<< Пред.           стр. 4 (из 7)           След. >>

Список литературы по разделу

  4,0 х 104 5S около
  4,5 х 104 5,8S 80
 
  Таким образом в состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины: 28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18SРНК - 2000, 5,8S РНК - 160, 5SРНК - 120.Рибосомные РНК обладают сложной вторичной и третичной структурой, образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит к самоупаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по форме тело. Так, например, сама по себе молекула 18S РНК в физиологических ионных условиях образует палочковидную частицу, определяющую форму малой субъединицы рибосом.
  Под действием низких ионных сил, особенно при удалении ионов магния, плотные рибосомные субъединицы могут разворачиваться в рыхлые рибонуклеопротеидные тяжи, где можно наблюдать кластеры отдельных белков, но правильных структур, типа нуклеосом, нет, т.к. нет групп из сходных белков: в рибосоме все 80 белков разные.
  Для того, чтобы образовались рибосомы необходимо наличие четырех типов рибосомных РНК в эквимолярных отношениях и наличие всех рибосомных белков. Сборка рибосом может происходить спонтанно in vitro, если последовательно добавлять к РНК белки в определенной последовательности.
  Следовательно для биосинтеза рибосом необходим синтез множества специальных рибосомных белков и 4-х типов рибосомной РНК. Где эта РНК синтезируется, на каком количестве генов, где эти гены локализованы, как они организованы в составе ДНК хромосом - все эти вопросы в последние десятилетия были успешно разрешены при изучении строения и функции ядрышек.
 Чем определяется число ядрышек в клетке
  Как уже говорилось, все клетки имеют обязательные внутриядерные структуры - ядрышки. Это правило имеет небольшое число исключений, которые, как будет видно, только подчеркивают важность и необходимость участия ядрышка в жизненных отправлениях клетки. К таким исключениям относятся клетки дробящихся яиц, где ядрышки отсутствуют на ранних этапах эмбриогенеза, или клетки, закончившие развитие и необратимо специализировавшиеся как, например, некоторые клетки крови.
  В остальных случаях в клетках наблюдается 1-5 ядрышек, причем их количество не строго постоянно даже у одного и того же типа клеток. Более того в некоторых половых клетках (растущие ооциты) число ядрышек может достигать нескольких сот, т.е. на два порядка выше, чем в соседних соматических клетках. Это - т.н. амплификация ядрышек.
  Еще в 30-х годах было сделано предположение, что число ядрышек зависит от числа "ядрышковых организаторов" - особых участков, на которых в телофазе происходит новообразование ядрышек интерфазного ядра. Часто ядрышковые организаторы локализованы во вторичных перетяжках хромосом (образуют вторичные перетяжки хромосом). Так у человека ядрышковые организаторы расположены в коротких плечах 13, 14, 15, 21 и 22 хромосом (10 на диплоидный набор) (рис. 82). У млекопитающих обычно имеется несколько ядрышкообразующих хромосом на диплоидный набор: у кошки - 2; у свиньи - 2; у мыши - 4; у коровы - 8. У хладнокровных позвоночных и у птиц обычно имеется только по одной паре ядрышкообразующих хромосом.
  Таким образом максимальное число ядрышек в разных клетках определяется числом ядрышковых организаторов и увеличивается согласно плоидности ядра: в крупных полиплоидных ядрах всегда количество ядрышек больше.
  Это правило подтверждается прямыми наблюдениями над мутантными особями с разным числом ядрышковых организаторов. Так у шпорцевой лягушки в норме в диплоидной клетке есть две ядрышкообразующих хромосомы и соответственно 1-2 ядрышка. У гетерозиготной особи с одной ядрышкообразующей хромосомой - 1, у гомозиготных мутантных личинок, у которых нет ядрышковых организаторов, ядрышки не возникают и не происходит синтеза рРНК. Сходные наблюдения были получены на дрозофилах с разным числом ядрышкообразующих хромосом от 0 до 4.
  Локализация ядрышковых организаторов определяется довольно точно на митотических хромосомах с помощью окраски солями серебра, которые имеют специфическое сродство к некоторым ядрышковым белкам. Более точным является определение ядрышковых организаторов с помощью метода молекулярной гибридизации in situ. Так меченная тритием рРНК при контакте с денатурированной ДНК на препарате митотических хромосом образует ДНК-рРНК гибрид только в тех местах, где есть последовательности ДНК, комплементарные рРНК.
  Чаще всего в клетках количество ядрышек меньше, чем число ядрышковых организаторов. Это связано с тем, что при новообразовании ядрышек они могут сливаться друг с другом в одну общую структуру, т.е. могут объединяться в пространстве интерфазного ядра отдельные ядрышковые организаторы разных хромосом. Так в тканях человека могут встречаться клетки с одним ядрышком. Это значит, что десять ядрышкообразующих участков, локусов, диплоидного набора хромосом входят в состав одного ядрышка. Слияние ядрышек друг с другом хорошо показано на живых клетках культуры ткани при цейтраферной киносъемке.
  Множественность рибосомных генов
  При изучении числа ядрышек при различных хромосомных абберациях было найдено, что при разрыве хромосомы на месте вторичной перетяжки ядрышки могут возникать на каждом из фрагментов хромосом. Так при обмене участками между двумя хромосомами в микроспороцитах кукурузы, в том случае когда разрыв одной из хромосом происходил через ядрышковый организатор, возникали две хромосомы, каждая из которых несла часть исходного ядрышкового организатора. В этом случае обе хромосомы обладали способностью образовывать ядрышки, хотя и в неодинаковой степени. Из этих наблюдений был сделан очень важный вывод (который полностью подтвердился в 60-х годах на молекулярно-биологическом уровне) о том, что ядрышковый организатор представляет собой не точечный локус хромосомы, а является множественным по своей структуре, содержит несколько одинаковых генных участков, каждый из которых отвечает за образование ядрышка.
  Методом молекулярной гибридизации было показано, что в составе геномов эукариот рибосомные гены представлены сотнями и тысячами единиц; они принадлежат к фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК. Даже у бактерий в геноме может быть несколько (6-7) рассеянных по геному идентичных последовательностей, ответственных за синтез рРНК. Общее количество этой фракции ДНК (рДНК) у E. coli составляет около 1% от всей ДНК. У эукариотических организмов этот процент может составлять 0,18 для X. laevis, 0,4 - для человека, 1,3 для дрозофилы, 5,5 для пекарских дрожжей. Число же рибосомных генов у эукариот намного больше, чем у прокариотических клеток. В табл. 10 приведены некоторые примеры числа генов рРНК у различных представителей эукариот.
  Таблица 10. Количество рибосомных генов на гаплоидный набор хромосом
 Хордовые
 Млекопитающие:
 
 
 Птицы:
 Амфибии:
 
 
 Рыбы:
 
 
 Беспозвоночные
 Иглокожие:
 Насекомые:
 
 
 
 Моллюски:
 Нематоды:
 Простейшие
 
 Высшие растения:
 
 Грибы:
 
 Водоросли:
 
 Слизневики:
 
 Человек - 200
 Мышь - 100
 Кошка - 1000
 Курица - 200
 Тритон
 гребенчатый - 4100
 Амфиума - 19600
 Линь - 120
 Лосось - 730
 Неоцератод - 4800
 
