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и выраженным этот процесс становится в телофазе. В это время хромосомы начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными участками хромонемы также возрастает. В расположении отдельных нитей хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются признаки спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических хромосом (рис. 74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены ядерной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся на значительные расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время некоторые участки хромонем начинают разрыхляться, их толщина взрастает. Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их разрыхления, деконденсации самих хромонем.
  Ультраструктурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении хромосом при понижении концентрации двухвалентных катионов. Оказалось, что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется так, что выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы представлены сечениями толстых (0,1-0,2 мкм) хромосомных нитей, хромонем (рис. 73). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных катионов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром около 0,1-0,2 мкм. В дальнейшем эти блоки (хромомеры) начинают деконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Важно отметить, что расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей деконденсации петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомеров прогрессивно уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на срезах равномерно расположенным фибриллами ДНП.
  Надо отметить, что в современных молекулярно биологических исследованиях строения хромосом хромонемный уровень, как один из высших уровней упаковки ДНП, совершенно выпадает из поля зрения исследователей. Лишь в последнее время некоторые исследователи на основании косвенных данных приходят к выводам о наличии в интерфазных ядрах хромонемо-подобных структур.
  Глава 7. Общая организация митотических хромосом
  Интенсивное изучение ультраструктуры хромосом началось в середине 50-х гг., что было связано с внедрением в цитологию метода электронной микроскопии. Однако вклад электронной микрскопии в изучение структуры интерфазных и митотических хромосом оказался неизмеримо ниже того, что дал этот метод для изучения структуры цитоплазмы. Наши представления о структурной организации даже элементарных компонентов ядра и о структуре хромосом очень скудны и противоречивы. Разрыв между успехами в биохимическом изучении процессов биосинтеза ДНК и РНК, с одной стороны, и чрезвычайно медленным прогрессом в исследовании тонкой организации клеточного ядра - с другой, объясняется многими причинами. Одна из основных причин та, что современные методы не позволяют изучать ядро и хромосомы в целостной совокупности составляющих их элементов. Хромосома оказалась слишком мала для детального анализа с помощью светового микроскопа и слишком велика и плотна для изучения в электронном микроскопе. На выделенных хромосомах в электронном микроскопе не удается выявить все детали из-за наложений проекций разных уровней и можно наблюдать лишь характер формы или же тонкую структуру в ограниченных участках. Исследование ультратонких срезов хромосом ограничивается характеристикой отдельны элементов без возможности получить объемное представление о всей структуре. Это происходит из-за того, чтобы в данном случае мы можем исследовать лишь плоские сечения, составляющие только 0,05-0,025 часть общего объема ядра. Так как для ядра и хромосом характерно преобладание тонких и длинных спутанных фибриллярных структур, которые на ультратонких срезах будут иметь вид беспорядочно разбросанных коротких отрезков, то по таким сечениям воссоздать трехмерную картину взаимосвязи этих элементов друг с другом практически невозможно.
  При изучении ультраструктуры хромосом исследователи сталкиваются с парадоксальной ситуацией: чем ближе подходим к высшим структурным уровням организации хромосом, тем меньшей по объему и более низкой по надежности становится информация об этой важнейшей клеточной структуре (рис. 75).
  Действительно, получена полная информация о генетическом коде человека, хорошо изучен нуклеосомный уровень компактизации ДНК, определен общий петлевой доменный характер дальнейшей укладки ДНК, подтверждаются представления о хромонемном уровне, но все же, на сегодня мы до конца не знаем как построена митотическая хромосома (рис. 76).
  Трудности изучения хромосом связаны кроме всего прочего, что это очень лабильная структура, легко меняющая свою морфологию в зависимости от условий эксперимента.
