<< Пред. стр. 89 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу
испытаниям (3n чашкам); d - среднее значение соответствующего
S
диаметра для контрольной концентрации, полученное в тех же
испытаниях (по 3n чашки).
Величину концентрации С вычисляют как антилогарифм:
U
C = antilg (lg C ).
U U
Для получения активности испытуемого образца величину С
U
умножают на его разведение в опыте - гамма .
U
Пример 1. Пусть n = 1; С3 = 5,0; d = 18,61 и d = 18,44 при
_ S _ U
гамма = 160. Тогда: d = d = 18,44; d = d = 18,61 и lg С =
U U U S S U
0,6990 + (18,44 - 18,61) / 6,532 = 0,6730; С = antilg (0,6730) =
4,710; А = 4,710 х 160 = 754. U
U
Пример 2. Пусть n = 3; С3 = 5,0; d = 18,61; d = 18,3;
S1 S2
d = 18,12; d = 18,44; d = 18,1; d = 18,3 при гамма = 160.
S3 U1 U2 U3 U
Тогда:
_
d = (18,61 + 18,3 + 18,12) / 3 = 18,34;
S
_
d = (18,44 + 18,1 + 18,3) / 3 = 18,28;
U
lg С = 0,6990 + (18,28 - 18,34) / 6,532 = 0,6990 - 0,0092 = 0,6898;
U
C = antilg (0,6898) = 4,896;
U
А = 4,896 х 160 = 783.
U
Поскольку микробиологическое исследование активности
антибиотиков подвержено вариабельности, следует проводить не менее
6 повторных испытаний в разные дни (не менее 2 дней), так как
средняя активность отдельных определений, проведенных в разные
дни, - более надежная величина, чем средняя активность, полученная
в результате такого же количества определений, проведенных
одновременно.
Расчет ошибки определения логарифма концентрации испытуемого
образца в пределах одного опыта приведен в приложении 1 к
настоящей статье. Объединение результатов отдельных опытов
проводят в соответствии с формулами, приведенными в приложении 2
к настоящей статье.
Во всех сомнительных случаях и при определении активности
стандартных образцов должен использоваться только трехдозный
вариант метода диффузии в агар.
Для определения содержания активного вещества во флаконе
активность, найденную в 1 мг, умножают на массу содержимого
флакона, выраженную в миллиграммах. При исследовании раствора,
приготовленного из всего содержимого флакона или ампулы,
активность, найденную в 1 мл этого раствора, умножают на его
объем. В случае необходимости определения содержания активного
вещества в 1 мг испытуемого образца следует величину,
характеризующую содержание активного вещества во флаконе,
разделить на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах.
При определении содержания активного вещества в таблетках или
капсулах их количество, а также подготовка для анализа должны
соответствовать требованиям общих статей ГФ XI издания "Таблетки"
(с. 154) и "Капсулы" (с. 143). В дальнейшем основной раствор
испытуемого образца готовят из расчета 1 мг в 1 мл. После
перемешивания раствору дают отстояться или центрифугируют. Рабочий
раствор испытуемого образца готовят разведением надосадочной
жидкости основного раствора. Для определения содержания активного
вещества в 1 таблетке или капсуле активность 1 мг порошка
растертых таблеток или содержимого капсул умножают на среднюю
массу таблетки или содержимого капсулы, выраженную в миллиграммах.
При исследовании таблеток, покрытых оболочкой, активность
определяют в нескольких растворенных таблетках, количество которых
и растворитель должны быть указаны в частных статьях. Активность,
найденную в 1 мл основного раствора, умножают на его объем и делят
на количество растворенных в этом объеме таблеток.
Выращивание и хранение культур тест - микробов <*>. Все
культуры тест - микробов сохраняют в запаянных пробирках на
соответствующих плотных питательных средах в течение 15-30 сут при
температуре от 4 до 10 град. С, после чего пересеивают на свежую
питательную среду. Тест - микробы можно сохранять и в
лиофилизированном состоянии.
--------------------------------
<*> Штаммы тест - микробов, за исключением Candida utilis
ЛИА-01, применяемые для определения антимикробной активности
антибиотиков, хранятся в музее патогенных и условно патогенных
культур при Государственном научно - исследовательском институте
стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.
Л. А. Тарасевича. Candida utilis ЛИА-01 хранится во Всесоюзном
научно - исследовательском технологическом институте антибиотиков
и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ).
Для характеристики культурных свойств микроорганизмов (см.
табл. 18) производится их высев в пробирки с мясо - пептонным
бульоном (МПБ), затем через 18-20 ч инкубации при температуре (36
+/-1) град. С культуры высеивают на чашки Петри с плотной средой
для выделения типичных колоний, которые затем пересевают на
соответствующие питательные среды для получения в дальнейшем
взвесей вегетативных клеток или спор. Взвесь хранят в запаянных
стеклянных пробирках при температуре от 4 до 10 град. С в течение
определенного срока.