 Морской еж - 260
 Сверчок
 домашний - 170
 Шелкопряд
 тутовый - 240
 Устрица - 220
 Аскарида - 300
 Эвглена - 800
 Тетрахимена - 290
 Фасоль - 2000
 Кукуруза - 8500
 Дрожжи
 пекарские - 140
 Хламидомонада - 150
 Ацетабулария - 1900
 Диктиостелиум - 200
 Физарум - 80
  С помощью метода молекулярной гибридизации было проанализировано не только число рибосомных генов, но и их локализация. Из этих экспериментов следовало, что именно зоны ядрышковых организаторов во вторичных перетяжках хромосом Xenopus содержат рибосомные гены и что в каждом из этих организаторов содержится примерно по 300 генов, т.е. ядрышковые организаторы представляют собой полицистронные участки, содержащие множество одинаковых генов (полиизогенные участки). Следовательно, рибосомные гены собраны вместе в группы или кластеры.
  Наблюдать непосредственно порядок расположения рибосомных генов на ДНК выделенных ядрышек с помощью электронного микроскопа удалось на дополнительных ядрышках ооцитов амфибий.
  Амплифицированные ядрышки
  Обычно число генов рибосомных РНК постоянно на геном, оно не меняется в зависимости от уровня транскрипции этих генов. Так у клеток с высоким уровнем метаболизма число генов рРНК точно такое же как и число у клеток, полностью прекративших синтез рибосом. При репликации ДНК в S-периоде происходит и удвоение числа генов рРНК, поэтому их количество коррелирует с плоидностью клетки.
  Однако существуют случаи, когда гены рРНК подвергаются избыточной репликации. При этом дополнительная репликация генов рРНК происходит в целях обеспечения продукции большого количества рибосом. В результате такого сверхсинтеза генов рРНК их копии могут становиться свободными, экстрахромосомными. Эти внехромосомные копии генов рРНК могут функционировать независимо, в результате чего возникает масса свободных дополнительных ядрышек, но уже не связанных структурно с ядрышкообразующими хромосомами. Это явление получило название амплификации генов рРНК. Особенно подробно это явление изучено на растущих ооцитах амфибий, хотя оно встречается как у животных, так и у растений.
  Так у X. laevis, наиболее подробно изученный и популярный объект, амплификация рДНК, происходит в профазе I деления созревания, когда синтез хромосомной ДНК давно закончен. В этом случае количество амплифицированной рДНК (или генов рРНК) становится в 3000 раз больше того, что приходится на гаплоидное количество рДНК, и соответствует 1,5 х 106 генов рРНК. Эти сверхчисленные внехромосомные копии и образуют сотни дополнительных ядрышек в растущих ооцитах. В среднем же на одно дополнительное ядрышко приходится несколько сот или тысяч генов рРНК.
  Амплифицированные ядрышки встречаются также в ооцитах насекомых. Так у окаймленного плавунца в ооцитах обнаружено 3 х 106 экстрахромосомных копий генов рРНК.
  Биологический смысл появления сверхчисленных экстрахромосомных ядрышек при росте ооцитов совершенно понятен: для синтеза огромного количества запасных продуктов, которые будут использованы на ранних стадиях эмбриогенеза, необходимо соответственно огромное количество рибосом, которые могут быть в клетке синтезированы на дополнительных матрицах этих многочисленных амплифицированных ядрышек. После периода созревания ооцита при его двух последовательных делениях эти дополнительные ядрышки в состав митотических хромосом не входят, они отделяются от новых ядер и деградируют. Следовательно, амплификация рДНК в ооците представляет собой временное явление, не сказывающееся на постоянстве генома.
  У низших эукариотических организмов наблюдаются также экстрахромосомные ядрышки. Так у Tetrachymena pyriformis в составе гаплоидного генома микронуклеуса имеется только единственный ген рРНК. В макронуклеусе же этого организма содержится около 200 гаплоидных эквивалентов в виде экстрахромосомных копий. У дрожжевых клеток также обнаружены экстрахромосомные копии генов рРНК в виде циклических молекул ДНК длиной около 3 мкм, содержащих один ген рРНК.
  Строение и функционирование генов рРНК
  Итак, в ядрышковых организаторах определенных хромосом локализованы места множественных сгруппированных вместе генов рибосомной РНК. Но как уже говорилось, существует 4 типа молекул рибосоной РНК, каждый из которых в полной эукариотической рибосоме представлен один раз. Значит ли это, что для каждой из этих РНК (28S рРНК, 18S рРНК, 5,8S рРНК, 5S рРНК) должен существовать отдельный ген, было долгое время неясным. Не понятным было также, как осуществляется в клетках одновременное сбалансированное образование этих разных рРНК. Этот вопрос был решен при исследовании динамики синтеза рибосомных РНК. Было обнаружено, что при использовании импульсной короткой метки среди клеточных РНК обнаруживается быстро синтезирующая РНК с высокой скоростью седиментации, тяжелая 45S РНК. Если после появления этой 45S РНК продолжать наблюдать за распределением метки во фракциях РНК, но уже в отсутствие меченных предшественников, то можно видеть, что по мере убывания метки в зоне 45S РНК, она начинает появляться и стабильно накапливаться в зонах 28S, 18S и 5,8S рибосомных РНК. Эти данные говорили о том, что при синтезе рибосомных РНК сначала образуется гигантская молекула-предшественник (45S РНК), которая затем дает начало основным молекулам рибосомной РНК. Было найдено, что молекула 45S РНК содержит около 13 х 103 оснований, имеет массу около 4,6 х 106, и может быть длиной 2-5 мкм. Явление распада молекулы 45S рРНК на фрагменты, соответствующие размерам 28S, 18S и 5,8S РНК, получил название "процессинг" или созревание. Во время процессинга происходит разрыв предшественника на три фрагмента и кроме того наблюдается значительная деградация РНК (около 50%, т.е. 6000 нуклеотидов). Кроме этих данных было вычислено, что молекула 5S РНК синтезируется независимо от 45S РНК и локализация гена 5S рРНК не связана с ядрышковым организатором.
  Почти одновременно с получением этих биохимических данных О. Миллеру (1969) удалось с помощью электронного микроскопа увидеть работающие рибосомные гены. Для этого были под световым микроскопом вручную выделены ядра из средних ооцитов тритона, микроиглами была разорвана ядерная оболочка и в микропипетку были втянуты многочисленные амплифицированные ядрышки. Такая капля, содержащая ядрышки и кариоплазму, была перенесена в раствор низкой ионной силы со щелочным значением среды. Этот раствор наслаивался на раствор сахарозы с формалином, находящийся в микроячейке центрифужной пробирки, на дне микроячейки помещалась сеточка с формваром для электронной микроскопии. Действие низкой ионной силы в щелочной среде приводило к набуханию и диспергированию выделенных ядрышек, они разрыхлялись настолько, что становились плохо различимыми в световом микроскопе. При центрифугировании такие набухшие ядрышки проходили через слой сахарозы, еще больше расправлялись и фиксировались в формалине. Наконец они достигали дна микроячейки и распластывались на формваровой подложке. После этого сеточки вынимались, обезвоживались, оттенялись металлом и просматривались в электронном микроскопе (рис. 83, 97а).
  На таком препарате были видны сложно изогнутые и перепутанные длинные осевые молекулы ДНК, на которых через равные промежутки располагались фибриллярные зоны, имеющие вид "елочек". Длина фрагмента ДНК, занятого такой "елочкой" была постоянной и равнялась 5 мкм. На этом отрезке располагалось около 100 плотных гранул величиной около 20 нм, от каждой из которых отходила в сторону тонкая изогнутая нить. Величина такой нити была минимальной на одном конце такого отрезка и максимальной на другом. Эти извитые латеральные нити и образовывали структуру типа "елочки". Было доказано, что крупные гранулы на нити ДНК представляют собой молекулы РНК-полимеразы I, ответственной за синтез рРНК, а боковые изогнутые нити - транскрипты, состоящие из синтезируемых молекул РНК. Самые длинные транскрипты находились на одном конце "елочки", соответствовали 45S предшественнику рРНК. Следовательно, синтез рРНК начинался на конце отрезка с короткими боковыми нитями, и заканчивался на участке с длинными нитями РНК. Такой участок ДНК, на котором были видны молекулы рРНК в процессе их удлинения, получил название транскрипционной единицы. Между транскрипционными единицами располагались участки ДНК, лишенные гранул РНК-полимеразы I и транскриптов. Это - зоны т.н. спейсеров, которые не транскрибируются, и, более того, на таких препаратах они имеют нуклеосомное строение, тогда как транскрипционные единицы свободны от нуклеосом. Величина таких спейсерных участков может варьировать не только в данной клетке, но быть различной у разных видов. Длина боковых фибрилл была в 5-10 раз короче, чем 45S РНК, из-за того, что эта новосинтезированная РНК связана с белками, образуя рибонуклеопротеидный тяж, предшественник рибосом.
  Исходя из этих работ стало ясно, что рибосомный ген состоит из двух участков: нетранскрибируемая последовательность ДНК (nts) - спейсер и транскрипционная единица. В состав транскрипционной единицы входят участки, соответствующие 28S, 18S и 5,8S рРНК, разделенные вставками, которые деградируют при процессинге 45S РНК.
  Расшифровка структуры рибосомных генов различных эукариотических объектов показала удивительно универсальный тип их строения:
  3' nts - промотор- tse - 18S рРНК - tsi1 - 5,8S рРНК - tsi2 - 28S рРНК 5'
  где nts - нетранскрибируемые последовательности ДНК спейсерного участка, ts - транскрибируемые последовательности ДНК (внешняя и две внутренние), и участки, соответствующие зрелым рибосомным РНК. В состав транскрипционной единицы входит весь ген за исключением спейсерного участка. Такая структура рибосомного гена практически одинакова для всех эукариотических организмов (рис. 84). Вариабельными являются как нетранскрибируемые (спейсерные) участки, так и транскрибируемые вставки (ts), которые не входят в состав зрелых рРНК.
  Итак три основные молекулы рРНК синтезируются на одной транскрипционной единице. Что же касается молекулы 5S рРНК, то она к этому гену никакого отношения не имеет: 5S рРНК синтезируется на отдельных генах, локализованных не в зонах ядрышковых организаторов, даже на совсем иных хромосомах при участии РНК-полимеразы III. Так у человека основная масса генов 5S рРНК находится на I хромосоме, более мелкие кластеры - на 9 и 16 хромосомах. У ксенопуса гены 5S рРНК расположены в теломерных участках большинства хромосом. Гены 5S рРНК, тоже множественные, также собраны в кластеры, но их число выше, чем у остальных генов рРНК. Так у человека их насчитывается до 2000, у ксенопуса - 24000, у гребенчатого тритона - 32000. Есть объекты и с меньшим их числом: Drosophila - 320; крыса - 830. У нейроспоры и дрожжей число генов 5S рРНК одинаковое с числом других рибосомных генов, т.к. участок 5S рРНК включен и транскрибируется в спейсерной зоне.
  Транскрипция рРНК идет с помощью двух ферментов: РНК-полимеразы I, которая участвует в синтезе 45S предшественника рРНК и РНК-полимеразы III, ответственной за синтез 5S рРНК. Матрицей для синтеза рРНК по определению должна быть ядрышковая ДНК.
  В изолированном р-хроматине обнаружены гистоны, негистоновые белки и белки рибосом. Так в р-хроматине обнаружены основные сердцевинные (коровые) гистоны, но их количество составляет только 40% по сравнению с таковым в тотальном хроматине.
  Первичные транскрипты (морфологически представлены в виде латеральных филаментов на "елочках", образующихся на активных транскрипционных единицах) прогрессивно увеличиваются в длину по мере прохождения РНК-полимеразы I вдоль всего транскрипционного участка гена, начиная с точки начала репликации до терминального участка. Скорость роста цепи пре-рРНК составляет около 20-30 нуклеотидов/сек., т.е. весь синтез 45S рРНК занимает около 5-10 минут.
  На каждой транскрипционной единице располагается множество (50-100) молекул РНК-полимеразы I, тем самым на каждом гене одновременно происходит синтез множества молекул пре-рРНК, которые находятся на разных стадиях роста полинуклеотидной цепи (рис. 85). Максимальной величины пре-рРНК достигает вблизи терминального участка, где ее молекулярный вес достигает 4,5 х 106 Д (для млекопитающих), а длина должна соответствовать 5,2 мкм. На самом же деле длина латерального транскрипта в 5-10 раз короче этой величины. Это связано с тем, что по мере роста транскрипта он связывается сразу же с белками, образуя в конечном участке транскрипции рибонуклеопротеид с коэффициентом седиментации 80S. Такие 80S рРНП составляют до 20% от всех РНП ядрышка. Большая часть белков, которые связываются с 45S РНК являются белками, входящими в состав малой и большой субъединиц зрелых рибосом. Таким образом уже на уровне незрелой гигантской молекулы пре-рРНК происходит специфическое связывание с рибосомными белками: около 50% белков большой субъединицы и около 30% малой субъединицы связываются с пре-рРНК во время ее синтеза или вскоре после него. Такая связь 45S РНК с белками и приводит к тому, что латеральные транскрипты имеют толщину около 10 нм (после оттеснения металлами), на их свободном конце часто наблюдается крупная гранула (30 нм), что может указывать на высокую степень компактизации РНК и белка на 5'-конце цепи РНК.
  Распад 45S РНК на более короткие отрезки, явление созревания рРНК или процессинг, происходит после завершения транскрипции. Ферментативный механизм этого явления еще до конца не ясен, в нем принимает участие эндо- и экзонуклеазы. При этом происходит последовательное расщепление пре-рРНК на фрагменты и частичная деградация участков РНК на этих фрагментах. В результате процессинга пре-рРНК примерно 50% нуклеотидов первично синтезированной молекулы отщепляется (мол. вес 45S РНК составляет 4,6 х 106, а суммарный мол. вес зрелых рРНК около 2,2 х 106) (рис. 86).
  Таким образом, в ядрышке локализуются следующие основные предшественники рибосом: 1. Транскрипты рРНК в процессе их роста; 2. 80S РНП, содержащие 45S РНК, они могут составлять до 10-20% всех РНП ядрышка; 3. 55S РНП, предшественники большой субъединицы, могут составлять до 70-80% всех РНП ядрышка; время созревания большой рибосомной субъединицы занимает около одного часа; 4. Незрелые малые (40S РНП) субъединицы рибосом, быстро (за 15-30 мин) покидающие ядрышко.
  В интенсивно функционирующих ядрышках происходит синтез огромного числа рибосом: 1500-3000 штук в минуту. Поэтому в ядрышке насчитывается около 5 х 104 предшественников рибосом.
  Структура ядрышка
  О тонком строении ядрышка сведения были получены главным образом методом электронной микроскопии. Световая микроскопия давала ограниченный набор сведений о структуре ядрышка из-за их малого размера (1-5 мкм) и недостаточной разрешающей способности данного метода. Из прижизненных наблюдений было видно, что ядрышки обладают высокой плотностью и высоким светопреломлением. В их структуре даже прижизненно видна некоторая неоднородность: описывались нитчатые (нуклеолонемы), гранулярные компоненты (нуклеолини), а также светлые зоны - "вакуоли". Гистохимически в ядрышках выявлялась РНК, но не ДНК. ДНК в ядрышках выявлялась лишь в периферической их зоне в виде т.н. околоядрышкового хроматина, который мог прилежать к одной из сторон ядрышка, окружать его кольцом, или вообще отсутствовать. Считалось, что околоядрышковый хроматин представляет собой гетерохроматиновые зоны. Кроме того было найдено, что ядрышки имеют некоторое сродство к солям серебра, обладают аргентофилией, могут восстанавливать серебро из различных растворов (нитрат серебра, "аммиачное серебро", протеинаты серебра). При этом происходит отложение темных осадков исключительно в ядрышках интерфазных клеток, а также в ядрышковых организаторах на митотических хромосомах при делении клетки.
  Первые электронномикроскопические работы показали, что ядрышки самых различных объектов несмотря на их разнообразие, построены из одинаковых компонентов: гранулярного и фибриллярного (рис. 87). При этом гранулы в составе ядрышек имели размеры 15-20 нм и были несоизмеримо меньше тех "гранул", что были видны в световом микроскопе. Кроме гранул в составе ядрышек обнаружили зоны скопления тонких (3-5 нм) фибрилл - диффузная часть ядрышек. Взаимное расположение гранулярных и фибриллярных зон в ядрышке может быть различным. Так, в некоторых случаях, фибриллярный компонент занимает центральную часть ядрышка в виде однородного образования (печень аксолотля, многие ядрышки растительных меристем) или в виде нескольких (3-5) отдельных зон (рис. 88).
  Обычно гранулярный компонент (ГК) расположен на периферии ядрышка, но встречаются случаи, когда фибриллярный и гранулярный компонент распределены в ядрышке равномерно. Часто в структуре ядрышек фибриллярно-гранулярные компоненты образуют нитчатые структуры, нуклеолонемы (ядрышковые нити), толщиной около 100-200 нм. Эти нуклеолонемы при достаточном контрастировании могут быть видны даже в световом микроскопе. Ядрышковые нити или нкулеолонемы также неоднородны по своему строению: в них кроме гранул 15 нм, входит множество тонких фибрилл, которые могут образовывать в нуклеолонемах отдельные сгущения.
  Неоднородной оказалась структура и диффузного, фибриллярного компонента. Было найдено, что практически во всех типах ядрышек как животных, так и растительных объектов встречаются т.н. фибриллярные центры (ФЦ), участки скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, окруженные зоной фибрилл более высокой электронной плотности - плотный фибриллярный компонент (ПФК).
  Кроме гранул и фибриллярных участков в структуре ядрышка обнаруживаются хроматиновые компоненты: такие как околоядрышковый хроматин, который может примыкать к ядрышку и даже окружать его. Часто 30 нм фибриллы хроматина по периферии ядрышка заходят в лакуны, между нуклеолонемными участками.
  Наконец, в составе ядрышка выявляется белковый остов, матрикс. На ультратонких срезах необработанных ядрышек матрикс не выявляется в виде отдельного компонента, но если экстрагировать из ядрышек РНК, ДНК и белки, связанные с ними, то можно видеть, что ядрышко как таковое, не распадается, не теряет своей общей формы. После таких обработок структура ядрышка представлена рыхлой фибриллярной сетью, заполняющей объем ядрышка.
  Таким образом, в структуре ядрышек можно различить следующие пять компонентов: гранулярный, фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент, хроматин, белковый сетчатый матрикс.
  Каким же образом распределены внутри ядрышек рДНК, рРНК и белки, где располагаются матрицы для синтеза рРНК, где первичные транскрипты, где предшественники рибосом, зрелые рибосомы - все эти вопросы были решены с применением самых разнообразных молекулярно-биологических и цитологических методов. Один из этих методов, - метод регрессивного окрашивания нуклеиновых кислот, основан на том, что ионы уранила, связанные с ДНК, более легко вымываются со срезов при обработке их хелатоном ЭДТА, чем ионы, связанные с РНК. Это позволяет различить в ядре плотные окрашенные структуры, содержащие РНК и структуры потерявшие окраску, те что содержат ДНК. Так в разнообразных ядрах участки хроматина как конденсированного, так и диффузного теряют окраску, а компоненты, содержащие РНК - сохраняют. В ядре при этом контрастно выделяются разнообразные РНП, содержащиеся в основном объеме ядра и ядрышка. При этом в ядрышках интенсивно окрашены многочисленные гранулы, они окрашены так же, как рибосомы цитоплазмы. Окрашенным является плотный фибриллярный компонент, фибриллярные центры окрашены слабее, а внутриядрышковый и околоядрышковый хроматин выглядят светлыми. Следовательно можно предположить, что как гранулярный компонент, который скорее всего представляет субъединицы рибосом, так и плотный фибриллярный компонент содержат РНК.
  Так при короткой пульсовой метке тритированным уридином (3H-уридин), первые следы мечения обнаруживались сначала (через 1-15 мин) в плотном фибриллярном компоненте (ПФК), а затем (до 30 мин) меченым оказывался гранулярный компонент (ГК). Важно отметить, что в фибриллярных центрах (ФЦ) метка не обнаруживалась. Из этого наблюдения был сделан вывод, что 45S пре-рРНК синтезируется в области плотного фибриллярного компонента, а гранулярный компонент ядрышка соответствует прерибосомным частицам (55S-, 40S РНП).
  Оставался открытым вопрос о природе фибриллярных центров, окруженных плотными РНК-содержащими фибриллами. Было обнаружено с помощью различных методов (специфическое окрашивание с помощью осмий-амина, ДНКазы, меченной золотом, связыванием меченого актиномицина, прямой молекулярной гибридизацией с меченой рДНК), что в составе фибриллярных центров находится ДНК, ответственная за синтез рРНК. Зоны фибриллярных центров отличаются от остального хроматина тем, что состоят из тонких хроматиновых фибрилл, значительно обедненных гистоном HI (что показано с помощью меченных коллоидным золотом антител).
  Эти исследования позволили связать друг с другом данные молекулярной организации транскрибируемых рибосомных генов с данными морфологии ядрышек и выяснить топологию в объеме ядрышка процесса синтеза рибосомной РНК и образования рибосом.
  По модели, предложенной Жоссеном (1984), в фибриллярных центрах расположены неактивные рибосомные гены и, возможно, спейсерные участки. Транскрипция пре-рРНК происходит по периферии фибриллярных центров, где плотный фибриллярный компонент и представляет собой 45S пре-рРНК, располагающиеся в виде "елочек" на деконденсированных участках рДНК (рис. 89). После завершения транскрипции 45S РНК теряет связь с транскрипционной единицей на ДНК в зоне плотного фибриллярного компонента, каким-то еще непонятным образом переходит в гранулярную зону, где и происходит процессинг рРНК, образование и созревание рибосомных субъединиц.
  Фибриллярный центр и ядрышковый организатор
  Строение и химические характеристики ФЦ оказались практически одинаковыми с таковыми ядрышковых организаторов митотических хромосом. И те и другие построены из тесно ассоциированных фибрилл, толщиной 6-10 нм; и те и другие обладают характерной особенностью - окрашиваться солями серебра, что зависит от наличия особых ядрышковых белков, содержат РНК-полимеразу I.
  Однако число ФЦ в интерфазных ядрышках, не соответствует числу ядрышковых организаторов в митозе. Так в клетках культуры СПЭВ число ФЦ может быть в 2-4 раза выше, чем число ядрышковых организаторов (см. табл. 11).
  Таблица 11. Количество ядрышек (ЯК), фибриллярных центров (ФЦ) в G0- и G2-периодах и во время митоза
  Среднее число ЯК Среднее число ФЦ Общий объем ЯК, мкм3 Общий объем ФЦ, мкм3 Средний объем одного ФЦ, мкм3 G0-период 2,3 7 8,05 0,212 0,033 G2-период 2,3 33,7 23,43 0,430 0,014 Митоз - 6-8 - 0,2 0,025
  Более того, количество ФЦ возрастает по мере увеличения плоидности клетки (G2, 4n) и транскрипционной ее активности. При этом уменьшается величина каждого отдельного фибриллярного центра. Однако суммарные объемы ФЦ при пересчете на гаплоидный хромосомный набор остаются постоянными в интерфазе, но превышают это число вдвое по сравнению метафазой. Другими словами при активации синтеза рРНК наблюдается такое изменение числа ФЦ и их размеров, которое может говорить о какой-то фрагментации исходных ФЦ в относительно мало активных ядрышках.
  Противоположная картина наблюдается при затухании синтетических процессов в дифференцирующихся клетках эритроидного ряда мышей (табл. 12). При этом видно, что в размножающихся и активно синтезирующих гемоглобин проэритробластах количество фибриллярных центров зависит от плоидности клетки (88 в G1-фазе, 118 в G2-фазе клеточного цикла), размер индивидуальных ФЦ изменяется мало. После прекращения размножения этих клеток и падении их синтетической активности резко меняются параметры ядрышка. Их объем, уже начиная со стадии базофильного эритробласта уменьшается в 4-5 раз, а на конечной стадии дифференцировки (нормобласт) - в сотню раз. При этом резко падает число ФЦ (10-40 раз) и возрастает объем почти в 10 раз величины отдельного фибриллярного центра.
 
