<< Пред.           стр. 5 (из 7)           След. >>

Список литературы по разделу

  Липиды и белки мембран обладают латеральной подвижностью
  Исследование искусственных липидных бислоев показало, что эти мембраны представляют собой двумерную жидкость, обладающую вязкостью, сравнимую с вязкостью оливкового масла. В составе таких и естественных мембран молекулы липидов постоянно движутся с огромной скоростью (коэффициент диффузии для них равен 10-8 см2 х с-1),достигающей 2 мкм за 1 с.
  Липидные молекулы двигаются вдоль липидного слоя, могут вращаться вокруг своей оси, а также переходить из слоя в слой, что происходит редко и с помощью специальных переносчиков. Белки плавающие в "липидном озере" также обладают латеральной, продольной подвижностью, но скорость их перемещения в десятки и сотни раз ниже. Изучать перемещение белковых молекул в составе мембран на живых клетках проще на примере плазматической мембраны. Белки плазматической мембраны, гликопротеины, часто имеют олигосахаридные цепочки, смотрящие на внеклеточную среду.
  Для исследования свойств плазматической мембраны широко используются лектины, белки растительного происхождения, которые специфически связываются с олигосахаридами мембранных белков. Так, лектин конканавалин А (КонА), выделенный из растения канавалии мечевидной, связывается с олигосахаридами, имеющими на концах глюкозу или маннозу. Лектин из бобов сои связывается с N-ацетилглюкозамином, а лектин из проростков пшеницы, кроме того, и с галактозой. На поверхности белков-лектинов имеются два или более района специфического связывания с углеводами. Если лектины добавлять к взвеси эритроцитов, то это вызывает их осаждение, сопровождающееся слипанием - агглютинация. Поэтому лектины еще называют агглютининами.
  Такая реакция агглютинации эритроцитов вызвана тем, что лектин, например КонА, взаимодействуя с концевыми сахарами углеводов гликопротеидов, как бы сшивает эритроциты друг с другом, чем и вызывает их осаждение. Так как полисахариды есть на поверхности плазматической мембраны любых клеток, то лектины могут связываться с ними. Места посадки лектинов можно увидеть в электронном микроскопе, если связать лектины с электронноплотным белком ферритином. Более удобно регистрировать лектины на поверхности клеток с помощью иммунофлуоресцентного метода (см. выше). Использование этого метода позволило проследить за поверхностью белков в плоскости мембран. Так, оказалось, что при добавлении к клеткам, поверхность которых связана с КонА, антител против КонА, меченных флуорохромом, обнаруживается свечение по всей поверхности клетки. Это значит, что белки-гликопротеиды, полисахаридные цепи которых образуют слой, равномерно разбросаны по поверхности клеток. Однако через некоторое время на поверхности клетки видно не сплошное свечение, а отдельные множественные пятна или точки (их назвали "заплатками", по-английски patch). Затем эти пятна собираются в одну зону - "колпачок". Следовательно, белки, связанные с лектинами, могут быстро перемещаться в плоскости плазматической мембраны. Интересно, что "колпачок" всегда формируется над тем местом клетки, где находятся центриоли и аппарат Гольджи. Дальнейшая судьба этого колпачка может быть у разных клеток различной: у фибробластов колпачки могут отделяться и отрываться от тела при движении клетки, у других (лимфоциты) происходит поглощение этих участков внутрь клетки (эндоцитоз) и переваривание их там (рис. 124).
  Латеральную подвижность белковых (гликопротеидных) молекул плазматической мембраны можно наблюдать при изучении клеточных гибридов, имеющих разные поверхностные антигены, которые можно пометить. В этом случае сначала в гибридной клетке антигены поверхностей были разобщены, а через некоторое время они равномерно распределились по всей поверхности гетерокариона .
  Клеточные мембраны асимметричны
  Состав липидов по обе стороны мембраны различен, что определяет асимметричность в строении билипидного слоя. Так, с помощью химического маркирования было найдено, что 80% сфингомиелина и 75% фосфатидилхолина, и 20% фосфатидилэтаноламина локализованы на наружной поверхности плазматической мембраны, на внутренней же - располагается весь фосфатидилсерин и 80% фосфатидилэтаноламина. Примерно такую же композицию имеют мембраны эндоплазматического ретикулума (для них наружной надо считать ту поверхность, которая обращена внутрь полости).
  Особенно выражена асимметрия мембран в отношении интегральных белков. В составе естественных мембран белки строго ориентированы. Большей частью их N-концы смотрят в полость вакуолей или в случае плазматической мембраны, во внешнюю для клетки среду. Такое полярное расположение цепи белковой молекулы в липидном бислое создается в процессе синтеза мембранного белка на рибосоме (см. ниже). Полуинтегральные и примембранные белки также асимметрично расположены в мембранах. Так в эндоплазматическом ретикулуме белки-ферменты, синтезирующие липиды, расположены на цитозольной стороне мембран, а ферменты, пришивающие сахара к белковым цепочкам, гликозидазы, локализованы на внешней стороне мембраны.
  Наличие углеводного компонента характерно практически для всех мембран клетки, но особенно для мембран вакуолярной системы и плазматической мембраны. Углеводный компонент мембран представлен главным образом гликопротеинами - молекулами белков, ковалентно (в отличие от нуклеопротеидов) связанных с цепочками углеводов. Как правило, цепочки углеводов расположены в наружных слоях мембран (для цитоплазматических вакуолей наружными считают слои, обращенные не к матриксу цитоплазмы, а в полость везикул или вакуолей). Они имеют ковалентные связи с интегральными белками, образуя гликопротеиды, или с липидами (гликолипиды). Углеводы мембран представляют собой короткие линейные или разветвленные цепочки, в состав которых входят галактоза, манноза, фруктоза, сахароза, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин, пентозы - арабиноза и ксилоза, а также нейраминовая (сиаловая) кислота. Значение этого компонента очень велико для функционирования плазматической мембраны.
 
  Разные мембраны имеют различные свойства
  Несмотря на поразительную схожесть строения различных мембран, построенных по принципу липидного бислоя с вмонтированными в него белками, физические и химические свойства разных мембран различны. Это связано с тем, что в разных мембранах общий состав липидов значительно различается, что определяет особые свойства мембран.
  Разные мембраны клетки могут отличаться друг от друга по количеству липидов. Так, плазматическая мембрана содержит 35-40% липидов, а мембраны митохондрий - 27-29%. Самое высокое содержание липидов в плазматической мембране шванновских клеток, образующих миелиновую оболочку нервов, - дл 80%.
  Было обнаружено, что клеточные мембраны сильно отличаются друг от друга по составу липидов. Так, плазматические мембраны клеток животных богаты холестерином (до 30%) и в них мало лецитина, в то время как мембраны митохондрий, наоборот, богаты фосфолипидами и бедны холестерином. Из общего количества липидов содержание фосфатидилхолина (лецитина) во фракциях эндоплазматической сети составляет 60-70% от всех фосфолипидов, в то время как в плазматической мембране его может быть 25-35%.
  В целом для плазматической мембраны характерно высокое содержание холестерина и сфинголипидов, а также преобладание насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов, тогда как в митохондриях, эндоплазматической сети и во многих других цитоплаззматических мембранах содержится мало холестерина и сфинголипидов и сравнительно много полиненасыщенных жирных кислот. Видимо, в связи с этим мембраны цитоплазмы менее жесткие, чем плазматическая мембрана, они более "легкоплавки".
  Особенно отличаются мембраны по составу белков, которые, главным образом, определяют функциональные свойства мембран.
  По биологической роли мембранные белки можно разделить на три группы: ферменты, рецепторные белки и структурные белки.
  Набор ферментов в составе мембран может быть очень велик и разнообразен (например, в плазматической мембране клеток печени обнаружено не менее 24 различных ферментов). В разных мембранах существует характерный набор ферментов. Например, в плазматической мембране, как и во многих других, локализуется K+-Na+-зависимая АТФаза, участвующая в транспорте ионов. В митохондриях специфическим является набор белков - переносчиков электронов и феремент АТФ-синтетаза, обеспечивающие окислительное фосфорилирование и синтез АТФ.
  Рецепторные белки специфически связываются с теми или иными веществами и как бы их узнают. Это белки-рецепторы для гормонов, для узнавания поверхности соседних клеток, вирусов, фагов у бактерий и т.д. К этой группе относятся фоторецепторные белки. Вообще же рецепторные белки входят в состав любых мембран. Так на внешней мембране митохондрий расположены рецепторы, участвующие в узнавании и транспорте митохондриальных белков, переносимых из цитозоля в митохондрии. На мембранах эндоплазматического ретикулума находятся рецепторы, узнающие и связывающие рибосомы, на ядерной оболочке - рецепторы кариофильных белков и т.д. На плазматической мембране расположены как рецепторы, узнающие соседние клетки или даже отдельные ионы солей (переносчики), так и белки, узнающие белки цитоскелета в цитоплазме.
  Мембраны ассоциированы с цитоплазматическими белками
  Со стороны цитоплазмы мембраны связаны через примембранные или собственно мембранные интегральные белки с разнообразными белковыми структурами цитоплазмы. К ним относятся в первую очередь компоненты цитоскелета. Это позволяет не только сделать мембраны более жесткими, но и обеспечивает подвижность мембран, создавая возможности для их транспортных функций. Например, жесткость плазматической мембраны безъядерных эритроцитов создается за счет связывания сети цитоплазматических белков с интегральными белками плазмолеммы. В ее состав входит белок, т.н. "белок полосы III", который обеспечивает транспорт ионов через бислой, но одновременно через ряд белков связывается с сетью белков-спектринов, которые создают жесткую подмембранную сеть (рис. 125). Во многих эпителиальных клетках специальные белки плазматической мембраны связываются с элементами цитоскелета и участвуют в образовании целого ряда межклеточных соединений (десмосомы, адгезивный контакт и др.). С элементами цитоскелета связаны также оболочки клеточного ядра :внешняя ядерная мембрана тесно ассоциирована с промежуточными филаментами, которые фиксируют ядро в объеме цитоплазмы. Внутриклеточные вакуоли могут перемещаться в клетке только при взаимодействии с фибриллярными компонентами, такими как микротрубочки и микрофиламенты. Митохондрии перемещаются в клетке также за счет ассоциации с элементами цитоскелета.
  Рост мембран происходит за счет встраивания готовых мембранных пузырьков
  После деления клеток происходит увеличение объемов растущих дочерних клеток и тем самым рост клеточной поверхности, увеличение площади плазматической мембраны. Но это не единственный пример быстрого роста объема и поверхности. Поверхность быстро растущих клеток в тычиночных нитях злаков может за 1 ч увеличиться в 65 раз, т.е. каждую минуту плазмолемма нарастает на ее первоначальную величину. Такую большую скорость роста плазматической мембраны можно объяснить только тем, что происходит быстрое встраивание, интеркаляция, пузырьков в растущую плазматическую мембрану. Здесь, внутриклеточные мембранные пузырьки подходят к внутренней стороне плазматической мембраны (возможно, их подгоняют к себе микрофиламенты кортикального слоя), происходит слияние мембран и тем самым увеличение поверхности плазматической мембраны (рис. 126).
  Откуда же берутся эти готовые блоки, мембранные пузырьки? Удалось проследить (см. ниже), что первичный генезис мембран происходит в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, который является источником всех клеточных мембран, кроме мембран митохондрий и пластид. От мембран гранулярного ЭПР отщепляются мелкие вакуоли, которые сливаются с мембранами аппарата Гольджи, от которого в свою очередь, отщепляются мелкие мембранные вакуоли, сливающиеся или с лизосомами, или с плазматической мембраной, или с секреторными вакуолями.
  Таким образом, наблюдается последовательный каскад переходов одних мембран в другие. Первичные же мембранные вакуоли строятся за счет синтеза белка и липидов на мембранах гранулярного ЭПР.
  Рост мембран митохондрий и пластид иного характера. Увеличение площади мембран митохондрий происходит за счет синтеза основной массы белков и липидов в гиалоплазме клетки, вслед за чем эти митохондриальные белки и липиды транспортируются через мембранную оболочку митохондрий и встраиваются в их компоненты.
  Глава 13. Плазматическая мембрана
  Плазматическая мембрана, или плазмолемма, среди различных клеточных мембран занимает особое место. Это поверхностная периферическая структура, ограничивающая клетку снаружи, что обусловливает ее непосредственную связь с внеклеточной средой, а следовательно, со всеми веществами и стимулами, воздействующими на клетку. Поэтому плазматической мембране принадлежит роль быть барьером, преградой между сложно организованным внутриклеточным содержимым и внешней средой. В этом случае плазмолемма выполняет не только роль механического барьера, но, главное, ограничивает свободный поток низко- и высокомолекулярных веществ в обе стороны через мембрану. Более того, плазмолемма выступает как структура "узнающая", рецептирующая, различные химические вещества и регулирующая избирательно транспорт этих веществ в клетку и из нее. Другими словами, плазматическая мембрана осуществляет функции, связанные с регулируемым избирательным трансмембранным транспортом веществ и выполняет роль первичного клеточного анализатора. В этом отношении плазмолемму можно считать клеточным органоидом, входящим в вакуолярную систему клетки. Как и другие мембраны этой системы (мембраны лизосом, эндосом, аппарата Гольджи и др.) она возникает и обновляется за счет синтетической активности эндоплазматического ретикулума и имеет сходную композицию. Как ни странно, но плазматическую мембрану можно уподобить мембране внутриклеточной вакуоли, но вывернутой наизнанку: она не окружена гиалоплазмой, а окружает ее.
  Барьерно-транспортная роль плазмолеммы
  Окружая клетку со всех сторон, плазматическая мембрана выполняет роль механического барьера. Для того, чтобы проколоть ее с помощью микроигл или микропипеток, требуется довольно большое усилие. При давлении на нее микроиглы она сначала сильно прогибается, а лишь затем прорывается. Искусственные липидные мембраны менее устойчивы. Эта механическая устойчивость плазматической мембраны может определяться дополнительными компонентами, такими как гликокаликс и кортикальный слой цитоплазмы (рис. 127).
  Гликокаликс представляет собой внешний по отношению к липопротеидной мембране слой, содержащий полисахаридные цепочки мембранных интегральных белков - гликопротеидов. Эти цепочки содержат такие углеводы как манноза, глюкоза, N-ацетилглюкозамин, сиаловая кислота и др. Такие углеводные гетерополимеры образуют ветвящиеся цепочки, между которыми могут располагаться выделенные из клетки гликолипиды и протеогликаны. Слой гликокаликса сильно обводнен, имеет желеподобную консистенцию, что значительно снижает в этой зоне скорость диффузии различных веществ. Здесь же могут "застревать" выделенные клеткой гидролитические ферменты, участвующие во внеклеточном расщеплении полимеров (внеклеточное пищеварение) до мономерных молекул, которые затем транспортируются в цитоплазму через плазматическую мембрану.
  В электронном микроскопе, особенно при специальных методах контрастирования полисахаридов, гликокаликс имеет вид рыхлого волокнистого слоя, толщиной 3-4 нм, покрывающего всю поверхность клетки. Особенно хорошо гликокаликс выражен в щеточной каемке клеток всасывающего эпителия кишечника (энтероциты), однако он обнаружен практически у всех животных клеток, но степень его выраженности различна (рис. 128).
  Механическая устойчивость плазматической мембраны, кроме того, обеспечивается структурой примыкающего к ней со стороны цитоплазмы кортикального слоя и внутриклеточных фибриллярных структур. Кортикальный (от слова - cortex -кора, кожица) слой цитоплазмы, лежащий в тесном контакте с липопротеидной наружной мембраной, имеет ряд особенностей. Здесь в толщине 0,1-0,5 мкм отсутствуют рибосомы и мембранные пузырьки, но в большом количестве встречаются фибриллярные элементы цитоплазмы - микрофиламенты и часто микротрубочки. Основным фибриллярным компонентом кортикального слоя является сеть актиновых микрофибрилл. Здесь же располагается ряд вспомогательных белков, необходимых для движения участков цитоплазмы (подробнее о скелетно-двигательной системе клеток см. ниже). Роль этих связанных с актином белков очень важна, так как она объясняет их участие в связи, в "заякоревании" интегральных белков плазматической мембраны.
  У многих простейших, особенно у инфузорий, плазматическая мембрана принимает участие в образовании пелликулы, жесткого слоя, часто определяющего форму клетки. К плазматической мембране здесь изнутри могут примыкать мембранные мешочки; в этом случае у поверхности клеток имеются три мембранных слоя: собственно плазматическая мембрана и две мембраны пелликулярных альвеол. У инфузории туфельки пелликула образует утолщения, располагающиеся в виде шестиугольников, в центре которых выходят реснички (рис. 129). Жесткость пелликулярных образований может быть связана также с элементами цитоплазмы, подстилающими плазматическую мембрану, с кортикальным слоем. Так, в гребнях пелликулы эвглены вблизи мембраны обнаруживаются кроме мембранных вакуолей параллельные пучки микротрубочек и микрофиламентов. Такая фибриллярная периферическая арматура вместе со складчатой многослойной мембранной периферией создает жесткую структуру пелликулы.
  Барьерная роль плазмолеммы заключается также в ограничении свободной диффузии веществ. Модельные опыты на искусственных липидных мембранах показали, что они проницаемы для воды, газов, малых неполярных молекул жирорастворимых веществ, но совершенно не проницаемы для заряженных молекул (ионы) и для крупных незаряженных (сахара) (рис. 130).
  Естественные мембраны так же ограничивают скорость проникновения низкомолекулярных соединений в клетку.
  Трансмембранныый перенос ионов и низкомоекулярных соединений
  Плазматическая мембрана, так же как и другие липопротеидные мембраны клетки, является полупроницаемой. Это значит, что через нее с различной скоростью проходят разные молекулы и чем больше размер молекул, тем меньше скорость прохождения их через мембрану. Это свойство определяет плазматическую мембрану как осмотический барьер. Максимальной проникающей способностью обладает вода и растворенные в ней газы, значительно медленнее проникают сквозь мембрану ионы (примерно в 104 раз медленнее). Поэтому если клетку, например эритроцит, поместить в среду, где концентрация солей будет ниже, чем в клетке (гипотония), то вода снаружи устремится внутрь клетки, что приведет к увеличению объема клетки и к разрыву плазматической мембраны ("гипотонический шок"). Наоборот, при помещении эритроцита в растворы солей более высокой концентрации, чем в клетке, произойдет выход воды из клетки во внешнюю среду. Клетка при этом сморщится, уменьшится в объеме.
