<< Пред. стр. 14 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу
+Н2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направ-
лении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.
Цетавлон
Цетилтриметиламмонийбромид (цетавлон) - положительно
заряженный ионный детергент. Как известно, ДДС-Na раство-
ряет не все щелочные белки, зато хорошо растворяет нуклеино-
вые кислоты, которые могут создавать помехи при электрофоре-
зе белков, входящих в состав нуклеопротеидов. Паним и соавто-
ры предложили заменить ДДС-Na на цетавлон [Panyim et al.,
1977]. Как и ДДС-Na, цетавлон способствует растворению бел-
ков за счет связывания с гидрофобными участками полипепти-
дов. Благодаря электростатическому отталкиванию положитель-
но заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи рас-
прямляются и приобретают жесткость. Комплекс белка с цетав-
лоном, особенно в кислой среде, заряжен заведомо положитель-
но. Вместе с тем цетавлон взаимодействует с нуклеиновыми
кислотами как "жирный катион" и осаждает их из, раствора.
Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаи-
модействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает
в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при
слегка повышенной температуре (37°), в термостате. Кроме то-
го, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окра-
шивание геля ведут при температуре 80-100°.
85
Паним и соавторы для разделения смеси стандартных белков использова-
ли 10%-ный ПААГ (С=1,5), полимеризованный в 0,09 М Na-ацетатном буфе-
ре (рН 4,6) с 0,09% цетавлона. Примерно таким же буфером заполняли элек-
тродные резервуары. Исходный препарат готовили, растворяя белки до кон-
центрации 0,25-0,5 мг/мл в 0,0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,6) с 0,5%
цетавлона и 1% р-меркаптоэтанола. Назначение последнего - такое же, как
при обработке белков ДДС-Na. Белковый раствор кипятили 5 мин или инку-
бировали 2 ч при 37°, а затем добавляли мочевину до концентрации 6 М. На
трубку (10x0,6 см) вносили 20 мкл раствора препарата (5-10 мкг белка).
Электрофорез вели при силе тока 8-10 мА на гель и напряженности поля
8-10 В/см. В качестве лидирующего красителя использовали 0,05%-ный рас-
твор Azure А. Белки окрашивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной
уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение 30-60 мин при тем-
пературе 80-100°. Отмывали излишек красителя в 0,9 М уксусной кислоте
при той же температуре.
Как и при электрофорезе с ДДС-Na, в случае обработки це-
тавлоном также наблюдается линейная зависимость между ло-
гарифмом молекулярной массы белка и расстоянием его мигра-
ции в геле. Пользуясь этой зависимостью, удается оценивать
молекулярные массы белков в интервале 15-90 тыс. дальтон.
Эли и соавторы недавно предложили модификацию описан-
ной выше системы [Ely et al., 1979J. Они заменили персульфат
аммония на флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве инициа-
тора полимеризации, которая идет при освещении (ФМН рас-
творим лучше, чем рибофлавин). Это снимает проблему осаж-
дения цетавлона при полимеризации геля.
В качестве рабочего буфера геля использовали U,l М Na-фосфат (рН'7)
с 0,l% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали
в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфере, но содержащем
0,5% цетавлона и 10-15% р-меркаптоэтанола. Лидирующий краситель-
малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на
трубку (10x0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-
ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,5%-ным раствором
СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 4'5% этанола, в течение
10ч.
Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциа-
ции белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением
ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с це-
тавлоном. При низких значениях рН связывание цетавлона с ги-
стонами и негистоновыми белками хроматина носит избиратель-
ный характер, что способствует их электрофоретическому раз-
делению.
Фракционирование белков по степени их гидрофобности мож-
но преобразовать в разделение по заряду с помощью следующе-
го приема [Helenius, Simons, 1977]. Для исключения роли раз-
меров белков электрофорез ведут в 1%-ной агарозе, растворен-
ной в 0,05 М глициновом буфере с 0,1 М NaCI и 0,5% Тритона
86
Рис. 27. Обнаружение гидрофобных белков двумерным электрофорезом "со
сдвигом заряда" [Bhakdi et al., 1977]
А - без дополнительных детергентов; Б - с добавлением ДОХ; В-с добавлением це-
тавлона
Х-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дез-
оксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует
мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками бел-
ка в количестве, пропорциональному размеру этих участков.
Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешан-
ные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответ-
ственно положительный или отрицательный заряд, существенно
превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе
белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и вели-
чиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать "элек-
трофорезом со сдвигом заряда". Необычное введение в буфер
геля 0,1 М NaCl по-видимому, способствует как растворимости
белков, так и образованию, мицелл. Напряженность поля при
этом приходится снижать до 4,5 В/см.
Аналогичный подход был использован для обнаружения гид-
рофобных белков в двумерном варианте электрофореза [Bhakdi
et al., 1977]. Разделение белков в первом направлении (I) вели
в 1%-ной агарозе с 0,5% Тритона Х-100. Вырезали полоску, пе-
реносили ее в форму, куда заливали такой же раствор агарозы,
но с добавлением цетавлона или ДОХ. После электрофореза во
втором направлении (II) все гидрофильные белки ложились на
диагонально расположенную прямую, а гидрофобные выпадали
из нее (рис. 27).
Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном
Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавло-
ном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам
выявить значительное число дополнительных фракций при раз-
делении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направ-
лениях использовалась система ступенчатого электрофореза
(3,3%-ный ПААГ-формирующий, 15 %-ный- рабочий). По-
лимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в пер-
вом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При
этом отпадала необходимость вести электрофорез во втором на-
87
правлении немедленно по окончании первого разделения И обе-
спечивалась возможность оценить качество последнего. Цетав-
лон, который вносили в верхний электродный буфер (0,15%),
мигрируя под действием поля через полоску препарата, снова
растворял белки и освобождал их от красителя. Во избежание
образования дисульфидных мостиков в раствор красителя для
геля первого направления добавляли до 0,1% цистамина. Для
предупреждения фотоокисления гистонов гели держали вдали
от яркого света [Bonner et al., 1980].