  Таблица 12. Количество фибриллярных центров (ФЦ) и значения их размеров при эритропоэзе в печени зародышей мыши
 
 Стадия дифферен-цировки Средний объем ядрышек, мкм3 Среднее кол-во ФЦ Средний диаметр ФЦ, мкм3 Средний объем ФЦ, мкм3 Суммарный объем ФЦ, мкм3 Проэритробласт (2 с ДНК) 17,7 88 0,2 0,0042 0,369 Проэритробласт (4 с ДНК) 29,4 118 0,23 0,0064 0,749 Базофильный эритробласт
 (2 с ДНК) 4,5 8 0,35 0,0248 0,170 Полихромато-фильный эритробласт
 (2 с ДНК) 0,5 4,3 0,4 0,0259 0,110 Нормобласт
 (2 с ДНК) 0,102 2,7 0,42 0,04 0,102
  Исходя из этих наблюдений можно так представить общую схему активации и инактивации ядрышка (рис. 90) на примере одного ядрышкового организатора.
  В неактивной форме ядрышковый организатор представлен в виде одного крупного фибриллярного центра, включающего в себя компактно уложенную часть цепи хромосомной ДНК, несущей тандемно расположенные рибосомные гены (транскрипционные единицы). В начале активации ядрышка происходит деконденсация р-генов на периферии такого фибриллярного центра, эти р-гены начинают транскрибироваться, на них образуются РНП-транскрипты, которые при созревании дают начало появлению гранул - предшественников рибосом по периферии активированного ядрышка. По мере усиления транскрипции единый фибриллярный центр как бы распадается на ряд более мелких фибриллярных центров, связанных друг с другом полностью декомпактизованными участками рДНК. Чем выше транскрипционная активность ядрышка, тем больше число мелких, связанных друг с другом фибриллярных центров, окруженных плотным фибриллярным компонентом (ПФК), содержащим 45S рРНК. При полной активации ядрышка все мелкие фибриллярные центры деконденсируются; в этом случае зоны плотного фибриллярного компонента содержат всю рДНК, находящуюся в активном состоянии. Такая структура наблюдается у амплифицированных ядрышек растущих ооцитов. В случае инактивации ядрышка происходит постепенная конденсация рДНК, снова образуются фибриллярные центры, они объединяются друг с другом, величина их растет параллельно уменьшению доли ПФК. При полной инактивации, как в случае нормобластов, ядрышко представлено одним крупным (4-5 мкм) сферическим ФЦ, без сопутствующего транскрипции ПФК: оно окружено зоной конденсированного хроматина. Такое инактивированное ядрышко сходно по своим структурным особенностям с ядрышковым организатором в составе митотических хромосом.
  Структурные типы ядрышек
  Приведенные выше описания дают основу для понимания разнообразия строения ядрышек в клетках с соответствующим уровнем синтеза рРНК. Однако кроме различной степени выраженности гранулярного и фибриллярных компонентов существуют и иные варианты структурной организации ядрышек. Обычно различают несколько структурных типов ядрышек: ретикулярный или нуклеолонемный, компактный, кольцевидный, остаточный (покоящийся), сегрегированный (рис. 91).
  Ретикулярный тип ядрышка наиболее характерен для большинства клеток, для него свойственно нуклеолонемное строение, обилие гранул и фибриллярного плотного материала. Во многих случаях фибриллярные центры выявляются плохо, вероятно из-за высокого уровня транскрипции. Этот тип ядрышек встречается в клетках животных и растений. Так, например, ретикулярный тип ядрышка, свойственный гигантским политенным хромосомам двукрылых насекомых, очень сходен с таковым на гигантских хромосомах антиподиальных клеток ячменя.
  Компактный тип ядрышка отличается от предыдущего меньшей выраженностью нуклеолонемы, большей частотой встречаемости фибриллярных центров. Такие ядрышки характерны для активно размножающихся клеток (клетки растительных меристем, клетки культуры ткани и др.). Вероятно, что оба эти типа могут переходить друг в друга, во всяком случае, они чаще всего встречаются в клетках с высоким уровнем синтеза РНК и белка.
  Кольцевидные ядрышки встречаются в клетках животных. В световом микроскопе они имеют форму кольца с оптически светлой центральной зоной - это фибриллярный центр, окруженный РНП-фибриллами и гранулами. Размер этих ядрышек составляет около 1 мкм. Типичные кольцевидные ядрышки характерны для лимфоцитов, эндотелиоцитов,т.е. для клеток с относительно низким уровнем транскрипции.
  Остаточные ядрышки характерны для клеток полностью потерявших способность к синтезу рРНК (нормобласты, дифференцированные энтероциты, клетки шиповатого слоя кожного эпителия и др.). Часто они настолько малы и так окружены конденсированным хроматином, что с трудом обнаруживаются в световом микроскопе. В ряде случаев они могут снова активироваться и переходить в компактную или ретикулярную форму.
  Сегрегированные ядрышки характерны для клеток, обработанных различными антибиотиками или химическими веществами, вызывающими прекращение синтеза рРНК (актиномицин Д, амфотерицин и др.), а также антибиотиками, влияющими на синтез ДНК и белков (митомицин, пуромицин, многие канцерогены и т.д.). Термин "сегрегация" используется в данном случае в связи с тем, что происходит как бы разделение, обособление разных компонентов ядрышек, сопровождающиеся прогрессивным уменьшением его объема. При этом обособляются друг от друга крупные фибриллярные центры и гранулярно-фибриллярный компонент.
  Белки ядрышек
  До 60% сухого веса выделенных ядрышек приходится на белки, число которых может составлять несколько сот разных видов. Помимо белков ассоциированного с ядрышками хроматина в состав ядрышек входят белки рибосом и специфические ядрышковые белки, связанные с транскрипцией рибосомных генов, с процессингом 45S рРНК, такие как РНК-полимераза I, факторы транскрипции, топоизомеразы, метилазы, нуклеазы, протеинкиназы, фосфатазы. Часть ядрышковых белков имеет сродство к серебру, - аргентофильные белки: РНК-полимераза I, фактор транскрипциии UBF, нуклеолин (С-23), нуклеофозмин (ньюматрин или В-23).
  Аргентофилия характерна для белков, обогащенных сульфгидрильными, дисульфидными связями. Как уже указывалось, четкой аргентофилией обладают интерфазные ядрышки и зоны ядрышковых организаторов на митотических хромосомах.
  Собственно ядрышковые белки расположены в специфических местах их активности. Так РНК-полимераза I и фактор транскрипции рРНК UBF располагаются в фибриллярных центрах (ФЦ) и/или в плотном фибриллярном компоненте (ПФК).
  Ag-фильным является также белок с мол. весом 195 кДа, представляющий собой большую субъединицу РНК-полимеразы I, участвующую в синтезе рРНК. Этот белок локализуется в зоне фибриллярных центров, по их периферии. На плоскостных препаратах ядрышек аргентофилией обладают участки над осевой частью "елочек", непосредственно над расположением гранул РНК-полимеразы I. Кроме того, с помощью иммуноморфологических методов РНК-полимераза I обнаруживается в зоне ядрышковых организаторов митотических хромосом. Это обстоятельство не противоречит данным о том, что во время митоза транскрипция полностью прекращается. Вероятно, что во время митоза гены, нагруженные неактивной РНК-полимеразой I, переносятся весте с нею в области ядрышковых организаторов из одной клеточной генерации в другую.
  Специфический для ядрышек белок фибрилларин (В-36, м.в. 34 кДа) располагается в ПФК, где он осуществляет процессинг пре-рРНК в комплексе другими РНП, в состав которых входит U3 мяРНК, необходимая для начального этапа процессинга 45S рРНК. Фибрилларин обнаруживается также в остаточных ядрышках - в "ядрышковом матриксе".
  Белок С23 (110 кДа) или "нуклеолин" локализуется в зоне плотного фибриллярного компонента и в фибриллярных центрах ядрышек, но также и в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Следовательно он обнаруживается как на транскрибируемых, так и на неактивных участках рибосомных генов. В препаратах распластанных ядрышек он обнаруживается над транскрипционными единицами ("елочками"), он обнаружен во фракциях, содержащих предшественники рибосом. Функции его до конца не ясны, хотя стало известно, что белок С23 может играть важную структурную роль в процессе транскрипции: он своим N-концом, на котором находятся лизиновые группы, связывается с ядрышковым хроматином, а C-концом с транскрибируемым спейсером (tsi) на 45S рРНК.
  Обнаружено, что этот белок связывается не с ДНК транскрипционной единицы, а с ДНК, имеющей нуклеосомное строение (вероятно со спейсерными участками).
  Белок В-23 (нуклеофозин, м.в. 37 кДа) с помощью иммуноцитохимических методов локализован в области ПФК и, главным образом, в зоне гранулярного компонента. Считается, что В-23 участвует в промежуточных и терминальных стадиях биогенеза рибосом, и в транспорте пре-рибосом.
  Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом
  При становлении синтеза рРНК в ядрышках на поверхности ФЦ происходит активация транскрипционных единиц, - связывание с факторами транскрипции и РНК_полимеразой I, которая начинает считывать первичный транскрипт рРНК. По мере прохождения первой РНК-полимеразы I, на освобождающемся участке транскрипционной единицы садится следующая РНК-полимераза и начинается синтез новой рРНК. Одновременно и последовательно на одном р-гене могут находиться до сотни РНК-полимераз I, от которых отходят транскрипты разной степени завершенности. Конечным продуктом является пре-рРНК или 45S рРНК. По мере синтеза растущие цепи рРНК одеваются рибосомными белками, поступающими в ядро из цитоплазмы, так что сразу образуются цепи РНП-предшественников. Совокупность продуктов транскрипции нескольких транскрипционных единиц образует вокруг ФЦ зону ПФК. Конечным продуктом такого синтеза является рибонуклеопротеидный тяж, или глобула, имеющая константу седиментации около 80S, содержащая одну молекулу 45S рРНК. После отделения 45S рРНК в терминальной точке транскрипционной единицы происходит расщепление - процессинг 45S рРНК, в конце которого образуются 40S и 60S рибосомные субъединицы. Синтез малых субъединиц в ядрышке занимает примерно 30 мин, а больших - около 1 ч. В ядрышке незрелая 60S рибосомная субъединица, коме двух фрагментов рРНК (28S и 5,8S) связывается с третьим (5S), который синтезировался независимо от хромосом с ядрышковыми организаторами на других хромосомах. Такие новообразованные рибосомные субъединицы особым образом выходят из ядра в цитоплазму через ядерные поры. В цитоплазме такие незрелые рибосомы могут связаться с дополнительными белками. 40S субъединица сначала связывается с иРНК, и только затем с большой 60S субъединицей, образуя полную 80S функционирующую рибосому (рис. 92).
  Новые, неканонические функции ядрышек
  Последние данные показывают, что кроме синтеза рРНК, ядрышко участвует во многих других аспектах экспрессии генов.
  Первые намеки (1965) на признаки полифункциональности ядрышек были получены при изучении гетерокарионов. Так при слиянии человеческих клеток HeLa с эритроцитами кур были получены гетерокарионы с первоначально совершенно разными ядрами. Ядра клеток HeLa были функционально активны, в них шел синтез разнообразных РНК. Исходные ядра эритроцитов кур содержали сверхконденсированный хроматин, не содержали ядрышек и не транскрибировались. В гетерокарионе после слияния с HeLa клетками в ядрах эритроцитов кур хроматин начинал деконденсироваться, активировалась транскрипция, появлялись ядрышки. Иммуноцитохимическими методами изучалось появление в гетерокарионах белков, характерных для куриных клеток. Несмотря на то, что в клетках HeLa была готовая система функционирования рибосом и были сформированы ядрышки, появление куриных белков было отложено до тех пор пока не возникнут ядрышки в ядрах эритроцитов. Это означало, что ядрышко куриного эритроцита как-то должно вовлекаться в образование куриных иРНК, т.е. ядрышко должно играть какую-то роль в продукции куриных иРНК.
  Позднее были накоплены данные в поддержку этой возможности. Было обнаружено, что созревание (сплайсирование, см. ниже) c-myc иРНК в клетках млекопитающих происходит в ядрышках. В ядрышках обнаружены сплайсосомные малые РНК (sn РНК), факторы сплайсинга пре-иРНК.
  Далее в ядрышках обнаруживаются РНК, входящие в SRP-частицы, участвующие в синтезе белков в эндоплазматическом ретикулуме. С ядрышком оказалась ассоциирована РНК теломеразы - рибонуклеопротеида (обратная транскриптаза). Много есть данных о локализации в ядрышках прцессинга малых ядерных РНК, входящих в состав сплайсосом, и даже о процессинге тРНК.
  Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал
  В световом микроскопе ядрышко выявляется во время интерфазы, в митотических клетках оно исчезает. При использовании цейтраферной микрокиносъемки можно наблюдать в живых клетках как по мере конденсации хромосом в интерфазе происходит исчезновение ядрышка. Сначала оно слегка уплотняется, но затем ко времени разрыва ядерной оболочки начинает быстро терять плотность, становится рыхлым и на глазах быстро исчезает, как бы тает. При этом видно, что часть ядрышкового материала растекается между хромосомами. В метафазе и анафазе ядрышки как таковые отсутствуют. Первые признаки новых ядрышек появляются после средней телофазы, когда уже достаточно разрыхлились хромосомы дочерних ядер, имеющие новую ядерную оболочку. В это время вблизи деконденсирующихся хромосом появляются плотные тельца - предъядрышки. Обычно их число выше, чем число ядрышка в интерфазе. Позднее уже в G1-периоде клеточного цикла предъядрышки растут, начинают объединяться друг с другом, их общее число падает, но суммарный объем возрастает. Общий объем ядрышка удваивается в S-G2-фазах. В некоторых случаях в профазе (культуры клеток человека) при конденсации хромосом крупные ядрышки распадаются на более мелкие, которые в митозе исчезают.
  На самом деле никакого полного исчезновения, или "растворения" ядрышка нет: происходит изменение его структуры, редукция одной части его компонентов при сохранении другой. Так было показано, что аргентофильные гранулы в интерфазных ядрышках, обнаруживаемые в световом микроскопе начинают в профазе сливаться друг с другом, одновременно уменьшаясь в объеме, минимальный размер они занимают в метафазе, локализуясь в зонах ядрышковых организаторов хромосом. В таком виде они существуют до средней телофазы, когда выявляются в виде отдельных множественных "предъядрышек", разбросанных среди деконденсированных хромосом. Уже в конце телофазы такие аргентофильные предъядрышки начинают расти. Таким образом можно видеть, что во время митоза исчезновению подвергается только часть ядрышкового компонента, в то время как аргентофильный компонент сохраняется, постоянно существует во время митоза и переносится на хромосомах в дочерние ядра.