В полученной взвеси определяют концентрацию клеток (спор) по
оптическому стандарту мутности <*> или нефелометрически (основная
взвесь). Из этой взвеси по мере надобности готовят рабочую взвесь
в соответствии с посевной дозой, предусмотренной для каждого
тест - микроба (см. табл. 17).
--------------------------------
<*> Оптические стандарты мутности и инструкция по их
использованию выпускаются и рассылаются Государственным научно -
исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.
Культуру тест - микроба Staphylococcus aureus 209P высевают на
чашки Петри со средой N 1 и после выращивания в течение 18-20 ч
при (364 +/-1) град. С оставляют при комнатной температуре на 24 ч
для наблюдения за образованием пигмента. Отбирают типичные колонии
и пересевают их в пробирки со скошенным агаром того же состава.
Для определения активности используют взвесь 18-20-часовой
культуры стафилококка, выращенной в пробирке на скошенном агаре.
Возможно также применение в течение длительного времени взвеси
культуры, полученной следующим образом: культуру выращивают в
течение 18-20 ч на скошенном агаре в пробирке, смывают ее 5-10 мл
стерильного раствора хлорида натрия изотонического 0,9%.
Полученной взвесью засевают матрац с 300 мл среды N 1 (со
скошенной поверхностью), выращивают в течение 2 сут [сутки при
(36 +/-1) град. С и сутки при комнатной температуре], смывают
примерно 50 мл стерильного раствора хлорида натрия изотонического
0,9%. Взвесь культуры можно хранить в запаянных пробирках в
течение 5-7 нед при температуре от 4 до 10 град. С.
Культуру тест - микроба Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617
гладкая форма) выращивают так же, как указано для Staphylococcus
aureus 209P, за исключением времени инкубации, которое составляет
для Bordetella bronchiseptica 30-36 ч. Посевным материалом служит
культура, выращенная в пробирках со скошенным агаром и хранящаяся
при температуре от 4 до 10 град. С не более 2 нед. Для длительного
применения взвеси клеток культуру смывают с питательной среды 5-10
мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9%,
засевают матрац со средой N 1 (со скошенной поверхностью) и далее
поступают так же, как при подготовке культуры Staphylococcus
aureus 209P. Взвесь клеток Bordetella bronchiseptica ATCC 4617
может храниться в течение 7 сут.
Культуру тест - микроба Pseudomonas aeruginosa N CTC 2134
выращивают на чашках Петри со средой N 1 в течение 18-20 ч при
температуре (36 +/-1) град. С, отбирают типичные колонии,
пересевают их на мясо - пептонный бульон рН от 7,2 до 7,4 и
выращивают в вышеуказанных условиях. Полученная культура служит
посевным материалом для приготовления суточной культуры,
используемой при определении активности в каждом конкретном опыте,
и может храниться в течение 30 сут при температуре от 4 до 10
град. С.
Культуру тест - микроба Candida utilis ЛИА-01 выращивают на
чашках Петри со средой N 3 в течение 48 ч при температуре (30
+/-1) град. С, отбирают типичные колонии, пересевают их в пробирки
со скошенным агаром того же состава и выращивают в указанных выше
условиях. Полученная культура служит посевным материалом для
приготовления взвеси клеток, применяемой в течение длительного
времени. Для этого культуру с поверхности среды смывают 5-10 мл
стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9% и засевают
матрац с 300 мл среды N 3 (со скошенной поверхностью). Через 2 сут
культуру смывают 50 мл стерильного раствора натрия хлорида
изотонического 0,9%. По мере надобности готовят рабочую взвесь,
густота которой должна быть такой, чтобы при разведении ее в 30
раз 0,9% раствором натрия хлорида изотонического оптическая
плотность составляла 0,22-0,23. Для определения густоты взвеси
используют нефелометр с нейтральным светофильтром и кюветы с
толщиной слоя 3 мм. Рабочая взвесь может храниться в течение 30
сут.
При использовании спорообразующих культур тест - микробов
процесс выращивания на чашках Петри, отбор типичных колоний,
пересев на пробирки со скошенным агаром и на матрацы осуществляют
так же, как указано для Staphylococcus aureus 209P.
Для выращивания культур тест - микробов Вас. subtilis, var. Л2
и Вас. pumilus N CTC 8241 на чашках Петри и пробирках используют
среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 4; для
выращивания культур тест - микробов Вас. cereus, var. mycoides HB
и Вас. subtilis ATCC 6633 на чашках Петри и пробирках используют
среду N 1, при выращивании на матрацах - среду N 5; для
выращивания культуры тест - микроба Вас. cereus, var. mycoides 537
на чашках Петри и на пробирках используют среду N 2, при
выращивании на матрацах - среду N 4.
Для получения взвеси спор культуру, выращенную в пробирках,
смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического
0,9%, засевают ею несколько матрацев с 300 мл питательной среды
(со скошенной поверхностью) и выращивают в течение 5-7 сут. В
процессе выращивания периодически производят микроскопический
контроль культуры, и если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в
поле зрения 80-90% спор, производят смыв стерильной
дистиллированной водой.
Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70
град. С в течение 30 мин. Затем промывают стерильной
дистиллированной водой при центрифугировании до полной
прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор вновь
прогревают в течение 30 мин при температуре от 60 до 70 град. С.
Взвесь спор хранят в запаянных стеклянных пробирках при
температуре от 4 до 10 град. С и используют до тех пор, пока
интенсивность роста и четкость зон при определении антимикробной
активности препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям.
Для заражения питательных сред допускается использование
лиофилизированных тест - культур с точно известным содержанием
количества микробных клеток (спор) в ампуле, которые после
суспендирования в соответствующем растворителе (растворе натрия
хлорида изотонического 0,9% или дистиллированной воде) вносят в
питательную среду без предварительного пересева.
Питательные среды и буферные растворы. В табл. 19 представлен
состав сред, используемых при определении активности антибиотиков.
Для приготовления сред N 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16
применяют ферментативный гидролизат биомассы микроорганизмов без
оболочек. Методика приготовления состоит в следующем: 5 г сухого
ферментативного гидролизата размешивают в 1 л дистиллированной
воды, прибавляют агар - агар, расплавленный в открытом котле или
автоклаве текучим паром или под давлением 0,05 МПа и температуре
(111 +/- 1) град. С в течение 30 мин. В случае необходимости в
среду прибавляют соли в количестве, указанном в прописи сред; рН
сред определяют потенциометрически со стеклянными электродами или
колориметрически. Реакцию среды (рН) корригируют
хлористоводородной кислотой или раствором едкого натрия.
Готовые среды разливают в соответствующую посуду и стерилизуют
в автоклаве при 0,1 МПа и температуре (120 +/- 1) град. С в
течение 15 мин.
Таблица 19
Состав питательных сред для выращивания
тест - культур, получения спор и
определения активности антибиотиков
-------------------------------------------------------------------
| | Номера сред |
| Ингредиенты |------------------------------------------------|
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|-----------------------------------------------------------------|
| Содержание каждого ингредиента |
|-----------------------------------------------------------------|
|Мясо - пептонный|1000 мл|1000 мл|1000 мл| 5 г | 5 г | 5 г |
|бульон 1:2 | | | | | | |
|Ферментативный | | | | | | |
|гидролизат био-| | | | | | |
|массы микроорга-| | | | | | |
|низмов без обо-| | | | | | |
|лочек | | | | | | |
|Агар - агар | 20 г | 20 г | 17 г | 25 г | 25 г | 10-15 г|
|Глюкоза | | | 10 г | | | |
|Натрия фосфат | | | | | | |
|двузамещенный | | | | | | |
|Калия фосфат | | | | | | |
|однозамещенный | | | | | | |
|Натрия хлорид | | | 5 г | | | |
|Калия хлорид | | | | | | |
|Мочевина | | | | | | |
|Аммония цитрат | | | | | | |
|двузамещенный | | | | | | |
|Аммония хлорид | | | | | | |
|Вода | | | | | | |
|дистиллированная| | | |1000 мл|1000 мл|1000 мл |
|рН после | | | | | | |
|стеризации |7,0-7,2|7,8-8,0|7,0-7,2|6,0-6,2|7,8-8,0|6,8-7,0 |
-------------------------------------------------------------------
Продолжение
-------------------------------------------------------------------
| | Номера сред |
| Ингредиенты |------------------------------------------------|
| | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
|-----------------------------------------------------------------|
| Содержание каждого ингредиента |
|-----------------------------------------------------------------|
|Мясо - пептонный| | | | | | |
|бульон 1:2 | | | | | | |
|Ферментативный | 5 г | 5 г | 5 г | 5 г | | |
|гидролизат био-| | | | | | |
|массы микроорга-| | | | | | |
|низмов без обо-| | | | | | |
|лочек | | | | | | |
|Агар - агар |10-12г |10-12г | 15 г |10-15г |15-20 г|15-20 г |
|Глюкоза | | | | | | |
|Натрия фосфат | 3 г | 3 г | 3 г | | 3 г | 3 г |
|двузамещенный | | | | | | |
|Калия фосфат | | | | 25 г | | |
|однозамещенный | | | | | | |
|Натрия хлорид | | | | | | |
|Калия хлорид | | | | | | |
|Мочевина | | | | | | |
|Аммония цитрат | | | | | | |
|двузамещенный | | | | | | |
|Аммония хлорид | | | | | | |
|Вода |1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл |
|дистиллированная| | | | | | |
|рН после |6,8-7,0|7,8-8,0|7,8-8,0|6,0-6,2|6,8-7,0|7,8-8,0 |
|стерилизации | | | | | | |
-------------------------------------------------------------------
Продолжение
-------------------------------------------------------------------
<< Пред. стр. 89 (из 116) След. >>
Список литературы по разделу