  Такой пассивный транспорт воды из клетки и в клетку все же идет с низкой скоростью. Скорость проникновения воды через мембрану составляет около 10-4 см/с, что в 100 000раз меньше скорости диффузии молекул воды через водный слой толщиной 7,5 нм. Было заключено, что в клеточной мембране, в ее липопротеидном слое существуют специальные "поры" для проникновения воды и ионов. Число их не так велико: суммарная площадь при величине отдельной "поры" около 0,3-0,8 нм должна составлять лишь 0,06% всей клеточной поверхности.
  В отличие от искусственных бислойных липидных мембран, естественные мембраны, и в первую очередь плазматическая мембрана, все же способны транспортировать ионы и многие мономеры, такие как сахара, аминокислоты и др. Проницаемость для ионов мала, причем скорость прохождения разных ионов неодинакова. Более высокая скорость прохождения для катионов (K+, Na+) и значительно ниже для анионов (Cl-).
  Транспорт ионов через плазмалемму проходит за счет участия в этом процессе мембранных транспортных белков - пермеаз. Эти белки могут вести транспорт в одном направлении одного вещества (унипорт) или нескольких веществ одновременно (симпорт), или же вместе с импортом одного вещества выводить из клетки другое (антипорт). Так, например, глюкоза может входить в клетки симпортно вместе с ионом Na+.
  Транспорт ионов может происходить по градиенту концентрации - пассивно без дополнительной затраты энергии. Так, например, в клетку проникает ион Na+ из внешней среды, где его концентрация выше, чем в цитоплазме. В случае пассивного транспорта некоторые мембранные транспортные белки образуют молекулярные комплексы, каналы, через которые растворенные молекулы проходят через мембрану за счет простой диффузии по градиенту концентрации. Часть этих каналов открыта постоянно, а другая часть может закрываться или открываться в ответ либо на связывание с сигнальными молекулами, либо на изменение внутриклеточной концентрации ионов. В других случаях специальные мембранные белки - переносчики избирательно связываются с тем или иным ионом и переносят его через мембрану (облегченная диффузия) (рис. 131).
  Наличие таких белковых транспортных каналов и переносчиков казалось бы должно приводить к уравновешиванию концентраций ионов и низкомолекулярных веществ по обе стороны мембраны. На самом же деле это не так: концентрация ионов в цитоплазме клеток резко отличается не только от таковой во внешней среде, но даже от плазмы крови, омывающей клетки в организме животных. На табл. 14 показаны концентрации ионов внутри и снаружи клетки.
  Таблица 14.
 Ион Внутриклеточная концентрация, мМ Внеклеточная концентрация, мМ Na+ 5-15 145 K+ 140 5 Mg2+ 30 1-2 *Ca2+ 1-2 2,5-5 Cl- 4 110
  *Концентрация Ca2+ в свободном состоянии в цитозоле эукариотических клеток составляет 10-7 М, а снаружи 10-3 М.
 
  Как видно, в этом случае, суммарная концентрация одновалентных катионов как внутри клеток, так и снаружи практически одинаковы (150 мМ), изотонична. Но оказывается в цитоплазме концентрация K+ почти в 50 раз выше, а Na+ ниже, чем в плазме крови. Причем это различие поддерживается только в живой клетке: если клетку убить или подавить в ней метаболические процессы, то через некоторое время ионные различия по обе стороны плазматической мембраны исчезнут. Можно просто охладить клетки до +20С, и через некоторое время концентрация K+ и Na+ по обе стороны от мембраны станут одинаковыми. При нагревании клеток это различие восстанавливается. Это явление связано с тем, что в клетках существуют мембранные белковые переносчики, которые работают против градиента концентрации, затрачивая при этом энергию за счет гидролиза АТФ. Такой тип работы носит название активного транспорта, и он осуществляется с помощью белковых ионных насосов. В плазматической мембране находится двухсубъединичная молекула (K+ + Na+)-насоса, которая одновременно является и АТФазой. Этот насос при работе откачивает за один цикл 3 иона Na+ и закачивает в клетку 2 иона K+ против градиента концентрации. При этом затрачивается одна молекула АТФ, идущая на фосфорилирование АТФазы, в результате чего Na+ переносится через мембрану из клетки, а K+ получает возможность связаться с белковой молекулой и затем переносится в клетку (рис. 132). В результате активного транспорта с помощью мембранных насосов происходит также регуляция в клетке концентрации и двухвалентных катионов Mg2+ и Ca2+, также с затратой АТФ.
  Такая постоянная работа пермеаз и насосов создает в клетке постоянную концентрацию ионов и низкомолекулярных веществ, создает т.н. гомеостаз, постоянство концентраций осмотически активных веществ. Надо отметить, что примерно 80% всей АТФ клетки тратится на поддержание гомеостаза.
  В сочетании с активным транспортом ионов через плазматическую мембрану происходит транспорт различных сахаров, нуклеотидов и аминокислот.
  Так активный транспорт глюкозы, которая симпортно (одновременно) проникает в клетку вместе с потоком пассивно транспортируемого иона Na+, будет зависеть от активности (K+ + Na+)-насоса. Если этот (K+-Na+)-насос заблокировать, то скоро разность концентрации Na+ по обе стороны мембраны исчезнет, сократится при этом диффузия Na+ внутрь клетки, и одновременно прекратится поступление глюкозы в клетку. Как только восстановится работа (K+-Na+)-АТФазы и создается разность концентрации ионов, то сразу возрастает диффузный поток Na+ и одновременно транспорт глюкозы. Подобно этому осуществляется через мембрану и поток аминокислот, которые переносятся специальными белками-переносчиками, работающими как системы симпорта, перенося одновременно ионы.
  Активный транспорт сахаров и аминокислот в бактериальных клетках обусловлен градиентом ионов водорода.
  Само по себе участие специальных мембранных белков, участвующих в пассивном или активном транспорте низкомолекулярных соединений, указывает на высокую специфичность этого процесса. Даже в случае пассивного ионного транспорта белки "узнают" данный ион, взаимодействуют с ним, связываются специфически, меняют при этом свою конформацию и функционируют. Следовательно, уже на примере транспорта простых веществ мембраны выступают как анализаторы, как рецепторы. Особенно такая рецепторная роль проявляется при поглощении клеткой биополимеров.
  Везикулярный перенос: эндоцитоз и экзоцитоз
  Макромолекулы такие как белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липопротеидные комплексы и другие сквозь клеточные мембраны не проходят, в противовес тому как транспортируются ионы и мономеры. Транспорт микромолекул, их комплексов, частиц внутрь клетки и из нее происходит совершенно иным путем - посредством везикулярного переноса. Этот термин означает, что различные макромолекулы, биополимеры, или их комплексы, не могут попадать в клетку сквозь плазматическую мембрану. И не только сквозь нее: любые клеточные мембраны не способны к трансмембранному переносу биополимеров, за исключением мембран, имеющих особые белковые комплексные переносчики - порины (мембраны митохондрий, пластид, пероксисом). В клетку же или из одного мембранного компартмента в другой макромолекулы попадают заключенными внутри вакуолей или везикул. Такой везикулярный перенос можно разделить на два вида: экзоцитоз - вынос из клетки макромолекулярных продуктов, и эндоцитоз - поглощение клеткой макромолекул (рис. 133).
  При эндоцитозе определенный участок плазмалеммы захватывает, как бы обволакивает внеклеточный материал, заключает его в мембранную вакуоль, возникшую за счет впячивания плазматической мембраны. В такую первичную вакуоль, или в эндосому, могут попадать любые биополимеры, макромолекулярные комплексы, части клеток или даже целые клетки, где затем и распадаются, деполимеризуются до мономеров, которые путем трансмембранного переноса попадают в гиалоплазму. Основное биологическое значение эндоцитоза - это получение строительных блоков за счет внутриклеточного переваривания, которое осуществляется на втором этапе эндоцитоза после слияния первичной эндосомы с лизосомой, вакуолью, содержащей набор гидролитических ферментов (см. ниже).
  Эндоцитоз формально разделяют на пиноцитоз и фагоцитоз (рис. 134). Фагоцитоз - захват и поглощение клеткой крупных частиц (иногда даже клеток или их частей) - был впервые описан И,И, Мечниковым. Фагоцитоз, способность захватывать клеткой крупные частицы, встречается среди клеток животных, как одноклеточных (например, амебы, некоторые хищные инфузории), так и для специализированных клеток многоклеточных животных. Специализированные клетки, фагоциты характерны как для беспозвоночных животных (амебоциты крови или полостной жидкости), так и для позвоночных (нейтрофилы и макрофаги). Пиноцитоз вначале определялся как поглощение клеткой воды или водных растворов разных веществ. Сейчас известно, что как фагоцитоз так и пиноцитоз протекают очень сходно, и поэтому употребление этих терминов может отражать лишь различия в объемах, массе поглощенных веществ. Общее для этих процессов то, что поглощенные вещества на поверхности плазматической мембраны окружаются мембраной в виде вакуоли - эндосомы, которая перемещается внутрь клетки.
  Эндоцитоз, включая пиноцитоз и фагоцитоз, может быть неспецифическим или конститутивным, постоянным и специфическим, опосредуемым рецепторами (рецепторным). Неспецифический эндоцитоз (пиноцитоз и фагоцитоз), так называется потому, что он протекает как бы автоматически и часто может приводить к захвату и поглощению совершенно чуждых или безразличных для клетки веществ, например, частичек сажи или красителей.
  Неспецифический эндоцитоз часто сопровождается первоначальной сорбцией захватывающего материала гликокаликсом плазмолеммы. Гликокаликс из-за кислых групп своих полисахаридов имеет отрицательный заряд и хорошо связывается с различными положительно заряженными группами белков. При таком адсорбционном неспецифическом эндоцитозе поглощаются макромолекулы и мелкие частицы (кислые белки, ферритин, антитела, вирионы, коллоидные частицы). Жидкофазный пиноцитоз приводит к поглощению вместе с жидкой средой растворимых молекул, которые не связываются с плазмолеммой.
  На следующем этапе происходит изменение морфологии клеточной поверхности: это или возникновение небольших впячиваний плазматической мембраны, инвагинации, или же это появление на поверхности клетки выростов, складок или "оборок" (рафл - по-английски), которые как бы захлестываются, складываются, отделяя небольшие объемы жидкой среды (рис. 135, 136). Первый тип возникновения пиноцитозного пузырька, пиносомы, характерен для клеток кишечного эпителия, эндотелия, для амеб, второй - для фагоцитов и фибробластов. Эти процессы зависят от поступления энергии: ингибиторы дыхания блокируют эти процессы.
  Вслед за такой перестройкой поверхности следует и процесс слипания и слияния контактирующих мембран, который приводит к образованию пеницитозного пузырька (пиносома), отрывающегося от клеточной поверхности и уходящего вглубь цитоплазмы. Как неспецифический так и рецепторный эндоцитоз, приводящий к отщеплению мембранных пузырьков, происходит в специализированных участках плазматической мембраны. Это так называемые окаймленные ямки. Они называются так потому, что со стороны цитоплазмы плазматическая мембрана покрыта, одета, тонким (около 20 нм) волокнистым слоем, который на ультратонких срезах как бы окаймляет, покрывает небольшие впячивания, ямки (рис. 137). Эти ямки есть почти у всех клеток животных, они занимают около 2% клеточной поверхности. Окаймляющий слой состоит в основном из белка клатрина, ассоциированного с рядом дополнительных белков. Три молекулы клатрина вместе с тремя молекулами низкомолекулярного белка образуют структуру трискелиона, напоминающего трехлучевую свастику (рис. 138). Клатриновый трискелионы на внутренней поверхности ямок плазматической мембраны образуют рыхлую сеть, состоящую из пяти- и шестиугольников, в целом напоминающую корзинку. Клатриновый слой одевает весь периметр отделяющихся первичных эндоцитозных вакуолей, окаймленных пузырьков.
  Клатрин относится к одному из видов т.н. "одевающих" белков (COP - coated proteins). Эти белки связываются с интегральными белками-рецепторами со стороны цитоплазмы и образуют одевающий слой по периметру возникающей пиносомы, первичного эндосомного пузырька - "окаймленного" пузырька. в отделении первичной эндосомы участвуют также белки - динамины, которые полимеризуются вокруг шейки отделяющегося пузырька (рис. 139).
  После того как окаймленный пузырек отделится о плазмолеммы и начнет переноситься вглубь цитоплазмы клатриновый слой распадается, диссоциирует, мембрана эндосом (пиносом) приобретает обычный вид. После потери клатринового слоя эндосомы начинают сливаться друг с другом.
  Было найдено, что мембраны окаймленных ямок содержат сравнительно мало холестерина, что может определять снижение жесткости мембран и способствовать образованию пузырьков. Биологический смысл появления клатриновой "шубы" по периферии пузырьков, возможно, заключается в том, что он обеспечивает сцепление окаймленных пузырьков с элементами цитоскелета и последующий их транспорт в клетке, и препятствует их слиянию друг с другом.
  Интенсивность жидкофазного неспецифического пиноцитоза может быть очень высокой. Так клетка эпителия тонкого кишечника образует до 1000 пиносом в секунду, а макрофаги образуют около 125 пиносом в минуту. Размер пиносом невелик, их нижний предел составляет 60-130 нм, но обилие их приводит к тому, что при эндоцитозе плазмолемма быстро замещается, как бы "тратится" на образование множества мелких вакуолей. Так у макрофагов вся плазматическая мембрана заменяется за 30 минут, у фибробластов - за два часа.
  Дальнейшая судьба эндосом может быть различной, часть из них может возвращаться к поверхности клетки и сливаться с ней, но большая часть вступает в процесс внутриклеточного пищеварения. Первичные эндосомы содержат в основном захваченные в жидкой среде чужеродные молекулы и не содержат гидролитических ферментов. эндосомы могут сливаться друг с другом при этом увеличиваясь в размере. Они затем сливаются с первичными лизосомами (см. ниже), которые вводят в полость эндосом ферменты, гидролизующие различные биополимеры. Действие этих лизосомных гидролаз и вызывает внутриклеточное пищеварение - распад полимеров до мономеров.
  Как уже указывалось, в ходе фагоцитоза и пиноцитоза клетки теряют большую площадь плазмолеммы (см. макрофаги), которая однако довольно быстро восстанавливается при рециклизации мембран, за счет возвращения вакуолей и их встраивания в плазмолемму. Это происходит вследствие того, что от эндосом или вакуолей, так же как и от лизосом могут отделяться небольшие пузырьки, которые вновь сливаются с плазмолеммой. При такой рециклизации происходит как бы "челночный" перенос мембран: плазмолемма - пиносома - вакуоль - плазмолемма. Это ведет к восстановлению исходной площади плазматической мембраны. Найдено, что при таком возврате, рециклизации мембран, в оставшейся эндосоме удерживается весь поглощенный материал.
  Специфический или опосредуемый рецепторами эндоцитоз имеет ряд отличий от неспецифического. Главное в том, что поглощаются молекулы, для которых на плазматической мембране есть специфические рецепторы, ассоциирующиеся только с данным типом молекул. Часто такие молекулы, связывающиеся с белками-рецепторами на поверхности клеток, называют лигандами.
  Впервые опосредуемый рецепторами эндоцитоз был описан при накоплении белков в ооцитах птиц. Белки желточных гранул, вителлогенины, синтезируются в различных тканях, но затем с током крови попадают в яичники, где связываются со специальными мембранными рецепторами ооцитов и затем с помощью эндоцитоза попадают внутрь клетки, где и происходит отложение желточных гранул.
  Другой пример избирательного эндоцитоза представляет собой транспорт в клетку холестерина. Этот липид синтезируется в печени и в комплексе с другими фосфолипидами и белковой молекулой образует т.н. липопротеид низкой плотности (ЛНП), который секретируется клетками печени и кровеносной системой разносится по всему телу (рис. 140). Специальные рецепторы плазматической мембраны, диффузно расположенные на поверхности различных клеток, узнают белковый компонент ЛНП, и образуют специфический комплекс рецептор-лиганд. Вслед за этим такой комплекс перемещается в зону окаймленных ямок и интернализуется - окружается мембраной и погружается вглубь цитоплазмы. Показано, что мутантные рецепторы могут связывать ЛНП, но не аккумулируются в зоне окаймленные ямок. Кроме рецепторов к ЛНП обнаружено более двух десятков других, участвующих в рецепторном эндоцитозе различных веществ, все они используют один и тот же путь интернализации через окаймленные ямки. Вероятно, их роль заключается в накапливании рецепторов: одна и та же окаймленная ямка может собрать около 1000 рецепторов разного класса. Однако у фибробластов кластеры рецепторов ЛНП расположены в зоне окаймленных ямок даже в отсутствие лиганда в среде.
  Дальнейшая судьба поглощенной частицы ЛНП заключается в том, что она подвергается распаду в составе вторичной лизосомы. После погружения в цитоплазму окаймленного пузырька, нагруженного ЛНП, происходит быстрая потеря клатринового слоя, мембранные пузырьки начинают сливаться друг с другом, образуя эндосому - вакуоль, содержащую поглощенные ЛНП-частицы, связанные еще с рецепторами на поверхности мембраны. Затем происходит диссоциация комплекса лиганд-рецептор, от эндосомы отщепляются мелкие вакуоли, мембраны которых содержат свободные рецепторы. Эти пузырьки рециклируются, включаются в плазматическую мембрану, и тем самым, рецепторы возвращаются на поверхность клетки. Судьба же ЛНП состоит в том, что после слияния с лизосомами, они гидролизуются до свободного холестерина, который может включаться в клеточные мембраны.