  Радиоавтографическими исследованиями было показано, что исчезновение ядрышек совпадает с прекращением синтеза клеточной (в основном рибосомной) РНК, который возобновляется в поздней телофазе, совпадая по времени с появлением новых ядрышек.
  Кроме того было обнаружено, что активность РНК-полимеразы I также исчезает на средних стадиях митоза. Это давало основание считать, что новообразование ядрышек связано с восстановление синтеза рРНК в дочерних клетках.
  Но с другой стороны существуют факты, указывающие на перманентное, постоянное присутствие ядрышковых компонентов течение всего клеточного цикла. Это относится к Ag-фильному материалу ядрышек в первую очередь.
  Цитологи начала ХХ века часто наблюдали во время митоза появление какого-то нехроматинового материала, окружающего каждую хромосому. Этот материал или "матрикс" митотических хромосом, как считали, мог иметь ядрышковое происхождение и его роль могла заключаться в том, что он может служить источником новых ядрышек в дочерних ядрах после митоза.
  Электронная микроскопия показала, что "матрикс" - нехроматиновый компонент митотических хромосом, состоящий из скопления рыхло расположенных фибрилл и гранул, имеющих рибонуклеопротеидную природу, морфологически сходных с компонентами, входящими в состав интерфазных ядрышек, выявляется в условиях конденсации митотических хромосом как растительного, так и животного происхождения. При этом некоторые компоненты ядрышек диссоциируют и уходят в цитоплазму (большая часть РНП-частиц), в то время как другие тесно связываются с поверхностью хромосом, образуя основу "матрикса" или, как этот компонент теперь называют, основу периферического хромосомного материала (ПХМ) (рис. 93). Этот фибриллярно-гранулярный материал, синтезированный до митоза, переносится хромосомами в дочерние клетки. В ранней телофазе еще в отсутствие синтеза РНК по мере деконденсации хромосом происходит структурное перераспределение компонентов ПХМ. Его фибриллярные компоненты начинают собираться в мелкие ассоциаты - предъядрышки, которые могут сливаться друг с другом, собираться в зоне ядрышкового организатора хромосом в поздней телофазе, где возобновляется транскрипция рРНК.
  Новый этап в изучении периферического материала митотических хромосом связан с использованием иммуноцитохимических методов выявления ядрышковых белков. Было показано, что митотические хромосомы действительно участвуют в переносе в дочерние клетки белков ядрышек, белков ядерного остова, так и различных РНП. Так было установлено, что ядрышковые белки, участвующие в транскрипции рРНК (РНК-полимераза I, топоизомераза I, фактор инициации транскрипции UBFи др.), аккумулируются в зоне ядрышкового организатора, в то время как белки, связанные с процессингом пре=рРНК (фибрилларин, нуклеолин, В-23), а также некоторая часть пре-рРНК и малые ядрышковые РНП переносятся поверхностью хромосом в составе периферического хромосомного материала (рис. 94).
  Кроме того в состав ПХМ могут входить некоторые негистоновые белки из состава ядерного интерфазного остова (рис.95).
  Следовательно митотические хромосомы участвуют не только в их главной функции - перенос генетического материала в виде ДНК - но, кроме того, участвуют в переносе целого ряда белков и РНК (рис. 96).
  Биологический смысл появления ПХМ на поверхности митотических хромосом может заключаться в том, что переносимые хромосомами белки не являются случайными "пассажирами", а представляют собой комплекс белков разного происхождения: ферменты и факторы ядрышковой транскрипции, процессинга рРНК, сборки рибосом, незрелые предшественники рибосом и, кроме того, белки ядерного и ядрышкового матрикса, также содержащие малые ядерные РНП и все компоненты, связанные с образованием нерибосомных РНК, с их сплайсингом и др. Другими словами, ПХМ переносит в новые ядра многие белковые компоненты и ферменты, что создает условия, необходимые для форсированного возобновления синтеза и созревания как рибосом, так и синтеза информационных РНК. Митотическая хромосома переносит в новое ядро не только генетическую информацию в виде ДНК хроматина, но и необходимые компоненты синтетического аппарата, готового к активации транскрипции в новом клеточном цикле. Хромосома при клеточном делении"все свое несет с собой" - как гласит латинская поговорка.
  Глава 9. Нерибосомные продукты клеточного ядра
  Транскрипция нерибосмных генов
  Информационные РНК образуются при участии РНК-полимеразы II,
  начинающей синтез со стартовой точки транскрипционной единицы, и кончая его в точке терминации. При этом образуется одна молекула РНК, транскрипт - предшественник информационной РНК. Размер транскрипционных единиц разных генов может значительно варьировать от 6 тыс. до 200 тыс. нуклеотидов. Поэтому суммарная фракция РНК, синтезированная на разных генах содержит молекулы различной длины. Эта первично синтезированная РНК или т.н. гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), встречается только в ядре и не обнаруживается в цитоплазме. В цитоплазму попадает уже информационная РНК, образующаяся в результате изменений в ядре первичных транскриптов РНК (гяРНК).
  Величина гяРНК в несколько раз больше той, которая требуется для синтеза белков: для синтеза "среднего белка", состоящего из 400 аминокислот, необходима матричная РНК в 1200 нуклеотидов. На самом деле величины информационных РНК в составе синтезирующих белок полисом в несколько раз короче первичных транскриптов. Это укорочение является результатом "созревания" гяРНК, процессинга, но иного характера, чем процессинг рибосомных РНК. Структура гена эукариотов оказалась состоящей из чередующихся последовательностей нуклеотидов, т.н. экзонов и интронов. Экзоны - участки ДНК, которые обладают кодирующей информацией и входят в состав информационных РНК, а интроны содержат последовательности, не входящие в информационную РНК. Первичный транскрипт РНК содержит полную копию гена, включает в себя все последовательности и экзоны и интроны. Интроны впоследствии вырезаются из первичного транскрипта, концы же фрагментов РНК сшиваются ковалентно, что приводит к общему укорачиванию образовавшейся молекулы информационной РНК. Этот процесс получил название сплайсинга. Так как большинство генов млекопитающих содержит большее число интронов, чем экзонов, процесс сплайсинга РНК приводит к тому, что очень длинные молекулы гяРНК (первичных транскриптов, содержащих более чем 50 000 нуклеотидов) укорачиваются до длины цитоплазматических иРНК (обычно от 500 до 3000 нуклеотидов длиной) (рис. 97).
  По мере синтеза и роста гяРНК, она связывается с рядом ядерных белков, образуя гяРНП-частицы (гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые частицы). При этом высокомолекулярная гяРНК в ядрах наматывается на глобулярные белковые частицы, информоферы. На каждый информафер приходится отрезок РНК длиной около 500-600 нуклеотидов. Такой комплекс информофера и РНК образует мономер или 30S частицу. В состав каждого информофера входит более 30 белковых молекул информатина. Таким образом первичный транскрипт структурного гена, отвечающего за образование информационной РНК, представляет собой гигантскую молекулу гяРНК, связанную со множеством белковых частиц, информофер. Считается, что участки гяРНК, между информоферами, могут быть использованы для сплайсинга с помощью специальных белковых комплексов - сплайсосом. В состав сплайсосом входит 5-7 малых ядерных рибонуклеопротеидов (snRNP).Эти особые малые ядерные РНП (мяРНП) представляют собой РНП-частицы (U1, U2, U5, U4, U6 snRNP) с константой седиментации около 10S. В каждой частице содержится одна малая молекула РНК (90-400 нуклеотидов) и около семи молекул белка. Так что сплайсосома представляет собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс величиной, сравнимой с рибосомой (константа седиментации около 60S).
  При синтезе гяРНК и после него сплайсосомы связываются с цепью РНК в местах на границе между экзонами и интронами, специфически узнавая эти места, производят разрыв в основании петлиинтрона, сшивают свободные концы (рис. 98). Таким способом участки интронных последовательностей вычленяются из состава первичного транскрипта, а затем быстро деградируют в ядре. В результате этого процесса длина результирующей молекулы РНК может укорачиваться в несколько раз. Так, например, размер гена белка тироглобулина включает 300 тыс. нуклеотитов, размер же иРНК для этого белка составляет всего 8,7 тыс. нуклеотидов из-за того, что в составе гена включены 36 интронных последовательностей, т.е. происходит укорочение молекул РНК более чем в 30 раз. Размер гена каталазы равен 34 т.п.н., а размер иРНК - 1,6 т.п.н. Величина овальбуминового гена у птиц составляет 7,5 т.п.н., а соответствующая этому гену зрелая иРНК - всего 1,8 т.п.н. Обычно иРНК в 2,5-10 раз короче первичного транскрипта, гяРНК.
  Считается, что после созревания иРНК, при переходе ее из ядра в цитоплазму теряет белки, входящие в состав информофера, "переодевается" в ядерной поре, а белки информофер остаются в ядре. В цитоплазме иРНК снова одеваются новыми белками,образуя "информосомы" - форму хранения иРНК в неактивном состоянии, или связываются с белками, необходимыми для трансляции.
  Морфология РНП-компонентов в ядре
  Вся информация, полученная о морфологии транскриптов рРНК и иРНК, об информоферах и сплайсосомах получена на изучении выделенных из ядер этих компонентов, подвергнутых специальной обработке для распластывания их на препаратах для электронной микроскопии.
  Что же касается морфологии РНП-продуктов in situ, в объеме интактных ядер, то здесь информация неполная и противоречивая.
  Кроме хорошо выраженного ядрышка, другие продукты ядерной активности при изучении клеток на ультратонких срезах не бросаются в глаза: их трудно отличить от различных фибрилл (ДНП, матрикс)и каких-то гранул, казалось бы без особого порядка разбросанных в ядре. Все же, используя метод избирательного контрастирования солями урана структур, содержащих РНК, удается выделить ряд компонентов, которые можно отнести к неядрышковым продуктам транскрипции. Это - перихроматиновые фибриллы, перихроматиновые гранулы и интерхроматиновые гранулы (рис. 99б, 100).
  Перихроматиновые фибриллы обнаруживаются по периферии участков конденсированного хроматина (околомембранного или любого другого). Они имеют толщину около 3-5 нм, часто образуют рыхлую неправильную сеть. Оказалось, что этот компонент ядра сильно изменяется при стимуляции синтеза РНК. Так, при возрастании синтеза РНК в клетках печени крыс после голодания и последующего питания или после введения кортизона адреналэктомированным животным зоны перихроматиновых фибрилл значительно увеличиваются. Эти зоны оказались наиболее активными по включению меченых предшественников в РНК, что было показано радиоавтографически с помощью электронного микроскопа. Такие фибриллы могут представлять новосинтезированную гяРНК.
  Другой тип РНК-содержащих структур интерфазного ядра - перихроматиновые гранулы. Они имеют диаметр около 45 нм и окружены светлым ореолом. Эти гранулы встречаются только на периферии конденсированного хроматина, в диффузном хроматине их нет. Считается, что между этими гранулами и перихроматированными фибриллами существует структурная связь. При больших увеличениях внутри гранул можно видеть тонкие извитые фибриллы 3-5 нм толщиной.
  Крупные гранулы типа перихроматиновых встречаются в специфических активных в отношении синтеза РНК участках политенных хромосом, в пуффах (см. ниже). Сходные гранулы обнаружены в боковых петлях функционирующих мейотических хромосом. Исходя из этого, некоторые исследователи делают предположение, что такие рибонуклеопротеидные гранулы могут представлять собой зрелые комплексы из нескольких информофер, рибонуклеопротеидные частицы, содержащие информационную РНК. Однако это предположение нуждается в проверке.
  Интерхроматиновые гранулы - третий тип РНК-содержащих структур. Они имеют размер 20-25 нм и группируются всегда в форме скоплений между участками хроматина. Эти гранулы не стандартны по величине и переплетены тонкими фибриллами.
  В последнее время были получены антитела к мяРНП. Оказалось, что среди них есть и различные сплайсосомы, гранулы размером 20-30 нм. Эти мяРНП располагались в зонах свободных от конденсированного хроматина и по своей локализации совпадали с зонами, где располагались скопления интерхроматиновых гранул. Они могут представлять собой скопление сплайсосом, участвующих в конечных стадиях созревания гяРНК.
  В таком случае всю картину динамики синтеза гяРНК можно представить себе следующим образом. Деконденсирующиеся участки хроматина (эухроматин) по периферии конденсированных зон хроматина, связываясь с РНК-полимеразой II, транскрибируют гяРНК в виде начальных перихроматированных фибрилл, связывающихся с белками информофер, которые затем подвергаясь созреванию с участием сплайсосом (интерхроматиновые гранулы), дают начало зрелым формам иРНК - комплексам информофер, или перихроматиновым гранулам. Вероятно, не все зрелые иРНК могут переходить в крупные (45-60 нм) перихроматиновые гранулы, а последние, вероятно, характерны для РНК с высоким молекулярным весом.
  Иную топографию в интерфазных ядрах имеют РНП-продукты растительных клеток. Так, в ядрах с хромонемной организацией интерфазного хроматина, РНП в виде крупных гранул (20-30 нм) и тонких фибрилл (6-8 нм) располагается по периферии такого конденсированного хроматина и в межхроматиновых зонах; создается впечатление, что вся периферия хромонемных участков хроматина вовлечена в синтез РНК (рис. 100б).
  Были сделаны попытки изучить морфологию транскрипции нерибосомных генов на тотальных плоскостных препаратах. Для этого из гомогенатов ядер осаждали фракцию диффузного хроматина, обогащенного включенными мечеными предшественниками РНК. Активный хроматин на таких препаратах имел вид типичных нуклеосомных фибрилл с редко сидящими одиночными гранулами РНК-полимеразы, от которых отходили транскрипты РНК разной длины и конфигурации (рис. 101). Обычно это были изогнутые фибриллы, иногда имеющие на свободном конце глобулярные образования. Чаще всего расстояние между одиночными гранулами РНК-полимеразы доходило до 0,1-0,3 мкм, так что представлялось, что с гена транскрибируется лишь одна копия, в отличие от множественных копий, получаемых с генов рРНК. Но однако, в редких случаях обнаруживались участки хроматина с тесно расположенными РНК-полимеразами, от которых отходили в сторону транскрипты разной длины, образуя "елочко"-подобные структуры.