  Так обращает на себя внимание свойство митотических хромосом обратимо изменять свой объем при изменении ионного окружения. Как уже указывалось, применение гипотонических растворов приводит к набуханию хромосом, но при возвращении их в изотонические условия, они вновь приобретают исходную морфологию. Из этого следует, что существует какой-то механизм, стабилизирующий общую организацию хромосомы. В хромосоме существует какой-то структурный порядок, алгоритм взаимодействия компонентов, который инвариантно приводит интерфазную развернутую, деконденсированную хромосому в состояние плотного тела (митотическая хромосома), не меняющего ни своей толщины, ни длины, ни особенностей структуры в бесчисленном ряду клеточных поколений.
  Как уже говорилось, для изучения ультраструктуры хромосом широко применяется метод получения целых выделенных митотических хромосом. На таких препаратах видно, что в состав хромосом входят 25-30 нм элементарные фибриллы. Однако уловить характер их укладки, какой-либо порядок в их расположении не удается. Хромосомы в этом случае имеют вид тел, состоящих как бы из перепутанных изгибающихся фибрилл, или, по образному выражению одного из цитологов, напоминают результат аварии на макаронной фабрике.
  На препаратах таких выделенных и распластанных хромосом нет реальной возможности выяснить, из какого числа нитей состоит хромосома, тем более проследить путь и порядок укладки одной нити от начала до конца, если бы она была основой хромосомы. Более того, процесс выделения хромосом приводит к изменению их структуры. Легко видеть в световом микроскопе, что перенос живых делящихся клеток в гипотонические растворы приводит к резкому набуханию их хромосом. Хромосомы при этом плохо различимы, они увеличиваются в объеме, становятся менее оптически плотными. В целом митотические хромосомы в этих условиях ведут себя так же, как препараты выделенного хроматина, - набухают, переходят в менее конденсированное состояние. Такое воздействие на них гипотонической среды приводит к потере субструктуризации хромосомы.
  Однако на то, что такая субструктуризация существует, говорит масса фактов не только электронномикроскопических, но и полученных с помощью светового микроскопа. Вся совокупность морфологических и биохимических данных должна быть учтена при воссоздании трехмерной организации митотических хромосом.
  В 70-х годах удалось уловить общий принцип структурной организации митотической хромосомы.
  Было обнаружено, что хромосомы не теряют своей морфологической целостности, не распадаются даже при резком набухании, вызванном удалением всех гистонов. Это достигается обработкой выделенных хромосом растворами полианионов, декстрансульфата и гепарина. В этом случае хромосомы настолько деконденсируются, что перестают быть видны в фазово-контрастном микроскопе. При добавлении же флуорохрома, связывающегося с ДНК (этидиум бромид), было видно, что сильно набухшие хромосомы не разваливались, а значительно (до 4 раз) увеличивались в длину и ширину. Такие сильно набухшие, лишенные гистонов хромосомы помещали на подложку и рассматривали в электронный микроскоп.
  Оказалось, что набухшие хромосомы состоят из двух компонентов: из рыхлой сети плотных фибрилл в центральных участках (хромосомный остов - скэффолд), повторяющих контуры метафазных хромосом (осевые компоненты), и из многочисленных длинных тонких петель, отходящих от них в поперечном направлении (рис. 77). Была показана белковая природа осевых компонентов и ДНК в составе петель. Средний размер боковых петель составлял около 30 мкм. Если такие препараты обработать ДНКазой, то можно получить белковые остовы и анализировать их состав. Оказалось, что в них присутствует около 20 белков негистоновой природы, сходных с белками ядерного матрикса. Исходя из этого, была предложена модель структурной организации митотических хромосом. В ее основе лежит принцип поперечного расположения петель ДНК вдоль белковой осевой структуры. В принцип этот тип организации митотической хромосомы очень напоминает хромосомы типа "ламповых щеток", встречающихся в процессе мейоза.
  Петлевое расположение ДНК вдоль хромосомы получило в дальнейшем целый ряд подтверждений. Однако при разных способах депротеинизации кроме петель в периферии набухших хромосом можно было выявить и розеткоподобные структуры, состоящие из ДНК.