  Эндосомы характеризуются более низким значением рН (рН 4-5), более кислой средой, чем другие клеточные вакуоли. Это связано с наличием в их мембранах белков протонного насоса, закачивающих ионы водорода с одновременной затратой АТФ (Н+-зависимая АТФаза). Кислая среда внутри эндосом играет решающую роль в диссоциации рецепторов и лигандов. Кроме того, кислая среда является оптимальной для активации гидролитических ферментов в составе лизосом, которые активируются при слиянии лизосом с эндосомами и приводят к образованию эндолизосомы, в которой и происходит расщепление поглощенных биополимерв.
  В некоторых случаях судьба диссоциированных лигандов не связана с лизосомным гидролизом. Так в некоторых клетках после связывания рецепторов плазмолеммы с определенными белками, покрытые клатрином вакуоли погружаются в цитоплазму и переносятся к другой области клетки, где сливаются снова с плазматической мембраной, а связанные белки диссоциируют от рецепторов. Так осуществляется перенос, трансцитозис, некоторых белков через стенку эндотелиальной клетки из плазмы крови во межклеточную среду (рис. 141). Другой пример трансцитоза - перенос антител. Так у млекопитающих антитела матери, могут передаваться детенышу через молоко. В этом случае комплекс рецептор-антитело остается в эндосоме без изменений.
  Фагоцитоз
  Как уже говорилось, фагоцитоз является вариантом эндоцитоза и связан с поглощением клеткой крупных агрегатов макромолекул вплоть до живых или мертвых клеток. Так же как и пиноцитоз, фагоцитоз может быть неспецифическим (например, поглощение фибробластами или макрофагами частичек коллоидного золота или полимера декстрана) и специфическим, опосредуемым рецепторами на поверхности плазматической мембраны фагоцитирующих клеток. При фагоцитозе происходит образование больших эндоцитозных вакуолей - фагосом, которые затем сливаясь с лизосомами образуют фаголизосомы.
  На поверхности клеток, способных к фагоцитозу (у млекопитающих это нейтрофилы и макрофаги) существует набор рецепторов, взаимодействующих с белками-лигандами. Так при бактериальных инфекциях антитела к белкам бактерий связываются с поверхностью бактериальных клеток, образуя слой, в котором Fc-области антител смотрят наружу. Этот слой узнается специфическими рецепторами на поверхности макрофагов и нейтрофилов, и в местах их связывания начинается поглощение бактерии путем обволакивания ее плазматической мембраной клетки (рис. 142).
  Экзоцитоз
  Плазматическая мембрана принимает участие в выведении веществ из клетки с помощью экзоцитоза - процесса, обратного эндоцитозу (см. рис. 133).
  В случае экзоцитоза, внутриклеточные продукты, заключенные в вакуоли или пузырьки и отграниченные от гиалоплазмы мембраной, подходят к плазматической мембране. В местах их контактов плазматическая мембрана и мембрана вакуоли сливаются, и пузырек опустошается в окружающую среду. С помощью экзоцитоза происходит процесс рециклизации мембран, участвующих в эндоцитозе.
  С экзоцитозом связано выделение синтезированных в клетке разнообразных веществ. Секретирующие, выделяющие вещества во внешнюю среду, клетки могут вырабатывать и выбрасывать низкомолекулярные соединения (ацетилхолин, биогенные амины и др.), а также в большинстве случаев макромолекулы (пептиды, белки, липопротеиды, пептидогликаны и др.). Экзоцитоз или секреция в большинстве случаев происходит в ответ на внешний сигнал (нервный импульс, гормоны, медиаторы и др.). Хотя в ряде случаев экзоцитоз происходит постоянно (секреция фибронектина и коллагена фибробластами). Сходным образом из цитоплазмы растительных клеток выводятся некоторые полисахариды (гемицеллюлозы), участвующие в образовании клеточных стенок.
  Большинство секретируемых веществ используется другими клетками многоклеточных организмов (секреция молока, пищеварительных соков, гормонов и др.). Но часто клетки секретируют вещества и для собственных нужд. Так например рост плазматической мембраны осуществляется за счет встраивания участков мембраны в составе экзоцитозных вакуолей, часть элементов гликокаликса выделяется клеткой в виде гликопротеидных молекул и т.д.
  Выделенные из клеток путем экзоцитоза гидролитические ферменты могут сорбироваться в слое гликокаликса и обеспечивать примембранное внеклеточное расщепление различных биополимеров и органических молекул. Огромное значение примембранное неклеточное пищеварение имеет для животных. Было обнаружено, что в кишечном эпителии млекопитающих в зоне так называемой щеточной каемки всасывающего эпителия, особенно богатой гликокаликсом, обнаруживается огромное количество разнообразных ферментов. Часть этих же ферментов имеет панкреатическое происхождение (амилаза, липазы, различные протеиназы и др.), а часть выделяется собственно клетками эпителия (экзогидролазы, расщепляющие преимущественно олигомеры и димеры с образованием транспортируемых продуктов).
  Рецепторная роль плазмолеммы
  Мы уже встречались с этой особенностью плазматической мембраны при ознакомлении с ее транспортными функциями. Белки-переносчики и насосы являются кроме всего также рецепторами, узнающими и взаимодействующими с определенными ионами. Рецепторные белки связываются с лигандами и участвуют в отборе молекул, поступающих в клетки.
  В качестве таких рецепторов на поверхности клетки могут выступать белки мембраны или элементы гликокаликса - гликопротеиды. Такие чувствительные участки к отдельным веществам могут быть разбросаны по поверхности клетки или собраны в небольшие зоны.
  Разные клетки животных организмов могут обладать разными наборами рецепторов или же разной чувствительностью одного и того же рецептора.
  Роль многих клеточных рецепторов заключается не только в связывании специфических веществ или способности реагировать на физические факторы, но и в передаче межклеточных сигналов с поверхности внутрь клетки. В настоящее время хорошо изучена система передачи сигнала клеткам с помощью некоторых гормонов, в состав которых входят пептидные цепочки. Было найдено, что эти гормоны связываются со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны клетки. Рецепторы, после связи с гормоном активируют другой белок, лежащий уже в цитоплазматической части плазматической мембраны, - аденилатциклазу. Этот фермент синтезирует молекулу циклического АМФ из АТФ. Роль циклического АМФ (цАМФ) заключается в том, что он является вторичным мессенджером - активатором ферментов - киназ, вызывающих модификации других белков-ферментов. Так, при действии на печеночную клетку гормона поджелудочной железы глюкагона, вырабатываемого А-клетками островков Лангерганса, гормон связывается со специфическим рецептором, что стимулирует активацию аденилатциклазы. Синтезированный цАМФ активирует протеинкиназу А, которая в свою очередь активирует каскад ферментов, в конечном счете расщепляющих гликоген (запасной полисахарид животных) до глюкозы. Действие инсулина заключается в обратном - он стимулирует вхождение глюкозы в печеночные клетки и отложение ее в виде гликогена.
  В целом цепь событий развертывается следующим образом: гормон взаимодействует специфически с рецепторной частью этой системы и, не проникая внутрь клетки, активирует аденилатциклазу, которая синтезирует цАМФ, активирующий или ингибирующий внутриклеточный фермент или группу ферментов. Таким образом, команда, сигнал от плазматической мембраны передается внутрь клетки. Эффективность этой аденилатциклазной системы очень высока. Так взаимодействие одной или нескольких молекул гормона может привести за счет синтеза множества молекул цАМФ к усилению сигнала в тысячи раз. В данном случае аденилатциклазная система служит преобразователем внешних сигналов.
  Существует и другой путь, при котором используются другие вторичные мессенджеры, - это т.н. фосфатидилинозитольный путь. Под действием соответствующего сигнала (некоторые нервные медиаторы и белки) активируется фермент фосфолипиза C, которая расщепляет фосфолипид фосфатидилинозитолдифосфат, который входит в состав плазматической мембраны. Продукты гидролиза этого липида, с одной стороны, активируют протеинкиназу C, которая вызывает активацию каскада киназ, что приводит к определенным клеточным реакциям, а с другой - приводит к освобождению ионов кальция, который регулирует целый ряд клеточных процессов.
  Другой пример рецепторной активности - рецепторы ацетилхолина, важного нейромедиатора. Ацетилхолин, освобождаясь из нервного окончания, связывается с рецептором на мышечном волокне, вызывает импульсное поступление Na+ в клетку (деполяризация мембраны), открывая сразу около 2000 ионных каналов в зоне нервно-мышечного окончания.
  Разнообразие и специфичность наборов рецепторов на поверхности клеток приводит к созданию очень сложной системы маркеров, позволяющих отличать свои клетки (той же особи или того же вида) от чужих. Сходные клетки вступают друг с другом во взаимодействия, приводящие к слипанию поверхностей (конъюгация у простейших и бактерий, образование тканевых клеточных комплексов). При этом клетки, отличающиеся набором детерминантных маркеров или не воспринимающие их, либо исключаются из такого взаимодействия, либо у высших животных уничтожаются в результате иммунологических реакций (см. ниже).
  С плазматической мембраной связана локализация специфических рецепторов, реагирующих на физические факторы. Так, в плазматической мембране или у ее производных у фотосинтетических бактерий и синезеленых водорослей локализованы белки-рецепторы (хлорофиллы), взаимодействующими с квантами света. В плазматической мембране светочувствительных клеток животных расположена специальная система фоторецепторных белков (родопсин), с помощью которых световой сигнал превращается в химический, что в свою очередь приводит к генерации электрического импульса.
  Межклеточное узнавание
  У многоклеточных организмов за счет межклеточных взаимодействий образуются сложные клеточные ансамбли, поддержание которых может осуществляться разными путями. В зародышевых, эмбриональных тканях, особенно на ранних стадиях развития, клетки остаются в связи друг с другом за счет способности их поверхностей слипаться. Это свойство адгезии (соединения, сцепления) клеток может определяться свойствами их поверхности, которые специфически взаимодействуют друг с другом. Механизм этих связей достаточно хорошо изучен, он обеспечивается взаимодействием между гликопротеидами плазматических мембран. При таком межклеточном взаимодействии клеток между плазматическими мембранами всегда остается щель шириной около 20 нм, заполненная гликокаликсом. Обработка ткани ферментами, нарушающими целостность гликокаликса (муказы, действующие гидролитически на муцины, мукополисахариды) или повреждающие плазматическую мембрану (протеазы), приводит к обособлению клеток друг от друга, к их диссоциации. Однако если удалить фактор диссоциации, то клетки могут снова собираться, реагрегировать. Так можно диссоциировать клетки разных по окраске губок, оранжевых и желтых. Оказалось, что в смеси этих клеток образуются два типа агрегатов: состоящие только из желтых и только из оранжевых клеток. При этом смешанные клеточные суспензии самоорганизуются, восстанавливая исходную многоклеточную структуру. Сходные результаты были получены с суспензиями разделенных клеток эмбрионов амфибий; в этом случае происходит избирательное пространственное обособление клеток эктодермы от энтодермы и от мезенхимы. Более того, если для реагрегации используются ткани поздних стадий развития зародышей, то в пробирке самостоятельно собираются различные клеточные ансамбли, обладающие тканевой и органной специфичностью, образуются эпителиальные агрегаты, сходные с почечными канальцами, и т.д.
  Было найдено, что за агрегацию однородных клеток отвечают трансмембранные гликопротеиды. Непосредственно за соединение, адгезию, клеток отвечают молекулы т.н. CAM-белков (cell adhesion molecules). Некоторые из них связывают клетки друг с другом за счет межмолекулярных взаимодействий, другие образуют специальные межклеточные соединения или контакты.
  Взаимодействия между адгезивными белками может быть гомофильные, когда соседние клетки связываются друг с другом с помощью однородных молекул, гетерофильные, когда в адгезии участвуют разного рода CAM на соседних клетках. Встречается межклеточное связывание через дополнительные линкерные молекулы.
  CAM-белков бывает несколько классов. Это кадгерины, иммуноглобулино-подобные N-CAM (молекулы адгезии нервных клеток), селектины, интегрины.
  Кадгерины представляют собой интегральные фибриллярные мембранные белки, которые образуют параллельные гомодимеры. Отдельные домены этих белков связаны с ионами Ca2+, что придает им определенную жесткость. Кадгеринов насчитывают более 40 видов. Так Е-кадгерин характерен для клеток преимплантированных эмбрионов и для эпителиальных клеток взрослых организмов. P-кадгерин характерен для клеток трофобласта, плаценты и эпидермиса, N-кадгерин располагается на поверхности нервных клеток, клеток хрусталика, на сердечных и скелетных мышцах.
  Молекулы адгезии нервных клеток (N-CAM) принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов, они образуют связи между нервными клетками. Некоторые из N-CAM участвуют в соединении синапсов, а также при адгезии клеток иммунной системы.
  Селектины также интегральные белки плазматической мембраны участвуют в адгезии эндотелиальных клеток, в связывании кровяных пластинок, лейкоцитов.
  Интегрины представляют собой гетеродимеры, с ? и ?-цепями. Интегрины в первую очередь осуществляют связь клеток с внеклеточными субстратами, но могут участвовать и в адгезии клеток друг с другом.
  Узнавание чужеродных белков
  Как уже указывалось, на попавшие в организм чужеродные макромолекулы (антигены), развивается сложная комплексная реакция - иммунная реакция. Суть ее заключается в том, что часть лимфоцитов вырабатывает специальные белки - антитела, которые специфически связываются с антигенами. Так, например, макрофаги своими поверхностными рецепторами узнают комплексы антиген-антитело и поглощают их (например, поглощение бактерий при фагоцитозе).
  В организме всех позвоночных, кроме того, существует система рецепции чужеродных клеток или же своих, но с измененными белками плазматической мембраны, например при вирусных инфекциях или при мутациях, часто связанных с опухолевым перерождением клеток.
  На поверхности всех клеток позвоночных располагаются белки, т.н. главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex - MHC). Это интегральные белки гликопротеины, гетеродимеры. Очень важно запомнить, что каждый индивидум имеет свой набор таких белков MHC. Это связано с тем, что они очень полиморфны, т.к. в каждом индивидуме имеется большое число альтериальных форм одного и того же гена (более 100), кроме того имеется 7-8 локусов, кодирующих молекулы MHC. Это приводит к тому, что каждая клетка данного организма, имея набор белков MHC, будет отличаться от клеток индивидума этого же вида. Специальная форма лимфоцитов, Т-лимфоциты, узнают MHC своего организма, но малейшие изменения в структуре MHC (например, связь с вирусом, или результат мутации в отдельных клетках), приводит к тому, что Т-лимфоциты узнают такие изменившиеся клетки и их уничтожают, но не путем фагоцитоза. Они выделяют из секреторных вакуолей специфические белки-перфорины, которые встраиваются в цитоплазматическую мембрану измененной клетки, образуют в ней трансмембранные каналы, делая плазматическую мембрану проницаемой, что и приводит к гибели измененной клетки (рис. 143, 144).
  Специальные межклеточные соединения
  Кроме таких сравнительно простых адгезивных (но специфических) связей (рис. 145) существует целый ряд специальных межклеточных структур, контактов или соединений, которые выполняют определенные функции. Это запирающие, заякоревающие и коммуникационные соединения (рис. 146).
  Запирающее или плотное соединение характерно для однослойных эпителиев. Это зона, где внешние слои двух плазматических мембран максимально сближены. Часто видна трехслойность мембраны в этом контакте: два внешних осмофильных слоя обеих мембран как бы сливаются в один общий слой толщиной 2-3 нм. Слияние мембран происходит не по всей площади плотного контакта, а представляет собой ряд точечных сближений мембран (рис. 147а, 148).
  На плоскостных препаратах разломов плазматической мембраны в зоне плотного контакта с помощью метода замораживания и скалывания было обнаружено, что точки соприкосновения мембран представляют собой ряды глобул. Это белки окклудин и клаудин, специальные интегральные белки плазматической мембраны, встроенные рядами. Такие ряды глобул или полоски могут пересекаться так, что образуют на поверхности скола как бы решетку или сеть. Очень характерна эта структура для эпителиев, особенно железистых и кишечных. В последнем случае плотный контакт образует сплошную зону слияния плазматических мембран, опоясывающую клетку в апикальной (верхней, смотрящей в просвет кишечника) ее части (рис. 148). Таким образом, каждая клетка пласта как бы обведена лентой этого контакта. Такие структуры при специальных окрасках можно видеть и в световом микроскопе. Они получили у морфологов название замыкающих пластинок. Оказалось, что в данном случае роль замыкающего плотного контакта заключается не только в механическом соединении клеток друг с другом. Эта область контакта плохо проницаема для макромолекул и ионов, и тем самым она запирает, перегораживает межклеточные полости, изолируя их (и вместе с ними собственно внутреннюю среду организма) от внешней среды (в данном случае - просвет кишечника).
  Это можно продемонстрировать, используя электронноплотные контрастеры, например раствор гидроокиси лантана. Если просвет кишечника или протока какой-нибудь железы наполнить раствором гидроокиси лантана, то на срезах под электронным микроскопом зоны, где располагается это вещество, обладают высокой электронной плотностью и будут темными. Оказалось, что ни зона плотного контакта, ни межклеточные пространства, лежащие ниже его, не темнеют. Если же повредить плотные контакты (легкой ферментативной обработкой или удалением ионов Ca++), то лантан проникает и в межклеточные участки. Точно так же была доказана непроницаемость плотных контактов для гемоглобина и ферритина в канальцах почек.
  Таким образом, плотные контакты являются барьерами не только для макромолекул, но и непроницаемы для жидкостей и ионов.
  Замыкающий, или плотный, контакт встречается между всеми типами однослойного эпителия (эндотелий, мезотелий, эпендима).
  Заякоривающие или сцепляющие соединения или контакты так называются из-за того, что они соединяют не только плазматические мембраны соседних клеток, но и связываются с фибриллярными элементами цитоскелета (рис. 149). Для этого рода соединений характерным является наличие двух типов белков. Один из них - это трансмембранные линкерные (связующие) белки, которые участвуют или в собственно межклеточном соединении или в соединении плазмолеммы с компонентами внеклеточного матрикса (базальная мембрана эпителиев, внеклеточные структурные белки соединительной ткани).