  Попытки наблюдать морфологию транскрипции на определенных генах были сделаны на целом ряде объектов, включая политенные хромосомы двукрылых насекомых и мейотические профазные хромосомы.
  Синтез РНК в пуфах политенных хромосом
  Более полные представления о морфологии синтеза и образования конечных продуктов транскрипции определенных генных участков интерфазных хромосом были получены при изучении политенных хромосом.
  Светооптическое изучение строения политенных хромосом двукрылых обнаружило, что кроме дисков и междисковых участков встречаются локальные расширения хромосом, т.н. пуфы. В этих участках ДНК не располагается в виде дисков, они имеют аморфную структуру, часто содержат РНК, базофильны. В пуфах происходит основное включение 3Н-уридина, что однозначно показывает, что они являются активными участками этих своеобразных интерфазных хромосом.
  Количество пуфов и их локализация не являются постоянной характеристикой той или иной политенной хромосомы. Более того, рисунок пуфирования (т.е. расположение пуфов на хромосомах) разный на одной и той же хромосоме в зависимости от стадии развития личинки, или от типа клеток, взятых для исследования.
  Так как возникновение пуфов прямо связывается с активацией синтеза РНК, то было показано, что развитие определенного пуфа отражает собой активацию отдельного или группы генов, детерминирующих функционально-метаболические особенности клеток на данном этапе развития. Поэтому в различных дифференцированных клетках картина пуффинирования не должна совпадать, что и наблюдается на самом деле (рис. 102).
  При затухании синтеза РНК пуф начинает спадаться, уменьшаться в размерах, терять базофилию и в конце концов на его месте можно видеть диск, из которого он развился. Особенно демонстративно это видно на особо крупных пуфах 4-ой хромосомы Chironomus, которые носят название колец Бальбиани (КБ). Так на личиночной стадии можно видеть на 4-ой хромосоме вблизи от ядрышка два постоянных базофильных пуфа, КБ1 и КБ2.
  В электронном микроскопе было обнаружено, что зона этих крупных пуфов содержит большое количество гранул рибонуклеопротеидной природы, размером 50-60 нм. Эти гранулы, предположительно содержащие информационную РНК и соответствующие информосомам в составе кольца Бальбиани 2 (КБ2), располагаются особым образом. На ультратонких срезах можно наблюдать, что они располагаются рядами вдоль осевых элементов. Каждая гранула оказалась связанной с осевой структурой с помощью ножки-фибриллы толщиной 14-16 нм (рис. 103). Эта картина соответствует предположению, что 50-60 нм гранулы представляют собой РНП-продукты данного хромосомного локуса, находящиеся в процессе их синтеза. На плоскостных препаратах по Миллеру такие участки КБ2 были представлены многочисленными "елочко"-подобными структурами, состоящими из осевых компонентов и отходящих от них многочисленных гигантских траснкриптов, имеющих длину до 7,7 мкм. От участка транскрипции в данном случае отходит в среднем 123 гигантских транскрипта, связанных с комплексами РНК-полимеразы.
  Расшифровка этих морфологических наблюдений стала возможной при анализе индивидуальных РНК, выделенных из КБ2. Для этого с помощью микроманипулятора выделяли ядра, затем отделяли от других 4-ую хромосому, и с помощью микродиссекции вырезали и накапливали зоны, содержащие КБ2. Затем из этих пуфов выделялась РНК, которая исследовалась с помощью гель-электрофореза. Выделенная РНК оказалась огромных размеров, она имела мол. вес 15-35 х 106 Д, и коэффициент седиментации 75S. Соответственно гены этой 75S РНК содержат 37 т.п.н., вероятно не имеют интронов, т.к. 75S РНК не подвергается процессингу и служит матрицей для синтеза гигантских молекул секреторных белков. Гены 75S РНК оказались построены наподобие сателлитных ДНК: в их составе наблюдается иерархия внутренних повторов.
  После завершения синтеза 75S РНК, ее молекулы в виде крупных (50-60 нм) РНП-гранул транспортируются в цитоплазму. Однако значительная их часть разрушается: только 4-7% этой РНК обнаруживается в цитоплазме. Эти гигантские молекулы РНК образуют в цитоплазме особо крупные полисомы (700S), в состав которых входит 55-65 рибосом, на которых синтезируются длинные цепочки гликопротеидов клеток слюнной железы мотыля. (На самом деле эта железа не участвует в пищеварении, она не содержит ферментов; ее функция заключается в синтезе белка, необходимого личинке для построения домика и ловчих сетей).
  Транскрипция на мейотических хромосомах
  Мейотические хромосомы типа "ламповых щеток" (см. ниже) встречаются главным образом на стадии диплотены мейоза, как у самцов, так и у самок. По сравнению с митотическими хромосомами мейотические хромосомы типа ламповых щеток намного длиннее и хорошо видны в световом микроскопе по двум причинам: она представляют собой спаренные и удвоенные хроматиды, так что в их состав входит четыре продольных субъединицы. Но отличительной особенностью этих хромосом является наличие боковых петель, отходящих от множества хромомеров, попарно-симметрично располагающихся вдоль каждого гомолога (рис. 104). Именно в петлях хромосом типа ламповых щеток происходит синтез РНК во время длительной мейотической профазы.
  Следовательно, хромосомы типа ламповых щеток занимают как бы промежуточное положение между инактивированными максимально конденсированными хромосомами и активными интерфазными хромосомами: конденсированные участки хромомеров соответствуют участкам митотических хромосом, а боковые петли - участкам активных интерфазных хромосомных районов. Считается, что число боковых петель соответствует числу хромомеров, за исключением того, что хромомеры, представляющие центромерные участки, петель не несут. Так у гребенчатого тритона, чьи хромосомы типа ламповых щеток особенно подробно изучены, насчитывается около 5000 хромомеров на гаплоидный набор и соответственно 20 000 боковых петель на диплотенную митотическую хромосому (напомним, что в профазе мейоза клетки содержат тетраплоидное количество хроматид).
  Латеральные или боковые петли в составе хромосом типа ламповых щеток неоднородны по своей структуре. Преобладают ординарные или нормальные петли длиной около 10 мкм. Они асимметричны по своей толщине: в световом микроскопе видно, что один из концов петли тонкий, а другой толстый; развернутая петля имеет клиновидную форму. В составе ординарных петель в световом микроскопе видно, что каждая петля покрыта как бы чехлом или матриксом, имеющим неясную гранулярно-фибриллярную структуру.
  ДНК входит в состав осевого элемента петель и представляет собой основную хромосомную ДНК. Это доказывалось тем, что как боковые петли, так и осевые компоненты диплотенных хромосом рвутся при обработке ДНКазой.
  Боковые петли способны к синтезу РНК: включение 3H-уридина происходит практически во всех петлях по всей их длине. Новосинтезированная РНК в петлях быстро ассциирует с белками, заранее синтезированными в цитоплазме.
  При изучении ординарных петель на ультратонких срезах было найдено в их составе большое количество гранул 25-40 нм величиной, сходных с интер- и перихроматиновыми гранулами интерфазного ядра и с гранулами в пуфах политенных хромосом.
  Более подробно структура боковых петель была изучена в электронном микроскопе на препаратах распластанных диплотенных хромосом.
  Оказалось, что общая морфология транскрипции на боковых петлях хромосом типа ламповых щеток удивительно напоминает таковую на рибосомных цистронах (рис. 104). Большинство ординарных боковых петель представляет собой одну транскрипционную единицу, начало транскрипции которой расположено на одном конце петли, а терминальный участок - на другом. Таким образом такая транскрипционная единица тоже имеет форму "елочки", только изогнутой в виде петли. Здесь также наблюдается линейный градиент транскриптов: короткие в начале, и максимально длинные (до нескольких десятков нм) на концах транскрипционных единиц.
  Транскрипты здесь представлены в виде рибонуклеопротеидов. В результате воздействия низких ионных сил они из глобул величиной 25-40 нм превращаются в вытянутые, изогнутые фибриллы, часто на конце имеющие утолщение. Морфология транскриптов на разных петлях неодинаковая. Встречаются расправленные, линейные фибриллы, а также кустистые фибриллы, многократно сложенные сами на себя, вероятно, в результате образования дуплексных структур РНК.
  В некоторых петлях может располагаться несколько транскрипционных единиц разной длины, могущих иметь как идентичную, так и оппозитную ориентацию транскрипции (рис. 105). Интенсивность транскрипции также неодинакова на различных петлях: встречаются петли с 30 транскриптами на 1 мкм и с 3-5.
  При падении транскрипционной активности в естественных условиях или при экспериментальном подавлении синтеза РНК длина петель уменьшается, они приобретают нуклеосомное строение.
  Морфология транскрипции индивидуальных генов
  Недавно был предложен более прогрессивный подход для исследования морфологии транскрипции индивидуальных структурных (кодирующих полипептидные цепи) генов. Для этого были использованы ооциты X. laevis, в ядрах которых с помощью микроинъекций можно вводить любые молекулы, в том числе и ДНК. Если же для такого введения взять клонированные гены, то получая препараты по Миллеру, можно обнаружить отдельные от ядрышек и хромосом молекулы ДНК, которые в условиях высокой транскрипционной активности в ядрах ооцитов, в свою очередь вовлекаются в процесс транскрипции. Это и дает возможность наблюдать за транскрипционной активностью индивидуального гена.
  Так в ядра ооцитов были инъецированы небольшие циклические молекулы клонированных генов овальбумина кур. Инъекция большого количества этих генов (2-5 нг на ядро) приводили к тому, что в ядре образовывались кластеры из нескольких сот циклических молекул, хорошо отличающихся от элементов собственного хроматина ооцитов. Оказалось, что 80-90% инъецированного материала неактивны. В этом случае индивидуальные циклические молекулы генов были сплошь покрыты нуклеосомами и не содержали транскрипционных комплексов (РНК-полимераза вместе с цепочкой синтезированной РНК).
  Небольшая часть инъецированных генов, однако, обладала типичными транскрипционными комплексами. Среди таких активированных генов встречается, по крайней мере, три морфологических класса. В первом случае это были циркулярные молекулы со слабой транскрипцией (3-10 транскриптов на 1 мкм длины хроматина), транскрипты были разной длины и не обладали линейным градиентом. В другом случае наблюдали интенсивно транскрибируемые циклические участки хроматина, покрытые транскрипционными комплексами по всей длине молекулы ДНК (30-50 транскриптов на 1 мкм хроматина). Здесь транскрипты достигали длины до 1,2 мкм. РНК на интенсивно транскрибируемых участках всегда была расположена по градиенту длины, образуя участки, напоминающие "елочки" на транскрипционных единицах ядрышковых ДНК. Первичный транскрипт с клонированного гена овальбумина кур содержит участки кодирующих последовательностей (экзоны) и интроны. На подобных препаратах в тесной ассоциации с нитчатыми транскриптами бывают видны также глобулярные сплайсосомы.
  Таким образом, удается наблюдать за работой любых индивидуальных генов.
  Синтез транспортных РНК
  Гены транспортных РНК относятся к умеренно повторяющимся (10-100) последовательностям в геноме. Они также как р-гены, располагаются тандемно. Длина разных (31 шт.) тРНК колеблется от 74 до 95 нуклеотидов (примерно 30 нм), уложенных в сложную трехмерную фигуру. Отдельный ген тРНК состоит из двух крайних экзонов и одного центрального интрона. Во время процессинга интрон удаляется, а два экзона с помощью фермента лигазы соединяются в зрелую молекулу.
  Глава 10. Ядерная оболочка
  Структура, ограничивающая параметр клеточного ядра, ядерная оболочка, характерна для эукариотических клеток. Она разделяет два внутриклеточных компартмента друг от друга, цитоплазму от ядра. Значение такого разделения структур в пространстве очень важно: это приводит к обособлению процессов синтеза белка и процессов синтеза нуклеиновых кислот, что создает дополнительные, по сравнению с прокариотами, возможности для регуляции генной активности и ее реализации в виде синтеза специфических белков. Активная регуляция транспорта из цитоплазмы в ядро и из ядра в цитоплазму, через специальные комплексы пор создает систему избирательного транспорта веществ, делая ядерную оболочку "генными воротами" со специальными "превратниками" (контрольными пунктами), регулирующими потоки ядерного импорта и экспорта. Кроме того, как уже описывалось, ядерная оболочка играет большую роль в организации трехмерной структуры интерфазного ядра, элементы ядерной оболочки являются частью ядерного белкового матрикса.
  Ядерная оболочка состоит из двух мембран, внешней и внутренней, между которыми располагается перинуклеарное пространство (рис. 106). Внутренняя мембрана ядерной оболочки структурно связана с ламиной - фиброзным периферическим слоем ядерного белкового матрикса. В общем виде ядерная оболочка может быть представлена как двухслойный мешок, отделяющий содержимое ядра от цитоплазмы. Однако ядерная оболочка имеет характерную особенность, отличающую ее от других двухмембранных структур клетки (митохондрии и пластиды). Это наличие особых ядерных пор, которые образуются за счет многочисленных зон слияния двух ядерных мембран и представляют собой как бы округлые, сквозные перфорации всей ядерной оболочки.
  Компоненты ядерной оболочки
  Внешняя мембрана ядерной оболочки, непосредственно контактирующая с цитоплазмой клетки, имеет ряд структурных особенностей, позволяющих отнести ее к собственно мембранной системе эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Так, на внешней ядерной мембране обычно располагается большое количество рибосом, как и на мембранах эргастоплазмы. Существуют многочисленные наблюдения о непосредственном переходе внешней ядерной мембраны в систему каналов эндоплазматического ретикулума, что особенно подчеркивает структурную идентичность этих мембран (рис. 106).