  В последнее время получены данные, говорящие о том, что осевые структуры могут представлять собой артефакт, получившийся в результате монтажа и высушивания дегистонизированных хромосом на подложке. На самом же деле в теле хромосомы существуют негистоновые белковые связки (скрепки), сшивающие основания боковых петель ДНК, но эти связки разбросанные рыхло по объему хромосомы (рис. 78). Как бы то ни было, принцип петлевой поперечной укладки ДНК в теле хромосомы очень важен для понимания ее общей ультраструктурной организации.
  Необходимо подчеркнуть, что на поперечных и продольных сечениях митотических хромосом, фиксированных в нативном состоянии внутри клеток никаких центральных или осевых элементов не обнаружено. Они выявляются только после удаления из выделенных хромосом всего набора гистонов, чему предшествует изоляция хромосом в гипотонической среде.
  На основании этих наблюдений широкое распространение нашла христоматийная схема, объясняющая общую структуру митотической хромосомы (рис. 79). По этой схеме первым уровнем компактизации ДНК является нуклеосомная фибрилла, толщиной 10 нм, где вокруг одной нуклеосомы, оборачивается 146 п.н. ДНК с коэффициентом компактности равным 6-7 (к.к. 6-7); второй уровень - 30 нм фибрилла-соленоид (к.к. 40); третий уровень - петлевой домен, 60 т.п.н. на петле в 0,2-0,3 мкм (к.к. 680). Далее отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образуют вокруг осевого элемента хромосомы один виток диаметром 0,7-0,8 мкм (толщина хроматиды) с коэффициентом компактизации 12 х 104. Такой виток из петлевых доменов может представлять собой минимального размера бэнд, а набор из нескольких витков - средний бэнд.
  По другим представлениям можно предположить, что петле ДНК, выявляемой на хромосомах, лишенных гистонов, соответствует хромомер, промежуточным этапом деконденсации которого является розеткоподобная структура ДНП.
  Важно отметить, что хромомерные участки ДНП встречаются и в интерфазных ядрах (там они называются хромоцентрами). Оказалось, что порядок их деконденсации такой же, что и в митотической хромосоме: из хромоцентров возникают розеткоподобные структуры с петлями ДНП по их периферии.
  Итак, можно несколько иначе оценить некоторые этапы компактизации ДНК, которые приводят в конце концов к построению плотного тела митотической хромосомы (рис. 80).
  Первый уровень - нуклеосомный - образует сверхскручивание ДНК по поверхности гистоновой сердцевины. Второй - нуклеомерный (сверхбусина), где идет объединение 8-10 нуклеосом в виде глобулы. Так как все эти уровни компактизации происходят на огромных линейных молекулах ДНК, то ряд сближенных нуклеомеров и образует 20-30-нанометровую фибриллу ДНП. Третий уровень - хромомерный:: петли фибрилл ДНП, объединенные скрепками из негистоновых белков, образуют компактные тела, которые при искусственной деконденсации дадут розетковидные структуры. Расположение петлевых доменов, хромомеров, может быть неравномерным; участки тела митотической хромосомы, обогащенные ими, могут соответствовать "бэндам" или сегментам при дифференциальной окраске хромосом. Четвертый уровень - хромонемный: сближенные в линейном порядке хромомеры образуют толстые (0,1-0,2 мкм) хромосомные нитчатые структуры, которые можно уже наблюдать и в световом микроскопе. Характер упаковки этой нити в теле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование ею и еще одного уровня петлистых структур.
  Конечно, такая общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков таких как ядрышковый организатор, теломеры и центромеры.
  Часть III
  Ядерные транскрипты и их транспорт
  Одна из важнейших функций клеточного ядра является реализация генетической информации в виде синтеза целого ряда РНК или служащих матрицами для синтеза белка, или образующих аппарат белкового синтеза. Синтез разного типа РНК на матрицах ДНК хроматина, транскрипция, включает в себя образование нескольких типов РНК, синтезируемых с помощью различных РНК-полимераз, ферментов синтезирующих РНК по одной из цепей матричной ДНК. Всего в эукариотических клетках встречается 5 типов РНК (см. табл. 8).
  Таблица 8. Типы РНК, их количество, стабильность и ферменты, участвующие в их синтезе.