  Второй - внутриклеточные белки, соединяющие или заякоревающие за мембранные элементы такого контакта цитоплазматические фибриллы цитоскелета.
  К заякоревающим соединениям относятся межклеточные сцепляющие точечные контакты, сцепляющие ленты, фокальные контакты или бляшки сцепления - все эти контакты связываются внутри клеток с актиновыми микрофиламентами.
  Другая группа заякоревающих межклеточных соединений - десмосомы и полудесмосомы - связываются с другими элементами цитоскелета, а именно с промежуточными филаментами.
  Межклеточные точечные сцепляющие соединения обнаружены у многих неэпителиальных тканей, но более отчетливо описана структура специальных (адгезивных) лент в однослойных эпителиях (рис. 150). Это структура опоясывает весь периметр эпителиальной клетки, подобно тому как это происходит в случае плотного соединения. Чаще всего такой поясок или лента лежит ниже плотного соединения (см. рис. 146). В этом месте плазматические мембраны не сближены, а даже несколько раздвинуты на расстояние 25-30 нм, и между ними видна зона повышенной плотности. Это ничто иное как места взаимодействия трансмембранных гликопротеидов, которые специфически сцепляются друг с другом и обеспечивают механическое соединение мембран двух соседних клеток. Эти линкерные белки относятся к Е-кадгеринам - белкам, обеспечивающим специфическое узнавание клетками однородных мембран. Разрушение этого слоя гликопротеидов приводит к обособлению отдельных клеток и разрушению эпителиального пласта. С цитоплазматической стороны около мембраны видно скопление какого-то плотного вещества, к которому примыкает слой тонких (6-7 нм) филаментов, лежащих вдоль плазматической мембраны в виде пучка, идущего по всему периметру клетки. Тонкие филаменты относятся к актиновым фибриллам, они связываются с плазматической мембраной посредством белка катенина, образующего плотный около мембранный слой.
  Функциональное значение такого ленточного соединения заключается на только в механическом сцеплении клеток друг с другом: при сокращении актиновых филаментов в ленте может изменяться форма клетки. Считается, что кооперативное сокращение актиновых фибрилл во всех клетках эпителиального пласта может вызвать изменение его геометрии, например, сворачивание в трубку, подобно тому, что происходит при образовании нервной трубки у эмбрионов позвоночных.
  Фокальные контакты или бляшки сцепления встречаются у многих клеток и особенно хорошо изучены у фибробластов. Они построены по общему плану со сцепляющими лентами, но выражены в виде небольших участков - бляшек на плазмолемме. В этом случае трансмембранные линкерные белки-интегрины специфически связываются с белками внеклеточного матрикса (например с фибронектином) (рис. 151). Со стороны цитоплазмы эти же гликопротеиды связаны с примембранными белками, куда входит и винкулин, который в свою очередь связан с пучком актиновых филаментов. Функциональное значение фокальных контактов заключается как в закреплении клетки на внеклеточных структурах, так и создании механизма, позволяющего клеткам перемещаться.
  Десмосомы, структуры в виде бляшек или кнопок также соединяют клетки друг с другом (рис. 152, 153а). В межклеточном пространстве здесь также виден плотный слой, представленный взаимодействующими интегральными мембранными кадгеринами - десмоглеинами, которые сцепляют клетки друг с другом. С цитоплазматической стороны к плазмолемме прилежит слой белка-десмоплакина, с которым связаны промежуточные филаменты цитоскелета. Десмосомы встречаются чаще всего в эпителиях, в этом случае промежуточные филаменты содержат кератины. В сердечной мышце клетки, кардиомиоциты, содержат десминовые фибриллы в составе десмосом. В эндотелии сосудов в состав десмосом входят виментиновые промежуточные филаменты.
  Полудесмосомы - в принципе сходны по строению с десмосомой, но представляют собой соединение клеток с межклеточными структурами. Так в эпителиях линкерные гликопротеиды (интегрины) десмосомы взаимодействуют с белками т.н. базальной мембраны, куда входят коллаген, ламинин, протеогликаны и др.
  Функциональная роль десмосом и полудесмосом сугубо механическая - они сцепляют клетки друг с другом и с подлежащим внеклеточным матриксом прочно, что позволяет эпителиальным пластам выдерживать большие механические нагрузки. Подобно этому десмосомы прочно связывают друг с другом клетки сердечной мышцы, что позволяет им выполнять огромную механическую нагрузку, оставаясь связанными в единую сокращающуюся структуру.
  В отличие от плотного контакта все типы сцепляющих контактов проницаемы для водных растворов и не играют никакой роли в ограничении диффузии.
  Щелевые контакты считаются коммуникационными соединениями клеток; это структуры, которые участвуют в прямой передаче химических веществ из клетки в клетку, что может играть большую физиологическую роль не только при функционировании специализированных клеток, но и обеспечивать межклеточные взаимодействия при развитии организма, при дифференцировке его клеток. Характерным для этого типа контактов является сближение плазматических мембран двух соседних клеток на расстояние 2-3 нм (рис. 147б, 153б). Именно это обстоятельство долгое время не позволяло на ультратонких срезах отличить данный вид контакта от плотного разделительного (замыкающего) контакта. При использовании гидроокиси лантана было замечено, что некоторые плотные контакты пропускают контрастер. В этом случае лантан заполнял тонкую щель шириной около 3 нм между сближенными плазматическими мембранами соседних клеток. Это и послужило появлению термина - щелевой контакт. Дальнейший прогресс в расшифровке его строения был достигнут при использовании метода замораживания-скалывания. Оказалось, что на сколах мембран зоны щелевых контактов (размеров от 0,5 до 5 мкм) усеяны гексагонально расположенными с периодом 8-10 нм частицами 7-8 нм в диаметре, имеющими в центре канал около 2 нм шириной. Эти частицы получили название коннексонов (рис. 154). В зонах щелевого контакта может быть от 10-20 до нескольких тысяч коннексонов в зависимости от функциональных особенностей клеток. Коннексоны были выделены препаративно, они состоят из шести субъединиц коннектина - белка с молекулярным весом около 30 тыс. Объединяясь друг с другом, коннектины образуют цилиндрический агрегат - коннексон, в центре которого располагается канал. Отдельные коннексоны встроены в плазматическую мембрану так, что прободают ее насквозь. Одному коннексону на плазматической мембране клетки точно противостоит коннексон на плазматической мембране соседней клетки так, что каналы двух коннексонов образуют единое целое. Коннексоны играют роль прямых межклеточных каналов, по которым ионы и низкомолекулярные вещества могут диффундировать из клетки в клетку. Было обнаружено, что коннексоны могут закрываться, изменяя диаметр внутреннего канала, и тем участвовать в регуляции транспорта молекул между клетками.
  Функциональное значение щелевых контактов было понято при изучении гигантских клеток слюнных желез двукрылых. В такие клетки благодаря их величине легко можно вводить микроэлектроды, для того чтобы изучать электропроводимость их мембран. Оказалось, что если ввести электроды в две соседние клетки, то их плазматические мембраны проявляют низкое электрическое сопротивление, между клетками идет ток. Более того, оказалось, что при инъекции в одну клетку флуоресцирующего красителя метка быстро обнаруживается в соседних клетках. Используя разные флуорохромы, на клетках культуры ткани млекопитающих было обнаружено, что через щелевые контакты могут транспортироваться вещества с молекулярным весом не более 1-1,5 тыс. и размером не более 1,5 нм (у насекомых через щелевой контакт могут проходить вещества с молекулярным весом до 2 тыс.). Среди этих веществ были разные ионы, аминокислоты, нуклеотиды, сахара, витамины, стероиды, гормоны, цАМФ. Ни белки, ни нуклеиновые кислоты через щелевые контакты проходить не могут.
  Такая способность щелевых контактов служить местом транспорта низкомолекулярных соединений используется в тех клеточных системах, где нужна быстрая передача электрического импульса (волны возбуждения) от клетки к клетке без участия нервного медиатора. Так, все мышечные клетки миокарда сердца связаны с помощью щелевых контактов (кроме того, клетки там связаны и адгезивными контактами) (рис. 147б). Это создает условие для синхронного сокращения огромного количества клеток. При росте культуры эмбриональных сердечных мышечных клеток (миокардиоциты) некоторые клетки в пласте начинают независимо друг от друга спонтанно сокращаться с разной частотой, и лишь только после образования между ними щелевых контактов они начинают биться синхронно как единый сокращающийся пласт клеток. Таким же способом обеспечивается совместное сокращение гладкомышечных клеток в стенке матки.
  Щелевые контакты могут служить целям метаболической кооперации между клетками, обмениваясь различными молекулами, гормонами, цАМФ или метаболитами. Примером этого может служить совместное культивирование мутантных по тимидин-киназе клеток с нормальными: при возникновении щелевых контактов между этими типами клеток, мутантные клетки через щелевые контакты получали от нормальных клеток тимидин-трифосфат и могли участвовать в синтезе ДНК.
  У ранних эмбрионов позвоночных, начиная с 8-клеточной стадии большинство клеток связано друг с другом щелевыми контактами. По мере дифференцировки эмбриона щелевые контакты между всеми клетками исчезают и остаются только между группами специализирующихся клеток. Например, при образовании нервной трубки связь клеток этой структуры с остальным эпидермисом прерывается, разобщается.
  Целостность и функционирование щелевых контактов сильно зависит от уровня ионов Ca2+ внутри клетки. В норме концентрация кальция в цитоплазме очень низка. Если Ca2+ инъецировать в одну из клеток пласта культуры тканей, то в соседних клетках увеличения уровня Ca2+ в цитоплазме не происходит; клетки как бы разобщаются с соседями, перестают проводить электрический ток и красители. Через некоторое время, после того как введенный кальций будет аккумулирован митохондриями, структура и функции щелевых контактов восстанавливаются. Такое свойство очень важно для поддержания целостности и работы всего слоя клеток, так как повреждение одной из них не передается на соседний через щелевые контакты, которые перестают работать как межклеточные диффузионные каналы.
  Синаптический контакт (синапсы). Этот тип контактов характерен для нервной ткани и встречается как между двумя нейронами, так и между нейроном и каким-либо иным элементом - рецептором или эффектором (например, нервно-мышечное окончание). Синапсы - участки контактов двух клеток, специализированных для односторонней передачи возбуждения или торможения от одного элемента к другому (рис. 155). В принципе подобного рода функциональная нагрузка, передача импульса может осуществляться и другими типами контактов (например, щелевым контактом в сердечной мышце), однако в синаптической связи достигается высокая эффективность в реализации нервного импульса. Синапсы образуются на отростках нервных клеток - это терминальные участки дендритов и аксонов. Межнейронные синапсы обычно имеют грушевидных расширений, бляшек на конце отростка нервной клетки. Такое терминальное расширение отростка одной из нервных клеток может контактировать и образовывать синаптическую связь как с телом другой нервной клетки, так и с ее отростками. Периферические отростки нервных клеток (аксоны) образуют специфические контакты с клетками-эффекторами или клетками-рецепторами. Следовательно, синапс - это структура, образующаяся между участками двух клеток (так же как и десмосома). Мембраны этих клеток разделены межклеточным пространством - синаптической щелью шириной около 20-30 нм. Часто в просвете этой щели виден тонковолокнистый, перпендикулярно расположенный по отношению к мембранам материал. Мембрана в области синаптического контакта одной клетки называется пресинаптической, другой, воспринимающей импульс, - постсинаптической. В электронном микроскопе обе мембраны выглядят плотными, толстыми. Около пресинаптической мембраны выявляется огромное количество мелких вакуолей, синаптических пузырьков, заполненных медиаторами. Синаптические пузырьки в момент прохождения нервного импульса выбрасывают свое содержимое в синаптическую щель. Постсинаптическая мембрана часто выглядит толще обычных мембран из-за скопления около нее со стороны цитоплазмы множества тонких фибрилл.
  Плазмодесмы. Этот тип межклеточных связей встречается у растений. Плазмодесмы представляют собой тонкие трубчатые цитоплазматические каналы, соединяющие две соседние клетки. Диаметр этих каналов обычно составляет 20-40 нм. Ограничивающая эти каналы мембрана непосредственно переходит в плазматические мембраны соседствующих клеток. Плазмодесмы проходят сквозь клеточную стенку, разделяющую клетки (рис. 156, 157). Таким образом, у некоторых растительных клеток плазмодесмы соединяют гиалоплазму соседних клеток, поэтому формально здесь нет полного разграничения, отделения тела одной клетки от другой, это скорее представляет собой синцитий: объединение многих клеточных территорий с помощью цитоплазматических мостиков. Внутрь плазмодесм могут проникать мембранные трубчатые элементы, соединяющие цистерны эндоплазматического ретикулума соседних клеток. Образуются плазмодесмы во время деления клетки, когда строится первичная клеточная оболочка (см. ниже). У только что разделившихся клеток число плазмодесм может быть очень велико (до 1000 на клетку), при старении клеток их число падает за счет разрывов при увеличении толщины клеточной стенки.
  Функциональная роль плазмодесм очень велика: с их помощью обеспечивается межклеточная циркуляция растворов, содержащих питательные вещества, ионы и другие соединения. По плазмодесмам могут перемещаться липидные капли Через плазмодесмы происходит заражение клеток растительными вирусами. Однако эксперименты показывают, что свободный транспорт через плазмодесмы ограничивается частицами с массой не более 800 дальтон.
  Клеточная стенка (оболочка) растений
  Если выделить любую клетку из организма животного и поместить ее в воду, то через короткое время клетка после набухания лопнет, лизируется. Это происходит из-за того, что через плазматическую мембрану вода будет поступать в цитоплазму, в зону с более высокой концентрацией солей и органических молекул. При этом будет увеличиваться внутренний объем клетки до тех пор, пока не разорвется плазматическая мембрана. В составе организма животных этого не происходит, потому что клетки низших и высших животных существуют в окружении жидкостей внутренней среды, концентрация солей и веществ в которой близка к таковой в цитоплазме. Свободноживущие в пресной воде одноклеточные простейшие организмы не лизируются (при отсутствии клеточной стенки) из-за того, что у них постоянно работает клеточный насос, откачивающий воду из цитоплазмы, - сократительная вакуоль.
  Если же мы в воду поместим клетки бактерий или растений, то они не будут лизироваться до тех пор, пока цела их клеточная стенка. Воздействием набора различных ферментов эти стенки можно растворить. В этом случае моментально происходит набухание и разрыв, лизис, клеток. Следовательно, в естественных условиях клеточная стенка предотвращает этот гибельный для клетки процесс. Более того, наличие клеточных стенок является одним из главных факторов, регулирующих поступление воды в клетку. Клетки бактерий и растений обитают чаще всего в гипотонической водной среде, они не имеют сократительных (выделительных) вакуолей, чтобы откачать воду, но зато прочная клеточная стенка предохраняет их от чрезвычайного набухания. По мере поступления воды в клетке возникает внутреннее давление, тургор, которое препятствует дальнейшему поступлению воды.
  Интересно, что у многих низших растений, например у зеленых водорослей, клетки имеют хорошо сформированную клеточную оболочку, но при половом размножении, когда образуются подвижные зооспоры, последние теряют клеточную оболочку и у них появляются пульсирующие вакуоли.
  Клеточная стенка растений формируется при участии плазматической мембраны и является экстраклеточным (внеклеточным) многослойным образованием, защищающим поверхность клетки, служащим как бы наружным скелетом растительной клетки (рис. 158). Клеточная стенка растений состоит из двух компонентов: аморфного пластичного гелеобразного матрикса (основы) с высоким содержанием воды и опорной фибриллярной системы. Часто для придания свойств жесткости, несмачиваемости и др. в состав оболочек входят дополнительные полимерные вещества и соли.
  В химическом отношении главные компоненты оболочек растений относятся к структурным полисахаридам.
  В состав матрикса оболочек растений входят гетерогенные группы полисахаридов, растворяющиеся в концентрированных щелочах, гемицеллюлозы и пектиновые вещества. Гемицеллюлозы представляют собой ветвящиеся полимерные цепи, состоящие из различных гексоз (глюкоза, манноза, галактоза и др.), пентоз (ксилоза, арабиноза) и уроновых кислот (глюкуроновая и галактуроновая кислоты). Эти компоненты гемицеллюлоз сочетаются между собой в разных количественных отношениях и образуют разнообразные комбинации. Цепи гемицеллюлозных молекул не кристаллизуются и не образуют элементарных фибрилл. Из-за наличия полярных групп уроновых кислот они сильно гидратированы.
  Пектиновые вещества - гетерогенная группа, в которую входят разветвленные сильно гидратированные полимеры, несущие отрицательные заряды из-за множества остатков галактуроновой кислоты. Благодаря свойствам своих компонентов матрикс представляет собой мягкую пластическую массу, укрепленную фибриллами.
  Волокнистые компоненты клеточных оболочек растений состоят обычно из целлюлозы, линейного, неветвящегося полимера глюкозы. Молекулярный вес целлюлозы варьирует от 5 х 104 до 5 х 105, что соответствует 300-3000 остаткам глюкозы. Такие линейные молекулы целлюлозы могут соединяться в пучки или волокна. В клеточной оболочке целлюлоза образует фибриллы, которые состоят из субмикроскопических микрофибрилл толщиной до 25 нм, которые в свою очередь состоят из множества параллельно лежащих цепей молекул целлюлозы.
  Количественные соотношения целлюлозы к веществам матрикса (гемицеллюлозы) могут быть весьма различными у разных объектов. Свыше 60% сухого веса первичных оболочек составляет их матрикс и около 30% приходится на скелетное вещество - целлюлозу. В сырых клеточных оболочках почти вся вода связана с гемицеллюлозами, поэтому вес основного вещества в набухшем состоянии достигает 80% сырого веса всей оболочки, тогда как содержание волокнистых веществ сводится всего к 12%. В случае же другого примера, волоски хлопчатника, целлюлозный компонент составляет 90%; в древесине целлюлоза составляет 50% от компонентов клеточной стенки.