  Так у клеток, бедных эндоплазматическим ретикулумом, внешняя ядерная мембрана может представлять собой "минимальный" объем эндоплазматического ретикулума, который может участвовать в синтезе белкового и липидного компонентов мембран. Описаны случаи, когда от внешней ядерной мембраны отщепляются мембранные вакуоли, направляющиеся в проксимальный отдел аппарата Гольджи. Состав липидов и белков внешней ядерной мембраны очень схож с таковым ретикулума, что, возможно, и определяет их общие биохимические функции, что особенно подчеркивается наличием рибосом на поверхности мембран, обращенной в гиалоплазму. Эти рибосомы синтезируют, как мембранные, так и секретируемые белки, которые могут транспортироваться в перинуклеарное пространство, а оттуда в полости цистерн ЭПР. Так, например, при стимуляции образования ?-глобулинов в плазмоцитах первые продукты клеточной активности локализуются в перинуклеарном пространстве, а потом начинают появляться в полостях ЭПР. У большинства животных и растительных клеток внешняя мембрана ядерной оболочки не представляет собой идеально ровную поверхность - она может образовывать различной величины выпячивания или выросты в сторону цитоплазмы.
  Внутренняя мембрана ядерной оболочки рибосом на своей поверхности не имеет, но связана с фиброзным слоем, ядерной ламиной (Lamina nucleum limitans), которая, в свою очередь, заякоревает хроматин на ядерной оболочке. Связь хроматина с внутренней мембраной оболочки является ее характерной особенностью, хотя существуют примеры, когда эти связи нарушаются при сохранении целостности ядерной оболочки. Так, например, в ооцитах амфибий на стадии диплотены все хромосомы собираются в центре ядра и полностью теряют связь с ядерной оболочкой. С другой стороны, при делении клеток с т.н. закрытым типом митоза большая часть внутренней ядерной мембраны теряет связь с хроматином.
  О специфичности белков ламины уже говорилось в разделе "Ядерный белковый матрикс", здесь же необходимо еще раз подчеркнуть, что эти фибриллярные белки не образуют неизменную структуру. Фиброзный слой ламины все время перестраивается, особенно в связи с ростом поверхности ядра, во время клеточного цикла. Характерные для внутренней ядерной мембраны белки ламины A, C и B относятся к фибриллярным белкам V типа промежуточных филаментов (см. ниже), их фибриллярные мономеры могут образовывать димеры, тетрамеры, а последние образуют фибриллы толщиной около 10 нм. Со стороны кариоплазмы под внутренней ядерной мембраной такие фибриллы образуют ортогональные структуры, чередующиеся с рыхло расположенной сетью этих же фибрилл.
  Белки ламины с мембраной связаны двояким образом. Так ламин B после синтеза модифицируется добавлением гидрофобной изопентильной группы вблизи C-конца. Эта липофильная группа встраивается в слой мембраны и как бы заякоревает ламину на мембране. Кроме того целый ряд интегральных белков внутренней ядерной мембраны (LBR, LAR, эмерин и др.) также закрепляют ламины посредством дополнительных белков, входящих в состав этого фиброзного слоя. Эти же белки участвуют в связывании ядерной мембраны с хроматином.
  Наиболее характерной и бросающейся в глаза структурой в составе ядерной оболочки является ядерная пора. Поры в оболочке образуются за счет двух ядерных мембран в виде округлых сквозных отверстий или перфораций с диаметром около 100 нм. При альдегидной фиксации или при использовании метода замораживания и скалывания в электронном микроскопе видно, что округлое сквозное отверстие в ядерной оболочке заполнено сложно организованными глобулярными и фибриллярными структурами (рис. 107). Совокупность мембранных перфораций и этих структур называют комплексом пор ядра. Тем самым подчеркивается, что ядерная пора не просто сквозная дыра в ядерной оболочке, через которую непосредственно вещества ядра и цитоплазмы могут сообщаться. Компоненты комплекса пор имеют белковую природу.
  Ядерный поровый комплекс (ЯПК или NPC - nuclear pore complex) представляет собой супрамолекулярную структуру с м.в. более 125 х 106 Да, состоящую из более 1000 белков, масса которых в 30 раз больше чем рибосома. Белки ЯПК носят название нуклеопоринов 50-100 видов. Эти белки собраны примерно в 12 субкомплексов.
  В последнее время удалось получить отчетливые изображения ЯПК в электронном микроскопе, что дает возможность понять их структурную организацию. Внешний диаметр порового комплекса составляет около 100 нм, а высота - 75 нм. В целом он представляет собой цилиндрическую фигуру с признаками октогональной симметрии. Несмотря на очень впечатляющие изображения выделенных ЯПК, разные авторы дают разные схемы строения этого сложного комплекса, обладающего симметрией восьмого порядка.
  Если посмотреть на ЯПК в плане на ультратонком срезе, то бросается в глаза, что его периферия представлена восьмью глобулами (рис. 108, 109). На выделенных же ЯПК в первую очередь видны кольчатые структуры. От периферических компонентов ЯПК в сторону цитоплазмы простираются фибриллярные выросты. Со стороны ядра тоже фибриллярные выросты образуют корзинкоподобную структуру, связанную терминальным кольцом. В большинстве моделей центр цилиндрической фигуры ЯПК содержит "пробку" (центральную гранулу, или транспортер). По одной из моделей (см. рис. 93) цитоплазматические филаменты отходят от цитоплазматического кольца, состоящего из 8 субъединиц. Между ним и внешней ядерной мембраной располагается тонкое кольцо, а затем звездчатое кольцо. Цитоплазматическое кольцо связано внутренними филаментами с транспортером, который находится в центре и заполняет пространство между внешней и внутренней ядерной мембраной. Сходная структура находится на внутренней мембране: нуклеоплазматическое кольцо поддерживает филаменты "корзины". Другие варианты моделей показаны на (рис. 110).
  Весь ЯПК закрепляется интегральными белками, гликопротеидами gp 210 и РОМ 121 в стенке мембранной перфорации.
  По своей сложности организации и, главное, по функциональной значимости комплекс ядерной поры можно было бы отнести к органеллам клетки, т.к. их роль заключается в контроле за ядерно-цитоплазменными связями.
  Размер ядерных пор и их структура стандартны не только для данной клетки, но и для всех клеток данного организма, более того для всех эукариот.
  Число ядерных пор (см. табл. 13) зависит от метаболической активности клеток: чем выше синтетические процессы в клетках, тем больше пор на единицу поверхности клеточного ядра. Так, у эритробластов (клетки-предшественники ядерных эритроцитов) низших позвоночных животных во время интенсивного синтеза и накопления гемоглобина обнаруживается в ядре около 30 ядерных пор на 1 мкм2. После того как эти процессы заканчиваются, в ядрах зрелых клеток - эритроцитов прекращаются синтезы ДНК и РНК, и количество пор падает до 5 на мкм2. В ядерных оболочках полностью зрелых сперматозоидов поры не обнаруживаются, так же как у микронуклеусов некоторых инфузорий. Количество пор может изменяться в течение клеточного цикла. Первое возрастание числа пор наблюдается при реконструкции и росте ядер после митоза, второй этап увеличения числа пор происходит во время синтеза ДНК.
  Таблица 13. Количество ядерных пор в различных объектах
 Объект Число ядерных пор на мкм2. Число пор на одно ядро Ксенопус, почки 10,05 3400 Ксенопус, ооцит 51,0 37,6 х 106 Мышь, культура ткани 10,83 5050 Человек, культура ткани 11,24 3930 Крыса, гепатоцит 16,1 3800 Мышь, лимфоцит 3,3 400 Человек, лимфоцит 4,47 700
  По поверхности ядра поры располагаются более или менее равномерно, но их число резко падает в местах ассоциации с ядерной оболочкой участков гетерохроматина, ядрышкового организатора, теломерных участков.
  Поровые комплексы могут встречаться и в других мембранных компонентах клетки, но гораздо реже, чем в ядерной оболочке. Иногда поровые комплексы видны в составе мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума. Они обнаруживаются в составе окончатых мембран цитоплазмы, которые представляют собой тесно расположенные пачки замкнутых плоских мембранных мешков, сплошь пронизанных поровыми комплексами, имеющими такую же структуру, как и поры в ядерной оболочке.
  Интересные данные были получены при морфометрическом изучении поровых комплексов в ядрах и окончатых мембранах бластодермы эмбрионов дрозофилы. Оказалось, что при переходе от синцитиальной к целлюлярной стадии, количество пор в оболочках ядер остается неизменным, а количество пор в окончатых пластинках вырастает примерно в 10 раз. В дальнейшем окончатые мембраны полностью исчезают. На основании этого было сделано предположение, что на ранней стадии развития в бластодерме дрозофилы происходит "суперпродукция" поровых комплексов (или их компонентов), избыток которых "встраивается" в окончатые мембраны. Т.е. макромолекулярный ансамбль, составляющий комплекс ядерных пор, способен к автономной самосборке и к последующему встраиванию в различные мембранные системы.
  Роль ядерной оболочки в ядерно-цитоплазматическом обмене
  Со времени открытия ядерной оболочки и описания ее строения делалось заключение о том, что ядерная оболочка может служить регулятором в ядерно-цитоплазматическом обмене и главная роль в этих процессах отводилась ядерным порам. Обмен же продуктами между ядром и цитоплазмой в самом деле очень велик: все ядерные белки поступают в ядро из цитоплазмы и все формы РНК выводятся из ядер. И в этом процессе комплекс поры выступает как супрамолекулярный комплекс, выполняющий роль не только транслокатора, механизма переноса, но и роль сортировщика, узнающего и отбирающего специальным образом переносимые молекулы.
  В процессе ядерно-цитоплазматического транспорта ядерные поры функционируют как некоторое молекулярное сито, пропуская частицы определенного размера пассивно, по градиенту концентрации. Так, ионы, сахара, нуклеотиды, АТФ, гормоны - свободно поступают в ядра. С другой стороны ядерные поры осуществляют избирательный транспорт.
  Через ядерную оболочку беспрепятственно в обе стороны происходит пассивный транспорт высоко молекулярных соединений, имеющих массу не более 5 х 103 дальтон. Для определения размеров частиц, могущих пройти сквозь пору, используются гранулы декстрана или коллоидного золота, которые путем микроинъекции вводятся в цитоплазму живой клетки. Было обнаружено, что максимальный размер частиц, способных транспортироваться в ядро составляет 8,5-10 нм. При этом сначала частицы собираются в зоне поровых комплексов, а затем оказываются в ядре. Неядерные белки с массой большей, чем 20 000-40 000 дальтон проникают в ядро медленнее, если вообще проникают. Так инъецированные белки с массой 17 кД могут проникнуть в ядро довольно быстро, за 2-3 минуты, белки 40 кД - за 30 минут, белки 60 кД - вообще не проникают в ядра. Считается, что белки с гидродинамическим радиусом больше 3,5 нм (что соответствует глобулярному белку с массой 65 кД), не могут просто механически проходить через ядерную пору. В этих случаях ядерная пора выступает в качестве реального молекулярного сита.
  Но дело осложняется тем, что многие белки поступают как в ядро, так и выходят из него против градиента концентраций. Так, например, концентрация гистонов в ядре значительно выше, чем в цитоплазме. Но, несмотря на это, во время синтеза ДНК происходит транспорт огромного количества (106 молекул каждые три минуты, или по 100-500 молекул через одну пору за 1 минуту) гистонов из цитоплазмы в ядро. С другой стороны через ядерные поры реально могут проходить некоторые белки и даже макромолекулярные комплексы с массой значительно большей, чем 60 кД.
  Через ядерные поры из цитоплазмы в ядро транспортируются крупные молекулы белков, например, белок нуклеоплазмин, пентамер с молекулярной массой 125 кД. Из ядра через поры выходят в цитоплазму субъединицы рибосом и другие рибонуклеопротеиды, меньшие из которых могут иметь массу 250 кД. Эти данные показывают, что комплексы ядерных пор не представляют собой просто механические сита, которые ограничивают транспорт молекул в зависимости от их размеров.
  Работы последнего времени показывают, что многие ядерные белки проходят через ядерные поры с помощью специальных механизмов, включающих узнавание и связывание крупных ядерных белков, а затем только их транслокацию, перенос через поры. Было найдено, что белки, транспортируемые в ядро, имеют определенные последовательности аминокислот - последовательности ядерной локализации (NLS), которые узнаются рецепторами ядерных пор. Такие NLS характерны для кариофильных белков, т.е. для белков ядерной локализации, которые синтезируются на рибосомах в цитоплазме, а затем транспортируются в ядро.
  Импорт кариофильных белков
  Впервые аминокислотные последовательности ядерной локализации были обнаружены на С-конце субъединиц молекулы нуклеоплазмина (ядерный белок, принимающий участие в структуризации хроматина). Эти эксперименты были проведены на бесклеточной системе, когда выделенные ядра помещались в цитоплазматический экстракт ооцитов ксенопуса, куда добавляли нативные или измененные молекулы нуклеоплазмина. Это крупный белок (125 кД), состоящий из пяти субъединиц, каждая из которых обладает глобулярной и фибриллярной, С-концевой, частями. Если удалит путем протеолиза примерно 50 аминокислот с С-конца, то ни пентамер, ни мономеры в ядро не попадают, в то время как отщепленные фибриллярные участки через поры проходят свободно, так как содержат NLS-участок.
  Более того, при смешивании неядерных белков с этими NLS-фрагментами, такие комплексы способны транспортироваться в ядро. Даже крупные частицы декстрана (20 нм), неспособные проникать в ядро, при связывании с ними NLS-последовательностей нуклеоплазмина транспортировались из цитоплазматического экстракта в ядро.
  Подробно строение NLS изучено у белка Т антигена вируса SV40. Кариофильный сигнал состоял из последовательности: Pro-Lys-128Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Одна лишь аминокислотная замена (128Lys на Thr или Asp) полностью лишают этого фрагмента кариофильных свойств. Оказалось. что можно создавать химерные белки с этим аминокислотным доменом, что позволяет необычные для ядер белки (альбумин плазмы, иммуноглобулин G, и даже ферритин с мол. массой 465 кД) транспортировать через ядерные поры.