 №№
 пп Тип РНК Количество в % % синтезированных молекул за ед времени Фермент 1
 2
 3
 4
 5 иРНК
 рРНК
 тРНК
 мяРНК
 митРНК 10
 50-70
 25
 5
 15 58
 39
 
 3 РНК-полимераза II
 РНК-полимераза I
 РНК-полимераза II
 РНК-полимераза II
  Информационные РНК, самые разнообразные по величине и по строению нуклеотидных последовательностей являются самыми нестабильными по времени их жизни: они синтезируются в большом количестве и быстро деградируют, что обеспечивает смену функциональных активностей клетки. В связи с их быстрой заменой общее число их относительно невелико, 10% от массы всех РНК в клетке. Эти иРНК синтезируются при участии фермента РНК-полимеразы II, которая может образовывать первичную копию РНК с любого гена, кодирующего структуру белка. Дальнейшее созревание этих первичных транскриптов, их значительное укорочение и перестройка (сплайсинг - см. ниже) происходит с помощью особых рибонуклеопротеидных частиц, содержащих малые ядерные РНК (мяРНК). Эти мяРНК сннтезируются также с помощью этого фермента, их количество в клетке невелико (5%), но они более стабильны и долгоживущие. К мяРНК относится целая гетерогенная группа РНК, входящая в состав малых РНП-частиц, таких как SRP, теломераза, сплайсосомы и др. (см. ниже). Все остальные клеточные РНК необходимы для создания аппарата белкового синтеза. Рибосомные РНК синтезируются с помощью РНК-полимеразы I, они представляют основную массу клеточных РНК и относительно стабильны. Одна из рибосомных РНК, 5S РНК, а также 20 трансферных РНК, тоже стабильных, синтезируются с помощью РНК-полимеразы III. Митохондриальные РНК синтезируются в самих митохондриях независимо от синтеза РНК в ядре.
  Реализация генетической информации, выражающаяся в синтезе разнообразных молекул РНК должна быть связана с изменением морфологии ядерных компонентов. На светооптическом уровне активация ядерной транскрипции всегда связана с деконденсацией хроматина, с увеличением объема ядрышек, с повышением их базофилии, т.е. с увеличением в них количества РНК. Эти общие признаки увеличения ядерной активности мало что дают для понимания хода молекулярных процессов на уровне реальных ядерных компонентов. Что происходит с участками хроматина, заключающими индивидуальный ген, кодирующий определенный белок, изучать очень трудно, т.к. эти гены в подавляющем большинстве случаев существуют в единичных копиях и проследить в гигантском клубке деконденсированных интерфазных хромосом за работой индивидуального гена чрезвычайно трудно (хотя и возможно).
  Относительно более просто эту же задачу можно решить на генах многократно повторенных в геноме, таких как гены рибосомных РНК, входящих в состав интерфазных ядрышек, основной функцией которых является образование рибосом. Изучая ультраструктуру ядрышек и особенности морфологии синтеза рибосомных РНК впервые удалось с помощью электронного микроскопа визуализировать работающий ген.
 
 Глава 8. Ядрышко - источник рибосом
  Внутри интерфазных ядер как при витальных наблюдениях, так и на фиксированных и окрашенных препаратах видны мелкие, обычно шаровидные тельца - ядрышки. Впервые ядрышки были описаны Фонтана в 1774 г. В живых клетках они выделяются на фоне диффузной организации хроматина из-за своей светопреломляемости. Последнее свойство связано с тем, что ядрышки являются наиболее плотными структурами в клетке. Ядрышки обнаруживаются практически во всех ядрах эукариотических клеток за редким исключением. Это говорит об обязательном присутствии этого компонента в клеточном ядре.
  В клеточном цикле ядрышко присутствует в течение всей интерфазы: в профазе по мере компактизации хромосом во время митоза оно постепенно исчезает, и отсутствует в мета- и анафазе, и вновь появляется в середине телофазы, чтобы сохраняться вплоть до следующего митоза, или до гибели клетки.