  Кроме целлюлозы, гемицеллюлозы и пектинов в состав клеточных оболочек входят дополнительные компоненты, придающие им особые свойства. Так, инкрустация (включение внутрь) оболочек лигнином (полимер кониферилового спирта) приводит к одревеснению клеточных стенок, повышению их прочности (рис. 159). Лигнин замещает в таких оболочках пластические вещества матрикса и играет роль основного вещества, обладающего высокой прочностью. Часто матрикс бывает укреплен минеральными веществами (SiO2, CaCO3 и др.).
  На поверхностях клеточной оболочки могут скапливаться различные адкрустирующие вещества, например кутин и суберин, приводящие к опробковению клеток. В клетках эпидермиса на поверхности клеточных оболочек откладывается воск, который образует водонепроницаемый слой, препятствующий потере клеткой воды.
  Из-за своего пористого, рыхлого строения клеточная стенка растений проницаема в значительной степени для низкомолекулярных соединений, таких как вода, сахара и ионы. Но макромолекулы проникают через целлюлозные оболочки плохо: величина пор в оболочках, позволяющая свободную диффузию веществ составляет всего лишь 3-5 нм.
  Опыты с мечеными соединениями показали, что при росте клеточной оболочки выделение веществ, из которых она строится, происходит по всей поверхности клетки. Аморфные вещества матрикса, гемицеллюлозы и пектины синтезируются в вакуолях аппарата Гольджи и выделяются через плазмолемму путем экзоцитоза. Фибриллы целлюлозы синтезируются специальными ферментами, встроенными в плазмолемму.
  Оболочки дифференцированных, зрелых, клеток обычно многослойные, в слоях фибриллы целлюлозы ориентированы по-разному, и количество их также может значительно колебаться. Обычно описывают первичные, вторичные и третичные клеточные оболочки (рис. 158). Для того чтобы разобраться в строении и появлении этих оболочек, необходимо познакомиться с тем, как же возникают, образуются клеточные оболочки после деления клеток.
  При делении клеток растений после расхождения хромосом в экваториальной плоскости клеток появляется скопление мелких мембранных пузырьков, которые в центральной части клеток начинают сливаться друг с другом (рис. 160). Этот процесс слияния мелких вакуолей происходит от центра клетки к периферии и продолжается до тех пор, пока мембранные пузырьки не сольются между собой и с плазматической мембраной боковой поверхности клетки. Так образуется клеточная пластинка или фрагмопласт. В центральной части ее располагается аморфное вещество матрикса, которое наполняло сливающиеся пузырьки. Доказано, что эти первичные вакуоли происходят от мембран аппарата Гольджи. В состав первичной клеточной стенки входит также небольшое количество белка (около 10%), богатого гидроксипролином. имеющего множество коротких олигосахаридных цепей, что определяет этот белок как гликопротеид. По периферии клеточной пластинки при наблюдении ее в поляризованном свете обнаруживается заметное двойное лучепреломление, вызванное тем, что в этом месте располагаются ориентированные фибриллы целлюлозы. Таким образом, растущая первичная клеточная стенка состоит уже из трех слоев: центральный - срединная пластинка, состоящая только из аморфного матрикса, и два периферических - первичная оболочка, содержащая гемицеллюлозу и целлюлозные фибриллы. Если срединная пластинка - это продукт активности еще исходной клетки, то первичная оболочка образуется за счет выделения гемицеллюлозы и фибрилл целлюлозы уже двумя новыми клеточными телами. И все дальнейшее увеличение толщины клеточной (вернее, межклеточной) стенки будет происходить за счет активности двух дочерних клеток, которые с противоположных сторон будут выделять вещества клеточной оболочки, утолщающейся путем подслаивания все новых и новых пластов. Так же как и с самого начала, выделение веществ матрикса происходит за счет подхода к плазматической мембране пузырьков аппарата Гольджи, слияния их с мембраной и высвобождения их содержимого за пределы цитоплазмы. Здесь же вне клетки на ее плазматической мембране идет синтез и полимеризация целлюлозных фибрилл. Так постепенно образуется вторичная клеточная оболочка. С достаточной точностью определить и суметь отличить первичную оболочку от вторичной трудно, так как они соединены между собой несколькими промежуточными слоями.
  Основную массу закончившей свое формирование клеточной стенки составляет вторичная оболочка. Она придает клетке ее окончательную форму. После разделения клетки на две дочерних происходит рост новых клеток, увеличение их объема и изменение формы; клетки часто вытягиваются в длину. Одновременно с этим идет наращивание толщины клеточной оболочки и перестройка ее внутренней структуры.
  При образовании первичной клеточной оболочки в ее составе еще мало целлюлозных фибрилл, и они располагаются более или менее перпендикулярно будущей продольной оси клетки, позже в период растяжения (удлинения клетки за счет роста вакуолей в цитоплазме) ориентация этих поперечно-направленных фибрилл подвергается пассивным изменениям: фибриллы начинают размещаться под прямым углом друг к другу и в конечном счете оказываются вытянутыми более или менее параллельно продольной оси клетки. Постоянно идет процесс: в старых слоях (ближе к центру оболочки) фибриллы подвергаются пассивным сдвигам, а отложение новых фибрилл во внутренних слоях (ближайших к мембране клетки) продолжается в соответствии с исходным планом конструкции оболочки. Этот процесс создает возможность скольжения фибрилл относительно друг друга, а перестройка арматуры клеточной оболочки возможна из-за студенистого состояния компонентов ее матрикса. В дальнейшем при замещении в матриксе гемицеллюлозы на лигнин подвижность фибрилл резко снижается, оболочка становится плотной, происходит одревеснение.
  Часто под вторичной оболочкой обнаруживают третичную оболочку, которую можно рассматривать как засохший остаток дегенерировавшего слоя собственно цитоплазмы.
  Следует отметить, что при делении клеток растений формированию первичной оболочки не во всех случаях предшествует образование клеточной пластинки. Так, у зеленой водоросли спирогиры новые поперечные перегородки возникают путем образования на боковых стенках исходной клетки выступов, которые, постепенно разрастаясь к центру клетки, смыкаются и делят клетку надвое.
  Как уже говорилось, если в водной гипотонической среде лишить клетку ее оболочки, то произойдет лизис, разрыв клетки. Оказалось, что, подбирая соответствующие концентрации солей и сахаров, можно уравнять осмотические давления снаружи и внутри клеток, лишенных своих оболочек. При этом такие протопласты приобретают шаровидную форму (сферопласты). Если в среде, где находятся протопласты, будет достаточное количество питательных веществ и солей (среди них необходим Ca2+), то клетки снова восстанавливают , регенерируют свою клеточную оболочку. Более того, они способны в присутствии гормонов - ауксинов - делиться и создавать клеточные колонии, которые могут дать начало для роста целого растения, от которого была взята клетка.
  Главный волокнистый компонент клеточной стенки больших групп грибов (базибиомицеты, аскомицеты, зигомицеты) - хитин, полисахарид, где основным сахаридом является N-ацетилглюкозамин. В состав клеточной стенки грибов кроме хитина могут входить вещества матрикса, гликопротеиды и различные белки, синтезированные в цитоплазме и выделенные клеткой наружу.
  Клеточные оболочки бактерий
  Опорным каркасом клеточной стенки бактерий и синезеленых водорослей также служит в значительной степени однородный полимер - пептидогликан или муреин. Жесткий каркас, окружающий бактериальную клетку, представляет собой одну гигантскую мешковидную молекулу сложного полисахарида-пептида. Каркас этот называют муреиновым мешком. Основа структуры муреинового мешка - сеть параллельных полисахаридных цепей, построенных из чередующихся дисахаридов (ацетилглюкозамин, соединенный с ацетилмурамовой кислотой), связанных многочисленными пептидными поперечными связями (рис. 161). Длина цепочек гликана может быть огромной - до нескольких сот дисахаридных блоков. Основу пептидной части муреина составляют тетрапептиды, образованные различными аминокислотами.
  Бактериальная стенка может составлять до 20-30% от сухого веса бактерии. Это связано с тем, что в ее состав кроме многослойного муреинового каркаса входит большое количество дополнительных компонентов, как и в матриксе стенки растений. У грамположительных бактерий (при окраске по Граму (окраска кристаллическим фиолетовым, обработка иодом, отмывка спиртом) бактерии по-разному воспринимают краситель: грамположительные остаются окрашенными после обработки спиртом; грамотрицательные обесцвечиваются). сопутствующими компонентами служат полимерные вещества, сложным образом вплетенные в муреиновую сеть. К ним относятся тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды и белки. Клеточная стенка грамположительных бактерий обладает большой жесткостью, ее муреиновая сеть многослойна.
  Стенки грамотрицательных бактерий содержат однослойную муреиновую сеть, составляющую 12% сухой массы стенки. Сопутствующие компоненты составляют до 80% сухой массы. Это липопротеиды, сложные липополисахариды. Они образуют сложную наружную липопротеиновую мембрану. Следовательно, периферия грамотрицательных бактерий содержит наружную мембрану, затем однослойную муреиновую сеть, ниже нее расположена плазматическая мембрана (рис. 162). Наружная мембрана обеспечивает структурную целостность клетки, служит барьером, ограничивающим свободный доступ разных веществ к плазматической мембране. На ней также могут располагаться рецепторы для бактериофагов. Она содержит белки-порины, которые участвуют в переносе многих низкомолекулярных веществ. Молекулы порина образуют тримеры, проходящие сквозь толщу мембраны. Одна из функций этих белков - формирование в мембране гидрофильных пор, через которые происходит диффузия молекул, не более 900 дальтон. Через поры проходят свободно сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды. Поры образованы разными поринами, обладают разной проницаемостью.
  Между внешней липопротеидной мембраной бактериальной стенки и плазматической мембраной лежит периплазматическое пространство или периплазма. Ее толщина обычно составляет около 10 нм, она содержит тонкий (1-3 нм) муреиновый слой и раствор, содержащий специфические белки двух типов - гидролитические ферменты и транспортные белки. Из-за наличия гидролаз иногда периплазму рассматривают как аналог лизосомного компартмента эукариот. Периплазматические транспортные белки связывают и переносят сахара, аминокислоты и др. от внешней мембраны к плазмолемме.
  Предшественники стенок бактерий синтезируются внутри клетки, сборка стенок происходит снаружи от плазматической мембраны.
  Под действием фермента лизоцима можно разорвать муреиновый каркас и растворить бактериальную стенку. В гипотонических условиях клетки при этом разрушаются, как разрушаются голые клетки животных и растений; в изотонических условиях образуются шаровидные протопласты, которые способны снова вырабатывать свою клеточную стенку.
  Интересно, что протопласты бактерий нечувствительны к действию бактериофагов- вирусов, паразитирующих на бактериях. Следовательно, компоненты бактериальной стенки обладают антигенной специфичностью по отношению к этим вирусам.
 
  Глава 14. Вакуолярная система внутриклеточного транспорта
  Вакуолярная система, состоящая из одномембранных разнообразных по строению и функциям органелл (эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы, эндосомы, секреторные вакуоли) выполняют общую функцию синтеза, перестройки (модификации), сортировки и выведения (экспорта) из клетки биополимеров, главным образом белков-гликопротеидов, а также функцию синтеза мембран этой системы и плазматической мембраны.
  Необходимо отметить, что синтез основной массы клеточных белков протекает на полисомах в цитозоле. Особенностью белкового синтеза в цитозоле является то, что в зависимости от типа иРНК синтезируются различные белки, направляющиеся строго к своим внутриклеточным компонентам. Это связано с тем, что разные по назначению белки имеют определенные "сигнальные" последовательности аминокислот, как бы адреса, по которым разные белки распределяются в клетке. Так ядерные белки имеют NLS-сигнальную последовательность, белки митохондрий имеют свою, так же как белки цитозоля, цитоскелета, пластид и пероксисом - свои сигнальные последовательности. Характерным является то, что все типы перечисленных белков начинают и заканчивают синтез в цитозоле, и затем посттрансляционно с помощью внутриклеточных белковых комплексов переносятся "по адресам".
  В отличие от этих типов белков, белки экспортного назначения и белки мембран синтезируются на рибосомах, расположенных на мембранах эндоплазматического ретикулума и попадают внутрь вакуолей, по мере синтеза полипептидной цепи, котрансляционно. Затем эти белки уже внутри вакуолей, или в составе мембран вакуолей транспортируются внутри клетки.
  Общая схема функционирования вакуолярной системы
  На рис. 163 представлены мембранные везикулярные компоненты, объединенные в единую функциональную систему. Все они имеют ряд общих свойств: это - одномембранные компартменты, имеющие один общий источник образования (гранулярный эндоплазматический ретикулум). Для всей вакуолярной системы характерна кооперативность ее функционирования, взаимосвязь и последовательность этапов образования, перестройки, транспорта и экспорта синтезированных белков. Вкратце функции отдельных компонентов заключаются в следующем:
  1. Гранулярный эндоплазматический ретикулум: котрансляционный синтез растворимых внутривакуолярных белков (секреторные белки, гидролазы лизосом и др.); котрансляционный синтез нерастворимых белков, входящих в состав всех мембран вакуолярной системы; первичная модификация растворимых и нерастворимых (мембранных) белков, их соединение с олигосахаридами - гликозилирование синтезированных белков, образование гликопротеидов; синтез мембранных липидов и их встраивание в мембрану - "сборка мембран".
  2. Отделение вакуолей, содержащих новообразованные продукты и их переход в цис-зону аппарата Гольджи (ЭР-АГ комплекс).
  3. Цис-зона аппарата Гольджи: вторичная модификация гликопротеидов; синтез полисахаридов (гемицеллюлоза растений) и гексозаминогликанов.
  4. Промежуточная зона аппарата Гольджи: дополнительные модификации гликопротеидов, трансгликозилирование.
  5. Транс-Гольджи сеть: сортировка секреторных и лизосомных белков; отделение вакуолей.
  6. Экзоцитоз (секреция).
  7. Экзоцитоз постоянный.
  8. Отделение первичных лизосом с гидролазами.
  9. Эндоцитоз.
  10. Вторичная лизосома.
  11. Рециклизация рецепторов гидролаз.
  12. Рециклизация рецепторов плазматической мембраны.
  13. Гладкий эндоплазматический ретикулум: синтез и конденсация липидов, депонирование ионов Ca2+, синтез и ресорбция гликогена и др.
  14. Транспорт в зону аппарата Гольджи.
  15. Транспорт от аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум.
  Гранулярный эндоплазматический ретиклум
  Отличительной чертой вакуолярной системы является то, что синтезированные полимеры и продукты их превращений отделены от собственно цитоплазмы, от цитозоля, и становятся изолированными от цитозольных ферментов. Такое разобщение очень важно для одновременного протекания в клетке многих синтетических процессов.
  Открытие этой внутриклеточной мембранной структуры произошло на заре электронной микроскопии. В 1945 г. К Портер с сотрудниками изучал фибробласты цыплят в электронном микроскопе. В это время еще не была разработана техника ультратонких срезов, поэтому авторы просматривали клетки на просвет, целиком. В световом микроскопе в фибрибластах после фиксации и окраски видно, что периферия клеток (эктоплазма) окрашивается слабо, в то время как центральная часть клеток (эндоплазма) хорошо воспринимает красители. Портер увидел в электронном микроскопе, что зона эндоплазмы заполнена большим числом мелких вакуолей и каналов, соединяющихся друг с другом и образующих что-то наподобие рыхлой сети (ретикулум). Было видно, что стопки этих вакуолей и канальцев ограничены тонкими мембранами. Так был обнаружен эндоплазматический ретикулум, или эндоплазматическая сеть. Позднее, в 50-х гг., при использовании метода ультратонких срезов удалось выяснить структуру этого образования и обнаружить его неоднородность. Самым же главным оказалось, что эндоплазматический ретикулум (ЭР) встречается практически у всех эукариот.
  Подобный электронно-микроскопический анализ позволил выделить два типа ЭР: гранулярный (шероховатый) и гладкий.
  На ультратонких срезах гранулярный ЭР представлен замкнутыми мембранами, которые образуют на сечениях вытянутые мешки, цистерны или же имеют вид узких каналов (рис. 164, 165). Ширина полостей цистерн может очень варьировать в зависимости от функциональной активности клетки. Наименьшая ширина их может составлять около 20 нм, в расширенном виде они достигают диаметра в несколько мкм. Отличительной чертой этих мембран является то, что они со стороны гиалоплазмы покрыты мелкими (около 20 нм) темными, почти округлыми частицами, гранулами.
  Впервые эти гранулы были описаны Дж. Паладе (гранулы Паладе), который доказал, что они представляют собой рибонуклеопротеиды. Теперь хорошо известно, что эти гранулы являются ни чем иным, как рибосомами, связанными с мембранами ЭР. На мембранах рибосомы расположены в виде полисом (множество рибосом, объединенных одной информационной РНК), имеющих вид плоских спиралей, розеток или гроздей. Это работающие, синтезирующие белок рибосомы, которые прикрепляются к мембранам своей большой субъединицей.
  Гранулярный (или шероховатый, в отличие от гладкого) ЭР может в клетках быть представлен или в виде редких разрозненных мембран или же в виде локальных скоплений таких мембран (эргастоплазма) (рис. 166). Первый тип гранулярного ЭР характерен для недифференцированных клеток или клеток с низкой метаболической активностью. Эргастоплазма характерна для клеток, активно синтезирующих секреторные белки. Так, в клетках печени гранулярный ЭР собран в отдельные зоны (тельца Берга), так же как в некоторых нервных клетках (тигроид). В клетках поджелудочной железы гранулярный ЭР (эргастоплазма) в виде плотно упакованных друг около друга мембранных цистерн занимает базальную и околоядерную зоны клетки.
  Наличие полисом на мембранах однозначно показывает на то, что гранулярный ЭР является важным местом синтеза белков.
  Количество рибосом на ЭР четко связано с его синтетической активностью. Так, на мембранах ЭР в клетке несекретирующей молочной железы связывается до 25% клеточных рибосом, после стимуляции лактации их количество там возрастает до 70%. Падение числа рибосом на мембранах ЭР может происходить при дифференцировке клеток. Например, при частичном удалении печени у грызунов резко стимулируется деление клеток в оставшейся части. Это сопровождается редукцией гранулярного ЭР и обеднение его рибосомами: число свободных рибосом, не связанных с мембранами, достигает 40%. Такое же уменьшение числа рибосом, связанных с ЭР, наблюдается при различных патологических состояниях клеток ( при алкагольном хроническом отравлении происходит уменьшение числа связанных рибосом на 25%).