  Было показано, что белок с NLS проходит в ядро через несколько этапов (рис. 111). Импорт начинается с того, что NLS-белок связывается с гетеродимером рецептора NLS, с белками импортинами ? и ?, локализованными в цитоплазме. Возникший белковый комплекс (импортируемый белок с NLS, связанный с импортинами ? и ?) подходит к внешней ядерной мембране и закрепляется на цитоплазматических филаментах порового комплекса. Затем этот комплекс входит в ядерную пору и проходит через "транспортер". Считается, что транспортер состоит из множества извитых белковых филаментов, обогащенных аланином и глицином (FG-филаменты), представляющих собой барьер для транспорта некариофильных белков. Комплекс же, имеющий NLS как бы разрыхляет эту сеть и проходит через канал транспортера. После перехода комплекса в нуклеоплазму импортин ? связывается с белком RAN, представляющего собой малую GTP-азу, что приводит к распаду комплекса. Импортируемый белок освобождается и остается в ядре, импортин ? возвращается в цитоплазму, так же как и импортин ?, но в связи с RAN-GDP, где последние также диссоциируют. Тем самым только белок с NLS остается в составе ядра (рис. 111).
 Экспорт из ядра в цитоплазму
  Из ядра в цитоплазму также существует поток как белков, так и ядерных транскриптов в виде рибонуклеопротеидов. В принципе этот экспорт своей организации сходен с процессом импорта кариофильных белков. Так было обнаружено, что гликопротеидные молекулы, связывающие лиганды, локализуются в место поровых комплексов и со стороны ядра. Одна и та же пора может принимать участие как в импорте, так и в экспорте макромолекул. В пользу этого говорит то, что частички коллоидного золота, связанного с нуклеоплазмином, сорбируются на ядерной поре со стороны цитоплазмы, одновременно с сорбцией частичек, связанных с РНК, инъецированных в ядре ооцитов. Подобные эксперименты показали, что многие РНК (тРНК, 5S РНК, поли-У и поли-А), связанные с коллоидным золотом, аккумулируются в зоне ядерных пор, а затем переносятся в цитоплазму. Более того, РНК способствует переносу через ядерную пору крупных частиц золота размером до 20 нм. Обратного переноса не происходит: аналогичные частички, инъецированные в цитоплазму ооцита, в ядро не проникают.
  Что касается естественных видов РНП, то комплексы ядерных пор также должны узнавать специфический сигнал на экспорт. Белковые компоненты РНП несут аминокислотные последовательности, сигналы ядерного экспорта (NES), которые дают возможность различным РНП проходить через ядерную оболочку в цитоплазму.
  В этом случае также образуется сложный комплекс, состоящий из переносимого белка с NES-последовательностью (связанного с РНК или свободного), ассоциированного с белком экспортином 1, который в свою очередь связан с RAN-GTP. Этот комплекс проходит через центральный канал, создаваемый транспортером, в цитоплазму, где и диссоциирует. При этом освобождается белок с NES-участком (или РНП), который остается в цитоплазме. Экспортин 1 и RAN после гидролиза GTP снова возвращаются в ядро (рис. 112).
  В процессе экспорта РНП ядерная пора контролирует не только белковый компонент. Ядерные поры узнают и не экспортируют короткие (100 нуклеотидов) тРНК, если в их структуре есть хоть одна замена. Транспорт незрелых форм иРНК, имеющих интронные участки, не происходит. Вообще в цитоплазме не обнаруживаются незрелые РНК. Вероятно, для экспорта некоторых РНК необходима их связь с особыми белками. Так 5S РНК переносится в цитоплазму вместе с транскрипционным фактором TFIIIA, или с белком L5. Мутантные формы 5S рРНК, которые не связываются с TFIIIA, остаются в ядре.
  Мало изучен вопрос о транспорте в цитоплазму крупных РНП-комплексов, таких как субъединицы рибосом, информосомы и малые ядерные РНП. Возможно все они под действием каких-то факторов разворачиваются, меняют свою конформацию и проходят через поровый комплекс. В пользу этого говорят наблюдения гантелевидных РНК-содержащих частиц, в просвете пор ядер гигантских слюнных желез насекомых. Считается, что эта картина отражает момент выхода из ядер РНП-частиц 60 нм в диаметре, относимых к информоферам. Интересно, что состав белков в цитоплазматических информационных РНП иной, это может говорить о том, что в зоне поровых комплексов происходит "переодевание" информационных РНК, связь их с иными белками.
  Динамика ядерной оболочки в митозе
  Большей частью, но не у всех видов (исключение составляют амебы, эвгленовые, инфузории, динофлагелляты, многие водоросли, некоторые грибы), ядерная оболочка разрушается при митозе и снова возникает после деления клеток. Это так называемый открытый тип митоза (рис. 113). При этом в профазе по мере конденсации хромосом ядерная оболочка теряет с ними связь, а затем в ней появляются разрывы. Она приобретает вид плоских мембранных вакуолей, цистерн. В это время ядерные поры еще видны. Позднее они исчезают. Во время митоза 120 мДа комплекс ядерной поры разбирается на субкомплексы примерно по 1 мДа. Разборка пор начинается с фосфорилирования ряда нуклеопоринов митотической cdc2/циклин B киназой.
  Ядерная оболочка превращается в скопление мелких мембранных пузырьков, окружающих зону бывшего интерфазного ядра. Такие пузырьки морфологически нельзя отличить от других мелких вакуолей в цитоплазме, они вероятно сливаются с вакуолями эндоплазматического ретикулума. В метафазе мембранные элементы цитоплазмы оттесняются к периферическим зонам клеток микротрубочками веретена деления.
  В конце анафазы, когда прекращается движение хромосом к противоположным полюсам клетки, мембранные пузырьки цитоплазмы, и в первую очередь мембраны гранулярного эндоплазматического ретикулума (см. ниже), начинают контактировать с поверхностью хромосом. Эти контакты происходят сначала в небольшом числе точек, но затем начинается перестройка и рост этих первичных зачатков ядерной оболочки. Они из мелких пузырьков превращаются в плоские вакуоли, которые растут в ширину и обволакивают поверхность деконденсирующихся хромосом. Участки таких растущих плоских мембранных мешков сливаются, замыкая и отгораживая содержимое нового интерфазного ядра. Интересно, что ядерные поры появляются на самых ранних этапах реконструкции ядерной оболочки, когда двойные мембранные цистерны еще не сомкнулись и фактически ничего не разделяют.
  При реконструкции ядерной оболочки происходит сборка ядерных пор. Она начинается с образования ямки при слиянии внешней и внутренней ядерной мембраны, которая затем превращается в отверстие. В этом процессе принимают участие интегральные белки gp 210 и POM 121, которые впоследствии будут закреплять ЯПК на мембранах.
  За этим следует появление внутренних структур ЯПК: комплекс кольца, спиц, добавление звездчатого кольца и других структур, и, наконец, филаментов.
  У некоторых низших организмов в случае закрытого митоза ядерная оболочка не исчезает, она в зоне ядерной перетяжки замыкается, что приводит к образованию двух новых ядер. Здесь участие ядерной оболочки в делении клетки заключается в том, что на ней закреплены хромосомы, и она, по-видимому, принимает участие в индукции образования микротрубочек, необходимых при делении клеток.
  По-видимому, для реконструкции ядерной оболочки необходимым условием является деконденсация хромосом. Было показано, что если вызвать преждевременную деконденсацию метафазных хромосом, то они очень быстро контактируют с мембранными пузырьками и одеваются каждая своей отдельно ядерной оболочкой, вследствие чего в клетке возникает множество так называемых микроядер, каждое их которых возникло из одной хромосомы.
  С другой стороны, можно экспериментально вызвать разборку ядерной оболочки у интерфазного ядра. Это происходит, если слить в культуре ткани две клетки на разных стадиях клеточного цикла и получить т.н. гетерокарион, где одно из ядер будет находиться в интерфазе, а другое быть в виде митотических хромосом в метафазе. В этом случае в интерфазном ядре начинает конденсироваться хроматин, образуются преждевременно конденсированные хромосомы, а ядерная оболочка исчезнет так же как во время нормального митоза (рис. 114). Эти данные говорят о том, что в цитоплазме митотической клетки существуют какие-то факторы, вызывающие как конденсацию хромосом, так и параллельный этому процесс распада ядерной оболочки.
  Сходная динамика совпадения процессов перестройки хромосом и ядерной оболочки наблюдается и в другой системе, в цитоплазме ооцитов или в бесклеточных цитоплазматических экстрактах ооцитов. Так если в цитоплазму ооцита амфибий на стадии метафазы инъецировать выделенные интерфазные ядра, то их ядерная оболочка разбирается, а хроматин конденсируется в виде митотических хромосом. Если же в ооцит на стадии интерфазы ввести митотические хромосомы, то они начинают деконденсироваться, появляются множественные мелкие вакуоли, которые сливаясь друг с другом, образуют ядерные оболочки. Интересно, что в цитоплазму интерфазного ооцита можно ввести даже чужеродную чистую ДНК, которая, связываясь с гистонами в цитоплазме, образует хроматиновые глыбки, которые в свою очередь одеваются ядерными оболочками и превращаются в микроядра.
  Эти экспериментальные приемы вместе с методом иммунофлуоресценции позволили проследить судьбу многих белков ядерной оболочки во время митоза. Подробно изучена судьба ламинов. Было найдено, что фиброзный слой ламинов деполимеризуется параллельно распаду ядерных мембран и конденсации хроматина. Этому предшествует обильное (в 7 раз выше, чем в интерфазе) фосфорилирование ламинов. Ламины A и C при этом деполимеризуются до димеров и тетрамеров и, переходя в растворимое состояние, равномерно распределяются в цитоплазме вне связи с другими структурами. Ламин B тоже деполимеризуется до олигомеров, но остается связанным с мембранными пузырьками, возникшими из ядерной оболочки.
  При сборке ядерной оболочки в телофазе белки ламины иммунохимически начинают выявляться в центромерных и теломерных участках хромосом, там же обнаруживаются первые признаки образования новой ядерной оболочки. Там же накапливаются антитела к белкам порового комплекса. В бесклеточной системе цитоплазматического экстракта ооцитов было показано, что ассоциация растворимых в митозе ламинов A и C происходит независимо от ламина B. Оказалось, что если систему реконструкции ядерной оболочки лишить ламина B, то ламины A и C связываются с поверхностью хромосом, но сборки ядерной оболочки не происходит. В экстракте, лишенном ламинов A и C, ламин B связывается с хромосомами, но нормальная ядерная оболочка так же не формируется.
  Часть IV. Цитоплазма
  Цитоплазма - это тот компонент клетки, который остается, если исключить ядро.
  Цитоплазма может занимать у разных типов клеток различные объемы. Так у лимфоцитов ее объем примерно равен объему ядра, у гепатоцита, наоборот, ядро занимает всего около 6% от общего объема клетки, у нейронов эта доля в 600 раз меньше.
  Так же как и ядро цитоплазма многокомпонентна. Уже в световой микроскоп в цитоплазме живой клетки видны какие-то вкрапления, неоднородности, частички. Особенно неоднородность цитоплазмы видна при изучении ее в электронном микроскопе. Формально структуру цитоплазмы подразделяют на три части: органеллы, включения, гиалоплазма (основная плазма, цитозоль). Органеллы - обязательные для любой клетки компоненты, без которых клетка просто не может поддерживать свое существование; включения - необязательные компоненты, которые представляют собой или отложения запасных веществ (гликоген, желточные гранулы) или скопление продуктов метаболизма (пигменты, кристаллы солей и др. в растительных клетках). И органеллы и включения погружены в гиалоплазму - жидкую фазу цитоплазмы клетки. Важно напомнить, что клетка как таковая представляет собой мембранный мешочек, заполненный водным раствором белка. Вот примерный химический состав клетки: вода - 85%, белок - 10%, ДНК - 0,4%, РНК - 0,7%, липиды - 2%, неорганические соли - 1%, органические соединения - 1%. Примерно 25% от сухого веса клеточных белков приходится на белки жидкой фазы эукариотической клетки, на гиалоплазму. В бактериальных клетках, бедных мембранными элементами, на долю белков гиалоплазмы приходится около половины всех белков клетки.
  Глава 11. Гиалоплазма и органеллы
  Термин гиалоплазма (от hyaline - прозрачный), основная плазма, матрикс цитоплазмы или цитозоль обозначают очень важную часть клетки, ее истинную внутреннюю среду. Гиалоплазму достаточно просто получить в виде фракции. Для этого путем дифференциального центрифугирования осаждают из гомогенатов клеток все тяжелые компоненты вплоть до рибосом. Надосадочная жидкость в этом случае и представляет собой растворимый компонент цитоплазмы, цитозоль или гиалоплазму. Цитозоль - не просто разбавленный водный раствор; его состав весьма сложен, а консистенция приближается к гелю (желе). Гели - это структурированные коллоидные системы с жидкой дисперсной средой. Частицы дисперсной фазы соединены между собой в рыхлую пространственную сетку, которая содержит в своих ячейках дисперсную среду, лишая текучести систему в целом. Гель гиалоплазмы или цитозоль относится к т.н. тиксотропным гелям, которые под воздействием внешних условий (температура, давление) или внутренних факторов (факторов стабилизации или деполимеризации) могут менять свое агрегатное состояние и переходить в менее вязкую, более жидкую фазу - в золь (раствор). Такие гель-золь переходы очень характерны для гиалоплазмы. Так, например, при высоких гидростатических давлениях цитоплазма не уплотняется, а обратимо разжижается. Отдельные зоны гиалоплазмы могут менять свое агрегатное состояние в зависимости от условий или от функциональной задачи. Так, известно, что отдельные молекулы белков-тубулинов могут быть диспергированы в гиалоплазме, но в определенные моменты они начинают собираться и строить длинные трубчатые структуры - микротрубочки. Этот процесс самосборки микротрубочек обратим: при изменении условий жизни клетки (повышение давления или изменение проницаемости мембран клетки) микротрубочки распадаются до мономерных молекул тубулинов. Таким же образом в бесструктурной на первый взгляд гиалоплазме могут возникать и распадаться различные фибриллярные, нитчатые комплексы белковых молекул.
  Подобные гель-золь переходы могут определяться также другими белками, например, актином, количество которого в некоторых немышечных клетках может достигать 10%. При взаимодействии фибриллярного актина с белками типа фибрина происходит стабилизация геля, а при связывании с белками, активность некоторых зависит от концентрации Ca++ (гельзолин), происходит фрагментация фибрилл и переход всей системы в жидкое состояние (золь). Таким путем может меняться состояние цитоплазмы в различных участках клетки, что обеспечивает движение всей клетки или отдельных ее внутриклеточных компонентов.