  Долгое время функциональное значение ядрышка было непонятно. Вплоть до 50- годов исследователи считали, что вещество ядрышка представляет собой своего рода запас, который используется и исчезает в момент деления ядра.
  Однако еще в 30-х годах рядом исследователей (МакКлинток, Хейтц, Навашин) было показано, что возникновение ядрышек связано топографически с определенными зонами на особых, ядрышкообразующих хромосомах. Эти зоны были названы ядрышковыми организаторами, а сами ядрышки представлялись как структурное выражение хромосомной активности. Позднее в 40-х годах, когда было найдено, что ядрышки содержат РНК, стала понятна их "базофилия", сродство к основным (щелочным) красителям, из-за кислой природы РНК. По данным цитохимических и биохимических исследований основным компонентом ядрышка является белок: на его долю приходится до 70-80% от сухого веса. Такое большое содержание белка и определяет высокую плотность ядрышек. Кроме белка в составе ядрышка обнаружены были нуклеиновые кислоты: РНК (5-14%) и ДНК (2-12%).
  Уже в 50-х годах при изучении ультраструктуры ядрышек в их составе были обнаружены гранулы, сходные по своим свойствам с цитоплазматическими гранулами рибонуклеопротеидной природы, с рибосомами. Следующим этапом в изучении ядрышка было открытие принципиального факта - "ядрышковый организатор" является вместилищем генов рибосомных РНК.
  Строение рибосом
  Рибосома представляет собой элементарную клеточную машину синтеза любых белков клетки. Все они построены в клетке одинаково, имеют одинаковую молекулярную композицию, выполняют одинаковую функцию - синтез белка - поэтому их можно так же считать клеточными органоидами. В отличие от других органоидов цитоплазмы (пластид, митохондрий, клеточного центра, мембранной вакуолярной системы и др.) они представлены в клетке огромным числом: за клеточный цикл их образуется 1 х 107 штук. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибосомную РНК. РНК рибосом относительно стабильна, рибосомы могут существовать в клетках культуры ткани в течение нескольких клеточных циклов. В печеночных клетках время полужизни рибосом составляет 50-120 часов.
  Рибосомы - это сложные рибонуклеопротеидные частицы, в состав которых входит множество молекул индивидуальных (неповторенных) белков и несколько молекул РНК, Рибосомы прокариот и эукариот по своим размерам и молекулярным характеристикам отличаются, хотя и обладают общими принципами организации и функционирования. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения полностью расшифрована структура рибосом.
  Полная, работающая рибосома, состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на большую субъединицу и малую. Размер полной прокариотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 нм, эукариотической - 25 х 20 х 20. Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментации 70S и диссоциирует на две субъединицы: 50S и 30S. Полная эукариотическая рибосома, 80S рибосома, диссоциирует на 60S и 40S субъединицы. Форма и детальные очертания рибосом из разнообразных организмов и клеток, включая как прокариотические, так и эукариотические, поразительно похожи, хотя и отличаются рядом деталей. Малая рибосомная субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими выступами (см. рис. 81), ее длина составляет около 23 нм, а ширина - 12 нм. Большая субъединица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в полную 70S рибосому малая субчастица ложится одним концом на один из выступов 50S частицы, а другим в ее желобок. В состав малых субъединиц входит по одной молекуле РНК, а в состав большой - несколько: у прокариот - две, а у эукариот - 3 молекулы. Характеристики молекулярной композиции рибосом даны в таблице 9.
  Таблица 9. Молекулярная характеристика рибосом
 
  Объект Коэффициент седиментации полной рибосомы и ее субъединиц Кол-во молекул РНК на субъеди-ницу Молеку-лярный вес РНК Коэффи-циент седиментации РНК Кол-во белковых молекул на субъединицу 30S 1 0,56 х 106 16S 21
 Рибосомы 70S
 Прокариот 50S 2 1,2 х 106 23S 34
  4,0 х 104 5S
 
  40S 1 0,6 х 106 18S
 Рибосомы 80S
 Эукариот 60S 3 1,6 х 106 28S Всего

<< Пред.           стр. 3 (из 7)           След. >>

Список литературы по разделу