  Рибосомы, связанные с мембранами ЭР, участвуют в синтезе белков, выводимых из данной клетки, "экспортируемых" белков.
  Действительно, большое число клеток многоклеточных организмов, богатых гранулярным ЭР, синтезирует и выводит огромное количество белков. Так, например, клетки ацинусов поджелудочной железы синтезируют и выделяют массу белков - ферментов, участвующих в расщеплении пищи в кишечном тракте (протеиназы, липазы, нуклеазы и др.); клетки печени - альбумины крови; плазмоциты - ?-глобулины; молочной железы - казеин; слюнной железы - пищеварительные ферменты, амилазу и РНКазу и т.д. Такая же картина наблюдается у растений: железистые клетки, выделяющие белковые вещества, богаты гранулярным ЭР. Другими словами, у многоклеточных организмов клетки, богатые эргастоплазмой, синтезируют выводимые из этих клеток белки, необходимые или для работы других клеток, или для выполнения общеорганизменных функций (пищеварительные ферменты, белки плазмы крови, гормоны и др.).
  У одноклеточных также можно наблюдать гранулярный ЭР, который, по-видимому, участвует в синтезе выводимых экспортируемых белков. Среди таких белков могут быть не только ферменты внеклеточного пищеварения.
  Следовательно, роль гранулярного ЭР заключается не просто в участии в синтезе белков на рибосомах его мембран, но и в процессе сегрегации, обособления этих синтезированных белков, в их изоляции от основных функционирующих белков клетки. Эта функциональная особенность гранулярного ЭР очень важна, так как она связана с целым рядом процессов, приводящих к выделению таких белков с помощью вакуолей аппарата Гольджи.
  Котрансляционный синтез растворимых белков
  Пути синтеза белков на рибосомах ЭР можно представить в следующем виде (рис. 167). Еще в гиалоплазме происходит связывание иРНК, кодирующей секреторный белок, с рибосомой и начинается синтез белковой цепи. Важным является то, что сначала синтезируется "сигнальная последовательность" , богатая гидрофобными аминокислотами. В нее входит 16-30 аминокислот. Эта "сигнальная последовательность" в цитозоле узнается и связывается с "узнающей сигнал частицей" (SRP-частица), состоящей из одной молекулы 7S РНК и 6 различных полипептидных цепей. SRP-частица связывается после узнавания сигнального конца синтезирующейся молекулы белка с рибосомой, что приводит к полной остановке синтеза белка. На поверхности же мембраны ЭР, обращенной к гиалоплазме расположены интегральные рецепторные белки, связывающиеся с SRP-частицами. В результате SRP-частица связывается со своим рецептором и одновременно связывает данную рибосому с мембраной ЭР.
  Такая "заякоренная" рибосома с SRP-частицей, блокирующей дальнейший рост полипептидной цепи, взаимодействует с большим белковым комплексом, транслаконом. После связывания рибосомы с транслаконом происходит отделение SRP-частицы и синтезированный первичный пептид входит в канал диметром около 2 нм, который образует транслакон. После этого возобновляется синтез полипептида, он удлиняется и его сигнальная последовательность, вместе с растущей цепочкой оказывается внутри полости цистерны ЭР. Таким образом синтезируемый белок проходит сквозь мембрану ЭР во время его синтеза, т.е. котрансляционно, одновременно с его трансляцией. Внутри полости ЭР с помощью фермента (сигнальная петидаза) сигнальная последовательность отщепляется. После окончания синтеза вся белковая молекула оказывается в полости ЭР и в это время рибосома отделяется от транслакона и диссоциирует. После этого в транслаконе канал закрывается. Во время трансмембранного переноса растущей белковой цепи происходит ее связь с олигосахаридами (гликозилирование - см. ниже). В полости цистерн ЭР белки претерпевают ряд дополнительных изменений: образуются дисульфидные связи, происходит их правильное сворачивание, происходит сборка четвертичной структуры белков. Только белки с правильной конформацией в дальнейшем будут переноситься в зону аппарата Гольджи.
  Синтез нерастворимых (мембранных) белков
  В гранулярном ЭР происходит синтез белков, которые, встраиваясь в мембрану ЭР, становятся интегральными мембранными белками (рис. 168).
  Начальные стадии синтеза мембранных белков похожи на таковые при синтезе растворимых белков. Здесь также участвуют SRP-частицы, узнающие сигнальную последовательность, также происходит прохождение начального участка белковой цепи через транслакон. Однако в цепи синтезирующегося мембранного белка существует одна или несколько аминокислотных стоп-последовательностей, которые препятствуют белковой цепи пересекать мембрану и белок в области стоп-сигнала остается связанным с мембраной, но при этом синтез белка на рибосоме не останавливается. Это приводит к тому, что в области стоп-сигнала локализуется гидрофобный ?-спиральный участок, а весь белок остается встроенным в мембрану. В некоторых белках число ?-спиральных "заякоревающих" участков может быть от одного до нескольких. Так, например, белок транспорта глюкозы (GLUT-1) имеет 12 таких участков. Мембранные белки, также как и растворимые могут подвергаться различным модификациям. Наиболее характерной из них для ЭР является первичное гликозилирование - ковалентное связывание белковой цепи со сложным олигосахаридом. В результате этого синтезирующийся белок становится гликопротеидом.
  Большинство белков, синтезированных в гранулярном ЭР, относится к гликопротеидам. Связывание синтезирующейся белковой цепи с олигосахаридами происходит также котрансляционно. При этом на белковую молекулу переносится готовый блок олигосахаридов, который связывается с аспарагиновыми остатками белковой молекулы (рис. 169). Этот олигосахаридный комплекс содержит 2 молекулы N-ацетилгликозамина, 9 молекул маннозы и 3 молекулы глюкозы и связан со специальным липидом долихолом на внутренней поверхности мембраны ЭР, смотрящей в просвет вакуоли ЭР. По мере транслокации белковой цепи во время ее синтеза, каждый аспарагиновый остаток связывается с олигосахаридным комплексом, с помощью фермента, являющегося интегральным белком мембран ЭР. Первичной модификации, гликозилированию, подвергаются как растворимые, так и мембранные белки, синтезирующиеся в ЭР.
  Синтез клеточных мембран
  Итак, на рибосомах ЭР происходит синтез основной части мембранных белков клетки. Синтез этих белков отличается от синтеза секреторных тем, что по мере синтеза мембранные белки не освобождаются от мембран, а остаются в их составе, становясь таким образом или трансмембранными интегральными белками, или полуинтегральными.
  В ЭР происходит синтез и сборка липидов самих мембран, включая фосфолипиды и холестерол. Ферменты, участвующие в синтезе липидов, встроены в мембрану ЭР со стороны цитозоля, и синтез липидов происходит на мембране там же. Таким образом синтезированные липиды встраиваются в мембрану ЭР в липидный слой со стороны цитоплазмы, но переносятся на внутреннюю сторону с помощью переносчиков фосфолипидов. Таким образом билипидный слой мембраны растет, увеличивая поверхность вакуоли или цистерны ЭР. Этот процесс идет одновременно с синтезом интегральных мембранных белков, так что липопротеидная мембрана, как таковая, строится и растет за счет двух процессов: синтеза и встраивания липидов, и синтеза и интеграции мембранных белков. Необходимо подчеркнуть, что такое "зарождение" мембран вакуолярной системы происходит только в гранулярном ЭР.
  Сегодня можно сказать, что важнейшей функцией гранулярного ЭР, вне зависимости от специализации или тканевой принадлежности клеток, является функция образования, построения клеточных мембран, которая заключается в том, что элементы гранулярного ЭР синтезируют все мембранные белки, синтезируют липидный компонент мембран, но, кроме того, именно в гранулярном ЭР происходит сборка липопротеидных мембран.
  Этот процесс хорошо прослежен и проанализирован на примере образования вируса везикулярного стоматита (VSV) (рис. 170). Это РНК-содержащий вирус, построенный из небольшого числа белков и покрытый снаружи липопротеидной мембраной. В зрелой частице VSV кроме одной молекулы РНК есть белок, входящий в рибонуклеопротеидный комплекс (N-белок), белок, крепящий этот комплекс с окружающей мембраной (М-белок), и специфический белок мембранной оболочки (G-белок). Мембранная оболочка VSV произошла от клетки хозяина, в которой этот вирус развивается: по мере выхода РНП вируса происходит образование выроста плазматической мембраны, напоминающего короткую микроворсинку, куда включается нуклеоид (РНП) вируса, затем такой вырост отделяется от поверхности клетки, и получается готовая зрелая частица VSV. Благодаря G-белку такая частица может специфически контактировать с незараженной клеткой; мембрана VSV и плазматические мембраны клеток сливаются, а вирусный рибонуклеопротеид оказывается в цитоплазме клетки, где развивается инфекционный процесс. При этом останавливаются синтезы нормальных белков клетки-хозяина, и начинается синтез только вирусных белков на рибосомах инфицированной клетки. Вирусная РНК кодирует только пять белковых молекул. Две из них являются ферментами, необходимыми для репликации и транскрипции вирусного генома, третья - N-белок, четвертая кодирует M-белок, пятая - специфический гликопротеин, G-белок. Это интегральный белок мембраны, окружающий зрелую вирусную частицу. G-белок состоит из 550 аминокислот и имеет две боковые полисахаридные цепи. Он асимметрично расположен в мембране, большая его часть вместе с углеводными цепочками торчит наружу, а 30 аминокислот локализованы с цитоплазматической стороны мембраны.
  При заражении клеток VSV с молекулы его РНК считывается пять разных иРНК, с помощью которых на рибосомах клетки происходит синтез вирусных белков. N-белок и M-белок синтезируются на свободных полисомах и связываются с размножившимися молекулами вирусной РНК и с мембраной клетки. Синтез G-белка происходит на полисомах гранулярного эндоплазматического ретикулума. В этом случае синтез G-белка также начинается с синтеза "сигнальной" аминокислотной последовательности, которая проходит сквозь мембрану и как бы тянет за собой остальную растущую цепь аминокислот. Однако, в отличие от секреторных белков G-белок остается связанным с мембраной ЭР. Большая его часть находится в просвете цистерн ЭР, где она принимает специфическую конформацию и присоединяет два первичных участка углеводных цепей. Часть молекулы G-белка погружена и проходит через билипидный слой мембраны, а небольшой участок С-конца торчит на цитоплазматической части мембраны. Дальнейшая судьба G-белка хорошо прослежена: через 20-30 мин после синтеза он обнаруживается в составе интегральных белков аппарата Гольджи. Здесь происходит дополнительный рост его углеводных цепей. Позже его обнаруживают в составе интегральных белков плазматической мембраны.
  Из этих экспериментов следует, что интегральные белки мембран эндоплазматического ретикулума, мембран аппарата Гольджи, секреторных вакуолей и плазматической мембраны имеют одно происхождение: они синтезируются и встраиваются в мембрану в гранулярном ЭР.
  Следовательно, гранулярный эндоплазматический ретикулум представляет собой настоящую "фабрику" клеточных мембран. От того, какие интегральные и периферические белки будут синтезироваться на рибосомах ЭР, и от того, какие фосфолипиды будут здесь синтезироваться и включаться в мембрану, будет зависеть тип образующегося нового участка мембраны; будет ли он компонентом гладкого ЭР, мембран аппарата Гольджи, лизосомы, или плазматической мембраны.
  Транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи
  Дистальные участки гранулярного ЭР, которые расположены в зоне, приближенной к аппарату Гольджи (АГ), теряют рибосомы и образуют мембранные выступы, от которых отпочковываются мелкие вакуоли, содержащие синтезированные в ЭР белки. Эта зона называется ЭР-АГ-промежуточный компартмент (ERGIC) или везикулярно-тубулярная группа (VTC) (рис. 171). Вакуоли, отщепившиеся в этой зоне от ЭР, транзитные элементы, покрыты окаймляющим белковым слоем, аналогичным клатриновому слою эндоцитозных вакуолей. Белки этого слоя также относятся к COP-белкам, в данном случае отщепляющиеся вакуоли покрыты комплексом COP II, состоящим из нескольких гетеродимеров, связанных с мембраной посредством белка Sar 1p, малой ГТФазой (рис. 172). Отделившиеся от ЭР вакуоли становятся окаймленными пузырьками, затем они теряют белковую оболочку и сливаются друг с другом и транспортируются с помощью микротрубочек к цис-зоне аппарата Гольджи, где и сливаются с его мембранами. Адресность и точность слияния любых вакуолей с другими мембранами определяется специальными белками SNARE (рецептор белков, участвующих в прикреплении и слиянии мембран).
  После деполимеризации окаймляющего слоя COP II на поверхности вакуоли открываются интегральные мембранные белки - V-SNARE. Эти белки специфичны для каждого типа вакуолей, направляя их к тому участку, где они должны слиться с другими мембранами. Там они связываются с мембранными белками T-SNARE и SNAP25 (рис. 173). В местах взаимодействия этих двух групп белков и происходит слияние мембран.
  Таким образом происходит транспорт синтезированных белков в зону аппарата Гольджи.
  Глава 15. Аппарат (комплекс) Гольджи
  В 1898 г. итальянский ученый К. Гольджи, используя свойства связывания тяжелых металлов (осмия и серебра) с клеточными структурами, выявил в нервных клетках сетчатые образования, которые он назвал "внутренним сетчатым аппаратом" (рис. 174). Дальнейшее усовершенствование метода окраски металлами (импрегнации) дало возможность убедиться, что сетчатые структуры (аппарат Гольджи) встречаются во всех клетках любых эукариотных организмов. Обычно элементы аппарата Гольджи расположены около ядра, вблизи клеточного центра (центриоли). Участки аппарата Гольджи, четко выявляемые методом импрегнации, имели в некоторых клетках вид сложных сетей, где ячейки были связаны друг с другом или представлялись в виде отдельных темных участков, лежащих независимо друг от друга (диктиосомы), имеющих вид палочек, зерен, вогнутых дисков и т.д. (рис. 175). Между сетчатой и диффузной формой аппарата Гольджи нет принципиального различия, так как часто в одних и тех же клетках наблюдается смена форм этого органоида. Элементы аппарата Гольджи часто связаны с вакуолями, что особенно характерно для секретирующих клеток.
  Было обнаружено, что морфология АГ меняется в зависимости от стадий клеточной секреции, что послужило основанием Д.Н. Насонову (1924) выдвинуть гипотезу о том, что АГ является органоидом, обеспечивающим сепарацию и накопление веществ в самых различных клетках.
  Долгое время в растительных клетках не удавалось обнаружить элементов аппарата Гольджи обычными методами микротехники. Однако с появлением метода электронной микроскопии элементы АГ были обнаружены во всех растительных клетках, где они расположены по периферии клетки.
  Тонкое строение аппарата Гольджи
  В электронном микроскопе видно, что аппарат Гольджи представлен мембранными структурами, собранными вместе в небольшой зоне (рис. 176, 177). Отдельная зона скопления этих мембран является диктиосомой (рис. 178). В диктиосоме плотно друг к другу (на расстоянии 20-25 нм) расположены в виде стопки плоские мембранные мешки, или цистерны, между которыми располагаются тонкие прослойки гиалоплазмы. Каждая отдельная цистерна имеет диаметр около 1 мкм и переменную толщину; в центре ее мембраны могут быть сближены (25 нм), а на периферии иметь расширения, ампулы, ширина которых непостоянна. Количество таких мешков в стопке обычно не превышает 5-10. У некоторых одноклеточных их число может достигать 20 штук. Кроме плотно расположенных плоских цистерн в зоне АГ наблюдается множество вакуолей. Мелкие вакуоли встречаются главным образом в периферических участках зоны АГ; иногда видно, как они отшнуровываются от ампулярных расширений на краях плоских цистерн. Принято различать в зоне диктиосомы проксимальный или формирующийся, цис-участок, и дистальный или зрелый, транс-участок (рис. 178). Между ними располагается средний или промежуточный участок АГ.
  Во время деления клеток сетчатые формы АГ распадаются до диктиосом, которые пассивно и случайно распределяются по дочерним клеткам. При росте клеток общее количество диктиосом увеличивается.
  В секретирующих клетках обычно АГ поляризован: его проксимальная часть обращена к цитоплазме и ядру, а дистальная - к поверхности клетки. В проксимальном участке к стопкам сближенных цистерн примыкает зона мелких гладких пузырьков и коротких мембранных цистерн. В образцах препаративно выделенных зон АГ при негативном контрастировании видно, что к проксимальной части диктиосомы примыкает сетевидная или губкообразная система мембранных полостей. Считается, что эта система может представлять собой зону перехода элементов ЭР в зону аппарата Гольджи (рис. 179).
  В средней части диктиосомы периферия каждой цистерны также сопровождается массой мелких вакуолей около 50 нм в диаметре.
  В дистальном или транс-участке диктиосом к последней мембранной плоской цистерне примыкает участок, состоящий из трубчатых элементов и массой мелких вакуолей, часто имеющих фибриллярную опушенность по поверхности со стороны цитоплазмы - это опушенные или окаймленные пузырьки такого же типа, как и окаймленные пузырьки при пиноцитозе. Это - так называемая транс-сеть аппарата Гольджи (TGN), где происходит разделение и сортировка секретируемых продуктов. Еще дистальнее располагается группа более крупных вакуолей - это уже продукт слияния мелких вакуолей и образования секреторных вакуолей.
  При изучении толстых срезов клеток в мегавольтный электронный микроскоп было найдено, что в клетках отдельные диктосомы могут быть связаны друг с другом системой вакуолей и цистерн. Так что образуется рыхлая трехмерная сеть, выявляемая в световом микроскопе. В случае диффузной формы АГ каждый отдельный его участок представлен диктиосомой. У клеток растений преобладает диффузный тип организации АГ, обычно в среднем на клетку приходится около 20 диктиосом. В клетках животных часто с зоной мембран аппарата Гольджи ассоциированы центриоли; между радиально отходящих от них пучков микротрубочек лежат группы стопок мембран и вакуолей, которые концентрически окружают клеточный центр. Эта связь, вероятно, отражает участие микротрубочек в движении вакуолей.