  Функциональное значение гиалоплазмы очень велико. Здесь локализованы ферменты, участвующие в синтезе аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, метаболизма сахаров. В гиалоплазме происходит синтез и отложение запасного полисахарида гликогена, накопление запасных жировых капель, состоящих из триацилглицероидов. Здесь же происходят процессы гликолиза и синтез части АТФ. В гиалоплазме на рибосомах и полирибосомах, несвязанных с мембранами, происходит синтез белков, необходимых клетке для поддержания ее жизнедеятельности, для построения ее органелл. Здесь же происходит активация аминокислот с помощью специфических ферментов и связывание их с трансферными РНК. В цитозоле также происходит модификация ферментов (например, фосфорилирование), приводящее к их активации или к инактивации, происходит деградация, расщепление белков, с помощью специфических протеиназ и др.
  В цитозоле на расположенных там рибосомах синтезируются белки, транспортируемые в различные участки клетки. Здесь же осуществляется синтез всех белков клеточного ядра, большая часть белков митохондрий и пластид, основные белки пероксисом. Эти группы белков имеют свои сигнальные аминокислотные последовательности, которые узнаются соответственно ядерными порами, или мембранами, что позволяет этим белкам транспортироваться через мембраны и попадать внутрь митохондрий, пластид, пероксисом.
  Синтез секреторных белков, белков лизосом, внеклеточного матрикса также начинается в гиалоплазме, но после контакта с мембранами гранулярного эндоплазматического ретикулума комплекс рибосома-информационная РНК-пептид оказывается связанным с мембранами, а синтезирующийся белок ко-трансляционно переносится через мембрану и оказывается в полости мембранных вакуолей.
  Кроме структурных белков и ферментов в цитозоле в растворенном состоянии содержится огромное количество аминокислот, нуклеотидов и других строительных блоков биополимеров, а также множество метаболитов - промежуточных продуктов, возникающих при синтезе и распаде макромолекул.
  Гиалоплазма содержит большое количество ионов, неорганических соединений, таких как Na+, K+, Ca2+, Cl-, HCO3-, HPO42- и др. При этом концентрация этих ионов строго детерминирована и регулируется мембранными компонентами клетки.
  Формально, по морфологическим признакам, обязательные компоненты цитоплазмы, органеллы или органоиды, можно разделить на две группы: мембранные и немембранные. Мембранные органеллы так же представлены двумя вариантами: одномембранные и двумембранные. К первым относятся органеллы вакуолярной системы - эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы и другие специализированные вакуоли, а также плазматическая мембрана. К двумембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. К немембранным органеллам принадлежат рибосомы, клеточный центр животных клеток, постоянно присутствующие в клетках. Что же касается элементов клеточного скелета, цитоскелета, постоянной компоненты клетки, его выраженность может значительно меняться в течение клеточного цикла, от полного исчезновения одного компонента (например, цитоплазматические микротрубочки во время митоза), до появления новых структур (веретено митоза).
  Общим свойством мембранных органелл является то, что они построены из липопротеидных пленок, или перепонок, тонких слоев, замыкающихся сами на себя так, что они образуют замкнутые полости и тем самым разделяют цитоплазму на группу различных отсеков. Внутреннее содержимое этих отсеков или вакуолей всегда отличается от содержимого гиалоплазмы. Толщина таких пленок-мембран очень мала - около 7-10 нм, по весу они занимают около 4% от веса клетки, но очень значительна площадь клеточных биомембран. Так, например, гепатоцит, имеющий в поперечнике около 20 мкм и занимающий объем около 5000 мкм3, окружен плазматической мембраной с общей площадью 2200мкм2. Общая же площадь его внутриклеточных мембран в 50 раз больше и составляет 110 000мкм2 (!). В электронном микроскопе цитоплазма клеток представляется как бы заполненной пеной из замкнутых мембранных пузырьков, имеющих разную форму: округлые вакуоли. плоские замкнутые мешочки, извитые трубки и т.д. (рис. 115). В гепатоците на долю плазматической мембраны приходится примерно 2% от всех клеточных мембран, на вакуолярную систему - 58%, на митохондрии - 40%, на внутреннюю мембрану ядра - около 0,2%. Из приведенных выше данных видно, что мембраны клетки, или как их называют, биомембраны занимают одно из ведущих мест в структурной и функциональной организации клетки.
  Глава 12. Общие свойства биологических мембран
  Все без исключения клеточные мембраны построены по общему принципу: это тонкие липопротеидные пленки, состоящие из двойного слоя липидных молекул, в который включены молекулы белка. В весовом отношении в зависимости от типа мембран на долю липидов приходится 25-60%, на долю белков 40-75%. В состав многих мембран входят углеводы, количество которых может достигать 2-10%.
  Структурной основой мембран является двойной слой липидов
  К липидам относится большая группа органических веществ, обладающих плохой растворимостью в воде (гидрофобность) и хорошей растворимостью в органических растворителях (липофильность). Состав липидов, входящих в мембраны клетки, очень разнообразен (рис. 116). Характерными представителями липидов, встречающихся в клеточных мембранах, являются фосфолипиды (глицерофосфатиды), сфингомиелины и из стероидных липидов - холестерин.
  Глицерофосфатиды, или глицеролипиды, представляют собой сложные эфиры трехатомного спирта глицерина с двумя жирными кислотами и с фосфорной кислотой, которая в свою очередь может быть связана с различными химическими группами (холин, серин, инозит, этаноламин и др.). Так, например, в структуру наиболее часто встречающегося в мембранах глицеролипида лецитина входят участки двух жирных кислот, глицерина, фосфорной кислоты и холина.
  Другая группа мембранных липидов называется сфингомнелиновой, в ней глицерин замещен аминоспиртом сфингозином.
  Из липидов, относящихся к стероидам, больше всего в мембранах холестерина. В растительных клетках холестерин не обнаружен, его там заменяют фитостерины. У бактерий стерины отсутствуют.
  Характерной особенностью липидов мембран является разделение их молекулы на две функционально различные части: неполярные (не несущие зарядов) хвосты, состоящие из жирных кислот, и заряженные полярные головки (рис. 117). Полярные головки несут на себе отрицательные заряды или могут быть нейтральными (в случае, если они имеют одновременно положительные и отрицательные заряды). Наличие неполярных хвостов липидов объясняет их хорошую растворимость в жирах и органических растворителях.
  Если полярные липиды смешать с водой, то образуется эмульсия, состоящая из мицелл. При этом незаряженные (гидрофобные) хвосты будут стремиться образовывать однородную фазу в центре мицеллы, и заряженные, гидрофильные, головки будут торчать в водную фазу. Холестерин сам по себе мицелл не образует, но легко включается в мицеллы полярных липидов, в результате чего образуются мицеллы смешанного типа. Если, наоборот, к липидам добавить немного воды, то образуются мицеллы, как бы вывернутые наизнанку: их гидрофобные хвосты будут торчать в масляную фазу, а заряженные (гидрофильные) головки будут располагаться внутри мицеллы (рис. 118).
  На поверхности воды растворы полярных липидов, растекаясь, образуют мономолекулярную пленку, в которой в водную фазу будут направлены заряженные (гидрофильные) головки, а неполярные хвосты будут обращены в сравнительно гидрофобную воздушную фазу. Смешивая с водой экстрагированные из мембран липиды или беря смеси разных липидов, можно получить бимолекулярные слои или мембраны толщиной около 3,5 нм, где периферические зоны слоя, смотрящие в водную фазу, будут содержать исключительно полярные головки, а незаряженные хвосты будут образовывать общую гидрофобную центральную зону такой образовавшейся мембраны (рис. 119).
  Эта способность липидов самопроизвольно образовывать мембранные структуры определяется свойствами самих липидов, а именно наличием в их структуре полярных головок и неполярных хвостов.
  В таких искусственные системах липидные мицеллы и мембраны могут взаимодействовать с белками своими полярными зонами или гидрофобными хвостами, при этом образуются искусственные липопротеидные мембраны, сходные с теми мембранами, которые можно выделить из клеток. Они имеют толщину около 7,5 нм. При окраске четырехокисью осмия искусственные мембраны обнаруживают в электронном микроскопе трехслойную структуру: два темных периферических слоя по 2,5 нм и светлый, центральный, примерно такой же толщины. Естественные клеточные мембраны имеют такое же строение.
  Необходимо подчеркнуть, что как искусственные, так и естественные мембраны не представляют собой плоские слои, они всегда замкнуты сами на себя, образуя полые вакуоли, пузырьки, везикулы, плоские замкнутые мешки или трубчатые образования.
  Представление о том, что в основе клеточных мембран лежит двойной липидный слой, было получено еще в 20-х гг. Было найдено, что если экстрагировать липиды из оболочки эритроцитов, а затем поместить липиды на поверхность водного мениска, то можно рассчитать площадь, занимаемую образовавшимся монослоем липидов. Оказалось, что эта площадь вдвое больше площади, занимаемой поверхностью эритроцитов, из которых были экстрагированы липиды. Было сделано предположение, что в мембранах эритроцитов липиды располагаются в два слоя. К тому же оказалось, что поверхностное натяжение мембраны клетки (1-2 дин/см2) гораздо ниже, чем поверхностное натяжение искусственного липидного слоя (7-15 дин/см2). Было обнаружено, что при добавлении белка к липидам поверхностное натяжение снижается до величины, характерной для поверхностного натяжения клеток.
  Образовавшиеся искусственные липидные мембраны служат непроницаемым барьером для любых заряженных молекул, даже для ионов солей. Это определяет основное функциональное свойство мембран - служить преградой для свободной диффузии через слой липидов. Это свойство может быть использовано для практических целей. Так при смешивании липидов в водной среде образуется масса полых мембранных пузырьков, липосом (рис. 120). Жидкость, попавшая внутрь этих пузырьков, уже не может свободно обмениваться с жидкостью, находящейся снаружи. Таким образом искусственные мембраны липосом можно "загрузить" лекарственными веществами, которые могут в нужных концентрациях поступать к клеткам.
  Мембранные белки встроены в билипидный слой
  В среднем в липопротеидных мембранах белки по весу составляют 50%. Но количество белков в разных мембранах может быть различным. Так в мембранах митохондрий на долю белков приходится около 75%, а в плазматической мембране клеток миелиновой оболочки - около 25%. Но так как липидные молекулы имеют небольшой размер (около 0,5 нм) и молекулярный вес, их число по отношению к числу белковых молекул выше в 50 раз. Поэтому белковые молекулы как бы вкраплены в билипидный слой мембраны. Часть из них связана с липидными головками с помощью ионных (солевых) связей и поэтому легко экстрагируется из мембран растворами солей. Другие образуют солевые связи с полярными участками липидов через взаимодействие с ионами Mg++ или Ca++, такие белки экстрагируются с помощью хелатных соединений, таких, как версен (ЭДТА). Такие легко экстрагируемые белки большей частью расположены на мембранах со стороны цитоплазмы. В цитоплазматической мембране эти белки тесно связаны с белковыми структурами цитоскелета.
  Большая часть белков взаимодействует с липидами в составе мембран на основе гидрофобных связей. Оказалось, что многие мембранные белки состоят как бы из двух частей: из участков, богатых полярными (несущими заряд) аминокислотами, и участков, обогащенных неполярными аминокислотами (глицином, аланином, валином, лейцином). Такие белки в липидных слоях мембран располагаются так, что их неполярные участки как бы погружены в "жирную" часть мембраны, где находятся гидрофобные участки липидов (рис. 121). Полярная (гидрофильная) же часть таких белков взаимодействует с головками липидов и обращена в сторону водной фазы (рис. 122), поэтому такие белки, связанные с липидами путем гидрофобных взаимодействий, практически не экстрагируются в водных фазах. Их можно выделить, лишь разрушая мембрану, экстрагируя из нее липиды или органическими растворителями, или детергентами. Поэтому эти белки мембран и называют интегральными.
  Размер интегральных мембранных белков в среднем равен 8 нм, но встречаются крупные белки - до 35 нм величиной (белок тилакоидов хлоропластов). Обычно это очень асимметричные по своей природе белки и соответственно асимметрично локализованы в мембране (рис. 123): их разные функциональные части локализованы по обе стороны мембраны, и все белки данного типа расположены одинаково. С цитоплазматической стороны мембраны интегральные белки связаны с периферическими белками.
  Эти представления, полученные при изучении химии клеточных мембран, были блестяще подтверждены морфологическими исследованиями. При использовании метода замораживания-скалывания, скол через мембраны может идти через центральную, липидную, зону. В этом случае обнажается масса глобул, белковой природы, находящихся в составе липидного слоя. Размер таких глобул около 4-8 нм. Эти и другие биохимические данные послужили основой для создания модели мембраны с мозаичной укладкой: мембрана состоит из неплотно упакованных белковых глобулярных белков, свободное пространство между которыми заполнено липидными молекулами (рис. 121). При этом часть белков может быть связана только с полярными группами липидов и может находиться на поверхности билипидного слоя; другие белки могут частично или даже полностью погружены из-за гидрофобных свойств своих участков в липидный слой; третьи - могут пронизывать мембрану насквозь. Интересно, что большая часть липидных молекул (70%) не связана с белками, так что белковые молекулы как бы плавают в "липидном озере".

<< Пред.           стр. 4 (из 7)           След. >>

Список литературы по разделу