  Секреторная функция аппарата Гольджи
  Мембранные элементы АГ участвуют в сегрегации и накоплении продуктов, синтезированных в ЭР, участвуют в их химических перестройках, созревании: это, главным образом перестройка олигосахаридных компонентов гликопротеинов в составе водорастворимых секретов или в составе мембран (рис. 180).
  В цистернах АГ происходит синтез полисахаридов, их взаимосвязь с белками, приводящая к образованию мукопротеидов. Но главное, с помощью элементов аппарата Гольджи происходит процесс выведения готовых секретов за пределы клетки. Кроме того, АГ является источником клеточных лизосом.
  Участие АГ в процессах выведения секреторных продуктов было очень хорошо изучено на примере экзокринных клеток поджелудочной железы. Для этих клеток характерно наличие большого числа секреторных гранул (зимогеновых гранул), которые представляют собой мембранные пузырьки, заполненные белковым содержимым. В составе белков зимогеновых гранул входят разнообразные ферменты: протеазы, липазы, карбогидразы, нуклеазы. При секреции содержимое этих зимогеновых гранул выбрасывается из клеток в просвет железы, а затем перетекает в полость кишечника. Так как основным продуктом, выводимым клетками поджелудочной железы, является белок, то исследовали последовательность включения радиоактивных аминокислот в различные участки клетки (рис. 181). Для этого животным вводили меченную тритием аминокислоту (3Н-лейцин) и с помощью электронно-микроскопической радиоавтографии следили во времени за локализацией метки. Оказалось, что через короткий промежуток времени (3-5 мин) метка локализовалась только в базальных участках клеток, в участка, богатых гранулярным ЭР. Так как метка включалась в белковую цепь во время синтеза белка, то было ясно, что ни в зоне АГ, ни в самих зимогеновых гранулах синтез белка не происходит, а он синтезируется исключительно в эргастоплазме на рибосомах. Несколько позднее (через 20-40 мин) метка кроме эргастоплазмы была обнаружена в зоне вакуолей АГ. Следовательно, после синтеза в эргастоплазме белок был транспортирован в зону АГ. Еще позднее (через 60 мин) метка обнаруживалась уже и в зоне зимогеновых гранул. В дальнейшем метку можно было видеть в просвете ацинусов этой железы. Таким образом, стало ясно, что АГ является промежуточным звеном между собственно синтезом секретируемого белка и выведением его из клетки. Также подробно процессы синтеза и выведения белков были изучены на других клетках (молочная железа, бокаловидные клетки кишечника, щитовидная железа и др.), и были исследованы морфологические особенности этого процесса. Синтезированный на рибосомах экспортируемый белок отделяется и накапливается внутри цистерн ЭР, по которым он транспортируется к зоне мембран АГ. Здесь от гладких участков ЭР отщепляются мелкие вакуоли, содержащие синтезированный белок, которые поступают в зону вакуолей в проксимальной части диктиосомы. В этом месте вакуоли могут сливаться друг с другом и с плоскими цис-цистернами диктиосомы. Таким образом происходит перенесение белкового продукта уже внутри полостей цистерн АГ.
  По мере модификации белков в цистернах аппарата Гольджи, они с помощью мелких вакуолей переносятся от цистерн к цистерне в дистальную часть диктиосомы, пока не достигают трубчатой мембранной сети в транс-участке диктиосомы. В этом участке происходит отщепление мелких пузырьков, содержащих уже зрелый продукт. Цитоплазматическая поверхность таких пузырьков бывает сходна с поверхностью окаймленных пузырьков, которые наблюдаются при рецепторном пиноцитозе. Отделившиеся мелкие пузырьки сливаются друг с другом, образуя секреторные вакуоли. После этого секреторные вакуоли начинают двигаться к поверхности клетки, соприкасаются с плазматической мембраной, с которой сливаются их мембраны, и, таким образом, содержимое этих вакуолей оказывается за пределами клетки. Морфологически этот процесс экструзии (выбрасывания) напоминает пиноцитоз, только с обратной последовательностью стадий. Он носит название экзоцитоз.
  Такое описание событий является только общей схемой участия аппарата Гольджи в секреторных процессах. дело усложняется тем, что одна и та же клетка может участвовать в синтезе многих выделяемых белков, может их друг от друга изолировать и направлять к клеточной поверхности или же в состав лизосом. В аппарате Гольджи происходит не просто "перекачка" продуктов из одной полости в другую, но и постепенно идет их "созревание", модификация белков, которая заканчивается "сортировкой" продуктов, направляющихся или к лизосомам, или к плазматической мембране, или к секреторным вакуолям.
 
  Модификация белков в аппарате Гольджи
  В цис-зону аппарата Гольджи синтезированные в ЭР белки попадают после первичного гликозилирования и редукции там же нескольких сахаридных остатков. В конечном итоге все белки там имеют одинаковые олигосахаридные цепи, состоящие из двух молекул N-ацетилглюкозамина, шести молекул маннозы (рис. 182). В цис-цистернах начинается вторичная модификация олигосахаридных цепей и их сортировка на два класса. В результате олигосахариды на гидролитических ферментах, предназначенных для лизосом (богатые маннозой олгосахариды), фосфорилируются, а олигосахариды других белков, направляемых в секреторные гранулы, или к плазматической мембране, подвергаются сложным превращениям, теряя ряд сахаров и присоединяя галактозу, N-ацетилглюкозамин и сиаловые кислоты.
  При этом возникает специальный комплекс олигосахаридов. Такие превращения олигосахаридов осуществляются с помощью ферментов - гликозилтрансфераз, входящих в состав мембран цистерн аппарата Гольджи. Так как каждая зона в диктиосомах имеет свой набор ферментов гликозилирования, то гликопротеиды как бы по эстафете переносятся из одного мембранного отсека ("этажа" в стопке цистерн диктиосомы) в другой и в каждом подвергаются специфическому воздействию ферментов. Так в цис-участке происходит фосфорилирование манноз в лизосомных ферментах и образуется особая маннозо-6-группировка, характерная для всех гидролитических ферментов, которые потом попадут в лизосомы.
  В средней части диктиосом протекает вторичное гликозилирование секреторных белков: дополнительное удаление маннозы и присоединение N-ацетилглюкозамина. В транс-участке к олигосахаридной цепи присоединяются галактоза и сиаловые кислоты (рис. 183).
  Эти данные были получены совершенно разными методами. С помощью дифференциального центрифугирования удалось получить раздельные более тяжелые (цис-) компоненты аппарата Гольджи и более легкие (транс-) и определить в них наличие гликозидаз и их продуктов. С другой стороны, используя моноклональные антитела к различным ферментам с помощью электронной микроскопии удалось их локализовать прямо на срезах клеток.
  В ряде специализированных клеток в аппарате Гольджи происходит синтез собственно полисахаридов.
  В аппарате Гольджи растительных клеток происходит синтез полисахаридов матрикса клеточной стенки (гемицеллюлозы, пектины). Кроме того, диктиосомы растительных клеток участвуют в синтезе и выделении слизей и муцинов, в состав которых входят также полисахариды. Синтез же основного каркасного полисахарида растительных клеточных стенок, целлюлозы, происходит как уже говорилось, на поверхности плазматической мембраны.
  В аппарате Гольджи клеток животных происходит синтез длинных неразветвленных полисахаридных цепей глюкозаиногликанов. Один из них, гиалуроновая кислота, входящая в состав внеклеточного матрикса соединительной ткани, содержит несколько тысяч повторяющихся дисахаридных блоков. Многие глюкозаиногликаны ковалентно связаны с белками и образуют протеогликаны (мукопротеины). Такие полисахаридные цепи модифицируются в аппарате Гольджи и связываются с белками, которые в виде протеогликанов секретируются клетками. В аппарате Гольджи происходит также сульфатирование глюкозаиногликанов и некоторых белков.
  Сортировка белков в аппарате Гольджи
  Итак, через аппарат Гольджи проходит по крайней мере, три потока синтезированных клеткой нецитозольных белков: поток гидролитических ферментов в компартмент лизосом, поток выделяемых белков, которые накапливаются в секреторных вакуолях, и выделяются из клетки только по получении специальных сигналов, поток постоянно выделяемых секреторных белков. Следовательно, должен быть какой-то специальный механизм пространственного разделения этих разных белков и их путей следования.
  В цис- и средних зонах диктиосом все эти белки идут вместе без разделения, они только раздельно модифицируются в зависимости от их олигосахаридных маркеров.
  Собственно разделение белков, их сортировка, происходит в транс-участке аппарата Гольджи. Этот процесс не до конца расшифрован, но на примере сортировки лизосомных ферментов можно понять принцип отбора определенных белковых молекул (рис. 184).
  Известно, что только белки-предшественники лизосомных гидролаз имеют специфическую олигосахаридную, а именно маннозную группу. В цис-цистернах эти группировки фосфорилируются и дальше вместе с другими белками переносятся от цистерны к цистерне, через среднюю зону в транс-участок. Мембраны транс-сети аппарата Гольджи содержат трансмембранный белок - рецептор (манноза-6-фосфатный рецептор или М-6-Ф-рецептор), который узнает фосфорилированные маннозные группировки олигосахаридной цепи лизосомных ферментов и связывается с ними. Это связывание происходит при нейтральных значениях рН внутри цистерн транс-сети. На мембранах эти М-6-Ф-рецепторные белки образуют кластеры, группы, которые концентрируются в зонах образования мелких пузырьков, покрытых клатрином. В транс-сети аппарата Гольджи происходит их отделение, отпочковывание и дальнейший перенос к эндосомам. Следовательно М-6-Ф-рецепторы, являясь трансмембранными белками, связываясь с лизосомными гидролазами, отделяют их, отсортировывают, от других белков (например, секреторных, нелизосомных) и концентрируют их в окаймленных пузырьках. Оторвавшись от транс-сети эти пузырьки быстро теряют шубу, сливаются с эндосомами, перенося свои лизосомные ферменты, связанные с мембранными рецепторами, в эту вакуоль. Как уже говорилось, внутри эндосом из-за активности протонного переносчика происходит закисление среды. Начиная с рН 6 лизосомные ферменты диссоциируют от М-6-Ф-рецепторов, активируются и начинают работать в полости эндолизосомы. Участки же мембран вместе с М-6-Ф-рецепторами возвращаются путем рециклизации мембранных пузырьков обратно в транс-сеть аппарата Гольджи.
  Вероятнее всего, что та часть белков, которая накапливается в секреторных вакуолях и выводится из клетки после поступления сигнала (например нервного или гормонального) проходит такую же процедуру отбора, сортировки на рецепторах транс-цистерн аппарата Гольджи. Эти секреторные белки попадают сначала в мелкие вакуоли тоже одетые клатрином, которые затем сливаются друг с другом. В секреторных вакуолях часто происходит агрегация накопленных белков в виде плотных секреторных гранул. Это приводит к повышению концентрации белка в этих вакуолях примерно в 200 раз, по сравнению с его концентрацией в аппарате Гольджи. Затем эти белки по мере накопления в секреторных вакуолях выбрасываются из клетки путем экзоцитоза, поле получения клеткой соответствующего сигнала.
  От аппарата Гольджи исходит и третий поток вакуолей, связанный с постоянной, конститутивной секрецией. Так фибробласты выделяют большое количество гликопротеидов и муцинов, входящих в основное вещество соединительной ткани. Многие клетки постоянно выделяют белки, способствующие связыванию их с субстратами, постоянно идет поток мембранных пузырьков к поверхности клетки, несущие элементы гликокаликса и мембранных гликопротеидов. Этот поток выделяемых клеткой компонентов не подлежит сортировке в рецепторной транс-системе аппарата Гольджи. Первичные вакуоли этого потока также отщепляются от мембран и относятся по своей структуре к окаймленным вакуолям, содержащим клатрин (рис. 185).
  Заканчивая рассмотрение строения и работы такой сложной мембранной органеллы, как аппарат Гольджи, необходимо подчеркнуть, что несмотря на кажущуюся морфологическую однородность его компонентов, вакуоли и цистерны, на самом деле, это не просто скопище пузырьков, а стройная, динамичная сложно организованная, поляризованная система.
  В АГ происходит не только транспорт везикул от ЕР к плазматической мембране. Существует ретроградный перенос везикул. Так от вторичных лизосом отщепляются вакуоли и возвращаются вместе с рецепторными белками в транс-АГ зону. Кроме того существует поток вакуолей от транс-зоны к цис-зоне АГ, а так же от цис-зоны к эндоплазматическому ретикулуму. В этих случаях вакуоли одеты белками COP I-комплекса. Считается, что таким путем возвращаются различные ферменты вторичного гликозилирования и рецепторные белки в составе мембран.
  Эти особенности поведения транспортных везикул дали основу гипотезе о существовании двух типов транспорта компонентов АГ (рис. 186).
  По одному из них, наиболее старому, в АГ существуют стабильные мембранные компоненты, к которым от ЭР эстафетно переносятся вещества с помощью транспортных вакуолей. По альтернативной модели АГ является динамическим производным ЭР: отщепившиеся от ЭР мембранные вакуоли сливаются друг с другом в новую цис-цистерну, которая затем продвигается через всю зону АГ и в конце распадается на транспортные везикулы. По этой модели ретроградные COP I везикулы возвращают постоянные белки АГ в более молодые цистерны. Таким образом предполагается, что переходная зона ЭР представляет собой "родильный дом" для аппарата Гольджи.
  Глава 16. Лизосомы
  О лизосомах уже упоминалось в разделах, посвященных эндоцитозу и аппарату Гольджи.
  Наличие лизосом разного типа в клетках отражает процесс переноса гидролитических ферментов, необходимых для внутриклеточного расщепления экзогенных (энзоцитоз) или эндогенных (аутофагоцитоз) полимеров, процесс секреции, но как бы направленный "внутрь" клетки.
  Сходство лизосомных вакуолей с секреторными находит свое отражение не только в общности их происхождения, но иногда и в общности конечного этапа их активности. В некоторых случаях лизосомы могут подходить к плазматической мембране и выбрасывать свое содержимое в наружную среду. Так, у клеток гриба нейроспоры лизосомы, выбрасывая гидролазы из клетки, обеспечивают внеклеточный протеолиз. Возможно, что часть лизосом макрофагов таким же образом обеспечивает внеклеточный гидролиз при воспалительных и резорбционных процессах. При оплодотворении акросома спермия, вакуоль, аналогичная лизосоме и содержащая гидролитические ферменты гиалуронидазу и протеазы, сливается с плазматической мембраной спермия, изливается на поверхность яйцеклетки. Освободившиеся из вакуоли ферменты расщепляют полисахаридные и белковые оболочки ооцита, давая возможность слиться двум половым клеткам.
  Лизосомы не представляют собой в клетках самостоятельных структур, они образуются за счет активности эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи и в этом отношении напоминают секреторные вакуоли и что основная их роль заключается в участии в процессах внутриклеточного расщепления как экзогенных, так и эндогенных биологических макромолекул.
 
  Общая характеристика лизосом
  Лизосомы как мембранные внутриклеточные частицы были открыты биохимиками (Де Дюв, 1955). При изучении легкой подфракции макросом из гомогенатов печени крысы было найдено, что эта подфракция (в отличие от основной фракции макросом - митохондриальной фракции) обладает группой кислых гидролитических ферментов (гидролаз), расщепляющих белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Создалось впечатление, что эти ферменты содержатся в особого рода цитоплазматических частицах, лизосомах. Оказалось, что ферменты изолированных лизосом проявляют свою активность только в том случае, если предварительно вызывается повреждение самих лизосом, либо воздействием осмотического шока или детергентов, либо замораживанием и оттаиванием препаратов. На основании этого было сделано заключение, что лизосомы окружены липопротеидной мембраной, которая препятствует доступу находящихся снаружи субстратов к ферментам, находящимся внутри лизосом.
  Характерной чертой лизосом является то, что они содержат около 40 гидролитических ферментов: протеиназы, нуклеазы, гликозидазы, фосфорилазы, фосфатазы, сульфитазы, оптимум действия которых осуществляется при рН 5. В лизосомах кислое значение среды создается из-за наличия в их мембранах H+ помпы, зависимой от АТФ. Кроме того, в мембране лизосом встроены белки-переносчики для транспорта из лизосом в гиалоплазму продуктов гидролиза: мономеры расщепленных молекул - аминокислоты, сахара, нуклеотиды, липиды. При ознакомлении с работой лизосом, всегда возникает вопрос, почему же эти мембранные образования не переваривают сами себя? Вероятнее всего, что мембранные элементы лизосом защищены от действия кислых гидролаз олигосахаридными участками, которые или не узнаются лизосомными ферментами, либо просто мешают гидролазам взаимодействовать с ними. Так или иначе мембранные компоненты лизосом очень устойчивы к гидролазам, содержащимся внутри лизосомных пузырьков.
  Наличие некоторых гидролаз можно выявить гистохимическими методами. Так одной из характерных гидролаз, выявляемых как в световом так и в электронном микроскопе, является кислая фосфатаза, по наличию которой можно четко определить, является тот или иной мембранный пузырек лизосомой.
  Под электронным микроскопом видно, что фракция лизосом состоит из очень пестрого класса пузырьков размером 0,2-0,4 мкм (для клеток печени), ограниченных одиночной мембраной (толщина ее около 7 нм), с очень разнородным содержанием внутри (рис. 187, 188). Во фракции лизосом встречаются пузырьки с гомогенным, бесструктурным содержимым, встречаются пузырьки, заполненные плотным веществом, содержащим в свою очередь вакуоли, скопления мембран и плотных однородных частиц; часто можно видеть внутри лизосом не только участки мембран, но и фрагменты митохондрий и ЭР. Иными словами, эта фракция по морфологии оказалась крайне неоднородной, несмотря на постоянство присутствия гидролаз.
  Сходные по морфологии частицы были описаны еще ранее в разных тканях многих животных. Однако цитологи не могли выяснить функциональные значения этих полиморфных частиц. И только сочетание биохимических, цитохимических и электронно-микроскопических методов исследований позволило достаточно подробно разобраться в строении, происхождении и функционировании клеточных лизосом.
  Морфологическая гетерогенность лизосом
  Было обнаружено, что среди различных по морфологии лизосомных частиц можно выделить по крайней мере четыре типа: первичные лизосомы, вторичные лизосомы, аутофагосомы и остаточные тельца (рис. 189). Пестрота же морфологии лизосом вызвана тем, что эти частицы участвуют в процессах внутриклеточного переваривания, образуют сложные пищеварительные вакуоли как экзогенного (внеклеточного), так и эндогенного происхождения.
  Первичные лизосомы представляют собой мелкие мембранные пузырьки размером около 100 нм, заполненные бесструктурным веществом, содержащим набор гидролаз и в том числе кислую фосфатазу, - маркерный для лизосом фермент. Эти мелкие вакуоли, первичные лизосомы, практически очень трудно отличить от мелких вакуолей на периферии зоны аппарата Гольджи. Часть из них несет клатриновую оболочку. Более того, вакуоли этой периферической части АГ также содержат кислую фосфатазу. Прослеживая процесс синтеза и локализацию этого фермента в клетках, было найдено, что местом его синтеза, как и следовало ожидать, является гранулярный ретикулум, затем этот фермент появляется в проксимальных участках диктиосом, а потом - в мелких вакуолях по периферии диктиосомы и, наконец, выявляется в первичных лизосомах. Весь путь образования первичных лизосом очень сходен с образованием зимогеновых гранул в клетках поджелудочной железы, за исключением последнего этапа - выбрасывания из клетки.
  С помощью ряда точных экспериментов установили, что в дальнейшем первичные лизосомы сливаются с фагоцитарными или пиноцитозными вакуолями, эндосомами, образуя вторичную лизосому или внутриклеточную пищеварительную вакуоль. При этом содержимое первичной лизосомы сливается с полостью эндоцитозной вакуоли, и гидролазы первичной лизосомы получают доступ к субстратам, которые они и начинают расщеплять.
  При слиянии первичной лизосомы с эндоцитозной вакуолью происходит диссоциация комплексов М-6-Ф-рецептор-гидролаза, из-за кислой среды внутри вторичной лизосомы. Затем уже свободный фермент после потери фосфатной группы активируется и вступает в работу. Освободившиеся мембранные рецепторы переходят в мелкие пузырьки, отщепляющиеся от вторичной лизосомы, и уходят снова в транс-участок аппарата Гольджи, т.е. происходит их рециклизация (см. рис. 184).
  Процесс слияния первичных лизосом с эндоцитозными вакуолями прослежен очень подробно. Так, если ввести в организм мыши чужеродный белок пероксидазу, то она начинает накапливаться в эндоцитозных вакуолях. С помощью гистохимической реакции можно выявить пероксидазу в таких вакуолях в электронном микроскопе. Было замечено, что к этим вакуолям подходят первичные лизосомы, обладающие кислой фосфатазой, продукты активности которой также выявляются гистохимически. Затем происходит слияние мембран вакуолей, и в слившемся объеме новой вакуоли обнаруживается как пероксидазная, так и фосфатазная активность. По своей морфологии такая вакуоль представляет собой лизосому, содержащую компоненты, захваченные в процессе эндоцитоза. Это вторичная лизосома. Разнообразие по величине и по структуре клеточных лизосом связано в первую очередь с разнообразием вторичны лизосом - продуктов слияния эндоцитозных вакуолей с первичными лизосомами. Таким образом, вторичные лизосомы представляют собой не что иное, как внутриклеточные пищеварительные вакуоли, ферменты которых доставлены с помощью мелких первичных лизосом. Поэтому от типа поглощенных веществ или частичек зависит размер и внутренняя структура таких лизосом.
  Лизосомы могут сливаться друг с другом и таким путем увеличиваться в объеме, при этом усложняется их внутренняя структура. Так, давая клеткам культуры ткани в среду коллоидное железо, можно видеть, как частички его (хорошо выявляемые в электронном микроскопе) сначала появляются в фагоцитозных вакуолях, а затем обнаруживаются во вторичных лизосомах. Если через некоторое время снова клетке дать инородное вещество, например коллоидное золото (частички которого отличаются по морфологии от частиц коллоидного железа), то динамика его появления в лизосомах будет такая же. Но появятся лизосомы, одновременно содержащие гранулы как коллоидного железа, так и коллоидного золота.
  Судьба поглощенных биогенных веществ, попавших в состав лизосомы, заключается в их расщеплении гидролазами до мономеров и в транспорте этих мономеров через мембрану лизосомы в состав гиалоплазмы, где они реутилизируются, включаются в различные синтетические и обменные процессы.
  Кроме участия в переваривании поглощенных частиц и растворов лизосомы могут играть роль внутриклеточных структур, участвующих в изменении клеточных продуктов. Так, в клетках щитовидной железы в ЭР синтезируется тироглобулин, белок-предшественник тироидного гормона. Тироглобулин с помощью АГ выводится из клеток в полость фолликулов щитовидной железы. При гормональной стимуляции иодированный тироглобулин снова попадает в железистую клетку путем пиноцитоза. Пиноцитозные вакуоли, содержащие тироглобулин, сливаются с первичными лизосомами, ферменты которых вызывают частичный гидролиз тироглобулина, приводящий к образованию тироксина - тироидного гормона, который затем выводится из клетки, секретируется, и попадает в кровеносное русло.
  Однако расщепление, переваривание биогенных макромолекул внутри лизосом может идти в ряде клеток не до конца. В этом случае в полостях лизосом происходит накопление непереваренных продуктов, происходит переход вторичных лизосом в телолизосомы, или остаточные тельца. Остаточные тельца уже содержат меньше гидролитических ферментов, в них происходит уплотнение содержимого, его перестройка. Часто в остаточных тельцах наблюдается вторичная структуризация непереваренных липидов, которые образуют сложные слоистые структуры. Там же происходит отложение пигментных веществ. У человека при старении организма в клетках мозга, печени и в мышечных волокнах в телолизосомах происходит отложение "пигменте старения" - липофусцина.
  Аутолизосомы (аутофагосомы) постоянно встречаются в клетках простейших, растений и животных. По своей морфологии их относят к вторичным лизосомам, но с тем отличием, что в составе этих вакуолей встречаются фрагменты или даже целые цитоплазматические структуры, такие, как митохондрии, пластиды, элементы ЭР, рибосомы, гранулы гликогена и т.д. Процесс образования аутофагосом еще недостаточно ясен. По одним представлениям, первичные лизосомы могут выстраиваться вокруг клеточной органеллы, сливаться друг с другом и таким образом отделять ее от соседних участков цитоплазмы: участок оказывается отделенным мембраной и заключенным внутри такой сложной лизосомы (см. рис. 189).
  Есть предположение, что процесс аутофагоцитоза связан с отбором и уничтожением измененных, "сломанных" клеточных компонентов. В этом случае лизосомы выполняют роль внутриклеточных чистильщиков, контролирующих дефектные структуры. Такой автофагии подвергаются митохондрии печени, где время жизни отдельной митохондрии составляет 10 дней. Интересно, что в нормальных условиях число аутофагосом увеличивается при метаболических стрессах ( например, при гормональной индукции активности клеток печени). Значительно возрастает число аутофагосом при различных повреждениях клеток; в этом случае автофагоцитозу могут подвергаться целые зоны внутри клеток.
  Лизосомные патологии
  Увеличение числа лизосом в клетках при патологических процессах - обычное явление. Это наблюдение послужило появлению представления о том, что лизосомы могут играть активную роль при гибели клеток. Однако в большинстве случаев смерти клетки не предшествовало освобождение гидролаз из лизосом. Более того, даже при разрыве мембраны лизосомные гидролазы должны терять свою активность, попадая в цитоплазму с нейтральным значением рН. Ферменты лизосом, несомненно, участвуют в автолизе погибших клеток, но скорее всего это вторичное явление, а не причина гибели самих клеток.
  Существует ряд врожденных заболеваний, которые называют лизосомными "болезнями накопления". Отличительным признаком этих болезней является то, что под световым микроскопом в клетках наблюдается множество вакуолей. Например, при болезни Помпе происходит накопление гликогена в лизосомах, где он не расщепляется из-за отсутствия у таких больных фермента кислой ?-гликозидазы. Многие "болезни накопления" возникают вследствие первичной генной мутации, приводящей к потере активности отдельных ферментов, участвующих в функционировании лизосом.
  Сейчас, к сожалению, известно уже более 25 таких генетических заболеваний, связанных с патологией лизосом.
  Глава 17. Гладкий ретикулум и другие мембранные вакуоли
  Гладкий ЭР представляет собой часть мембранной вакуолярной системы. В морфологическом отношении он также представлен мембранами, образующими мелкие вакуоли и трубки, канальцы, которые могут ветвиться, сливаться друг с другом. В отличие от гранулярного на мембранах гладкого ЭР нет рибосом (рис. 190). Диаметр вакуолей и канальцев гладкого ЭР обычно около 50-100 нм. Выраженность сети из этих мембранных элементов может быть неодинаковой как для различных клеток, так и внутри одной клетки. Большей частью такие гладкие канальцы образуют скопления, или зоны. Так, например, в клетках эпителия кишечника гладкий ЭР локализуется главным образом в апикальной, верхней части клетки, вблизи всасывающей поверхности. В клетках печени зоны гладкого ЭР часто связаны с местами отложения гликогена. Встречаются клетки, где гладкий ЭР занимает большую часть объема цитоплазмы (например, в интерстициальных клетках семенника, в растительных железистых терпеноидогенных клетках).
  Неоднократно была установлена непрерывность перехода между гладкой формой ЭР и гранулярной его формой. Часто можно наблюдать, как цистерна гранулярного ЭР теряет на своей поверхности рибосомы и становится "гладкой" (рис. 191). При этом такой участок цистерны делается неровным, начинает как бы ветвиться, переходя в трубочки и канальцы гладкого ЭР. Этот участок часто называют переходным из-за того, что именно здесь образуются и отделяются транспортные пузырьки, переносящие новосинтезированные белки и липиды к зоне аппарата Гольджи. Гладкий ЭР является вторичным по отношению к гранулярному ЭР, происходит из последнего. Так, у крысенка перед рождением в печеночных клетках образуется большое количество гранулярного ЭР, но сразу после рождения появляется масса трубочек гладкого ЭР. Ряд биохимических, морфологических и авторадиографических данных приводит к заключению, что гранулярный ЭР увеличивается в объеме, растет за счет синтезирующихся мембран, которые остаются в его составе или, потеряв рибосомы, превращается в гладкий ЭР. Например, при использовании радиоактивных предшественников мембранных компонентов и при получении отдельных фракций гладкого и гранулярного ЭР было обнаружено, что при интенсивном разрастании гладкого ЭР метка вначале появляется в гранулярном ЭР и только спустя некоторое время - в гладком ЭР.
  Несмотря на топографическую связь и общность происхождения, эти два представителя ЭР резко отличаются друг от друга в функциональном отношении. Как уже указывалось, отсутствие рибосом на гладком ЭР прямо говорит о его непричастности к синтезу белков. Деятельность гладкого ЭР скорее можно связать с метаболизмом липидов и некоторых внутриклеточных полисахаридов.
  Участие гладкого ЭР в синтезе триглицеридов и липидов было показано при изучении процессов всасывания жиров клетками кишечного эпителия. В просвете кишечника жиры распадаются до жирных кислот и моноглицеридов. В апикальных участках клеток кишечника видно при этом накопление осмиофильных гранул внутри просветов канальцев гладкого ЭР. Это связано с ресинтезом новых триглицеридов из поступивших в клетку предшественников, с образованием липидов и липопротеидов, которые с помощью вакуолей аппарата Гольджи выводятся из клеток и попадают в лимфатическое русло.
  Мелкие капли липидов иногда в комплексе с белками можно наблюдать и в клетках печени, причем эти капли встречаются в полостях гладкого ЭР около зоны аппарата Гольджи. Если крысам давать вещества, приводящие к образованию отложений больших капель жира (жировая дистрофия), то первые мелкие липидные капельки появляются в гладком ЭР, но иногда и в полостях гранулярного ЭР.
  Гладкий ЭР особенно в большом объеме встречается в клетках, секретирующих стероиды, в таких, как клетки коркового вещества надпочечника. Основные ферменты синтеза стероидов были обнаружены во фракциях микросом, образовавшихся при разрушении гладкого ЭР из этих клеток. Гладким ретикулумом богаты интерстициальные клетки семенников, участвующие в синтезе стероидных гормонов, а также клетки сальных желез в самом начале накопления жира.
  Тесная топографическая связь гладкого ЭР с отложениями гликогена (запасного внутриклеточного полисахарида животных и грибов) в гиалоплазме различных клеток показывает на значение этой связи с метаболизмом углеводов. В клетках печени, в мышечных волокнах гликоген откладывается в зонах, свободных от гранулярных цистерн ЭР, но богатых пузырьками и канальцами гладкого ЭР. Такие зоны гладкого ЭР могут увеличиваться в размере как при исчезновении гликогена (например, при голодании), так и при увеличении его отложений (рис. 192,193).
  В печени часто увеличение зон гладкого ЭР связано с рядом патологических процессов в клетках. Так, при барбитуратных отравлениях, при действии различных канцерогенов или ядовитых веществ, при действии больших доз гормональных препаратов клетки печени теряют свою характерную для них базофилию цитоплазмы, в них падает содержание РНК и появляются в цитоплазме оксифильные зоны. В электронном микроскопе эти зоны представлены скоплениями гладкого ЭР, это явление связано с тем, что в этих местах происходят процессы деградации различных вредных веществ, процессы метаболической дезактивации, которые осуществляются целым рядом окислительных ферментов, из которых наиболее известен белок, называемый цитохром Р450. Этот белок участвует в присоединении гидроксильной группы к различным, потенциально опасным водонерастворимым углеводородам или к липофильным ядовитым веществам (например, четыреххлористый углерод), попадающим в мембранный бислой. Здесь же другие ферменты добавляют к этим гидроксильным группам отрицательно заряженные молекулы (сульфат, глюкуроновая кислота), что делает метаболиты или вредные липофильные вещества растворимыми в воде, из-за чего они могут выводиться из организма вместе с мочой. Разросшийся гладкий ЭР в клетках печени после удаления токсического вещества уничтожается, вероятно, с помощью лизосом - автофагосом.
  В поперечнополосатых мышцах вакуоли и каналы гладкого ЭР (саркоплазматический ретикулум) окружают каждую миофибриллу (рис. 194). Здесь ЭР выполняет специальную функцию депонирования ионов кальция. В присутствии АТФ он может активно поглощать и накапливать ионы кальция, что приводит к расслаблении, мышечного волокна. Белки кальциевого насоса являются интегральными белками мембран саркоплазматического ретикулума.
  Среди высших растений гладкий ретикулум встречается в клетках тканей, участвующих в синтезе и транспорте терпенов, стероидов, липидов.
  Вакуоли растительных клеток.
  Клетки как низших, так и высших растительных организмов содержат в цитоплазме вакуоли, несущие ряд важных физиологических нагрузок (рис. 195).
  У молодых клеток может быть несколько мелких вакуолей, которые по мере роста и дифференцировки клетки сливаются друг с другом и образуют одну или несколько крупных вакуолей, занимающих до 90% объема всей клетки. Центральные вакуоли отделены от цитоплазмы одинарной мембраной, сходной по толщине с плазмалеммой. Мембрана, ограничивающая центральные вакуоли, носит название тонопласта. Возникают центральные вакуоли из мелких пузырьков, отщепившихся от аппарата Гольджи. Такие первичные вакуоли растут в объеме, сливаются друг с другом и в конце концов образуют одну или несколько крупных вакуолей, оттесняющих цитоплазму с ядром и органоидами к периферии клетки. Полость вакуоли заполнена так называемым клеточным соком, представляющим собой водный раствор, в который входят различные неорганические соли, сахара, органические кислоты и их соли и другие низкомолекулярные соединения, а также некоторые высокомолекулярные вещества (например, белки).
  Центральные вакуоли растений выполняют многообразные и важные функции. Одной из главных ее функций является поддержание тургорного давления клеток. Растворенные в соке вакуолей молекулы определяют его осмотическую концентрацию. Соответствующая молекулярная концентрация сока вакуолей и полупроницаемые свойства как ее мембраны, тонопласта, так и плазмалеммы способствуют тому, что вакуоль функционирует в качестве осмометра и придает клетке необходимую прочность и тургисцентность (напряженность).
  Другая функция определяется тем, что вакуоль представляет собой большую полость, отделенную от метаболирующей гиалоплазмы мембраной, тонопластом, обладающим свойствами полупроницаемости и через котрый может происходить, как и через плазматическую мембрану, активный транспорт различных молекул. В тонопласте обнаружен АТФ-зависимый Н+-насос, направленный внутрь вакуолей, участвующий в транспорте сахаров. Поэтому вакуоли могут использоваться клетками как накопительные резервуары не только для отложения запасных веществ, но и для выброса метаболитов, для экскреции. Так выводятся, секретируются из клетки все водорастворимые метаболиты. Нерастворимые в воде органические компоненты могут превращаться в растворимые глюкозиды, соединяясь с молекулами сахаров. Перечень экскретируемых в вакуоли метаболитов очень обширен. Это различные алкалоиды (например, никотин, кофеин) и полифенолы. В вакуолях происходит отложение многих глюкозидов, к которым относятся различные пигменты, например антоцианы.
  Из неорганических веществ в вакуолярном соке накапливаются фосфаты калия, натрия, кальция, могут накапливаться соли органических кислот (оксалаты, цитраты и др.). Это придает вакуолярному соку отчетливую кислую реакцию (рН от 2 до 5).
  Таким образом, можно считать, что тонопласт участвует в процессах экскреции.

<< Пред.           стр. 5 (из 7)           След. >>

Список литературы по разделу