В заключение отметим, что при электрофорезе мембранных
липопротеидов главная проблема связана с их растворением.
Даже в 1%-ном ДДС-Na при 100° не удается добиться надеж-
ного растворения. Между тем липопротеиды хорошо растворя-
ются в смеси 6 г глицина и 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты.
Электрофорез можно вести в 13 М НСООН (50%). Для этого
полимеризуют гель в воде, потом его вынимают, вымачивают в
13 М НСООН и с каплей глицерина вставляют в трубку, диа-
метр которой на 0,1-0,2 мм больше, чем у той, которая исполь-
зовалась при полимеризации. В ней и ведут электрофорез [Mok-
rasch, 1978]. В другом варианте электрофореза водонераствори-
мых белков в качестве рабочего буфера геля использовали смесь
фенола, этиленгликоля и воды в соотношении 3:2:3 (масса/объ-
ем/объем). Мономерный акриламид реагирует с фенолом, по-
этому полимеризацию ПААГ в пластинах проводили опять-таки
в водной среде, которую затем путем вымачивания геля заменя-
ли описанной выше смесью [Pusztai, Watt, 1973].
ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ
Обнаружение и локализацию белковых зон после их разде-
ления электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуще-
ствляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как ок-
рашенные полоски или пятна различной интенсивности, в
зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вы-
мачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь
него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как
правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания
полос за это время белки иногда предварительно фиксируют
осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или
50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию сов-
мещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси
уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.
Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам
гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера ге-
ля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции
его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно
менее прочно, чем с белками, поэтому от "фона" удается без
особого труда избавиться "отмывкой" геля, например вымачи-
ванием его в относительно большом объеме растворителя с не-
88
сколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффу-
зии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее
ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных
белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто .в
смеси с метанолом, который улучшает растворимость красите-
ля. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37-
50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опас-
ность ослабления окраски полос.
Все типы обычно используемых красителей для белков несут
на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому от-
Рис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей [Shortess, 1974]
мывку геля можно еще ускорить, если в растворителе суспенди-
ровать немного ионообменной смолы, связывающей краситель
и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто исполь-
зуют для этой цели смолу смешанного типа AG 501х8.
Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков ми-
нут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле
накладывают на гель в поперечном направлении - перпенди-
кулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с
белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро
выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специ-
альный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электро-
фореза. Такие приборы ("дестейнеры") имеются в продаже, но
их легко изготовить и в лаборатории.
Простое устройство для этой цели описано и схематически
изображено на рис. 28 [Shortess, 1974]. На пластинку из нержа-
веющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смо-
ченного 10%-ным раствором уксусной кислоты. Его помещают в
ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже
верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля
кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смочен-
ной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюми-
ниевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом.
К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от
источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфора-
ции в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Че-
рез пластину геля размером 12х7х0,3 см нужно пропускать
ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15-20 мин. Находящиеся в
89
осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непро-
должительном поперечном электрофорезе остаются на своих ме-
стах в геле.
До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Если
в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологи-
ческой активности, то их локализацию в геле можно осуществить
с помощью специфической ферментативной реакции или цепи
реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вы-
мачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется,
фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и прихо-
дится мириться с некоторым размыванием белковых полос.
Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффунди-
руют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красите-
лей, и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.
Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миг-
рацией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную
смесь белков можно окрасить красителем "Remazol" [Griffith,
1972], который ковалентно связывается с белком и мигрирует
вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в
присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг бел-
ка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCI с 0,2 М NazHPt^ и 10%
ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогре-
вают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного кра-
сителя белок переосаждают ацетоном.
Чувствительность окрашивания белков многократно увеличи-
вается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных
красителей. Многие из них связываются с белками или пептида-
ми, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно
использовать для наблюдения за ходом электрофореза после
предварительной обработки исходного препарата.
Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные
марки красителей и особенности их применения.
Кислые красители
Исторически для окраски белков в геле были прежде всего
использованы давно апробированные промышленные красители
для шерсти - сложные молекулы с несколькими ароматически-
ми кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодей-
ствия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначаль-
ное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия суль-
фогрупп красителей с положительно заряженными аминокислот-
ными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется
ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофоб-
ными связями.
Как уже упоминалось, для фиксации белковых полос окра-
шивание ведут в кислой среде. Какой бы буфер ни использовал-
ся при электрофорезе, к моменту окрашивания он замещается
на довольно крепкий раствор (10% и более) уксусной кислоты
90
или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказы-
вается положительным за счет остатков лизина, аргинина и ги-
стидина, так что для белков используются преимущественно кис-
лые красители, несущие остатки сульфокислоты. Они сохраняют
свой отрицательный заряд и при низких значениях рН.
В прошлом десятилетии широко использовали "амидо-
шварц"-краситель с фирменным названием "Amido Black 10B"
(сейчас его выпускают под названием "Naphthalene Black 12B").
Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксус-
ной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краси-
тель-кумасси ярко-голубой ("Coomassie brilliant blue", сокра-
щенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствитель-
ность и линейную зависимость интенсивности окраски от концент-
рации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпус-
кают в двух модификациях: R-250 и G-250. Здесь для ориенти-
ровки приведена структурная формула второго из них. Структура
СВВ R-250 отличается только отсутствием двух метальных групп.
Фирма BDH сейчас выпускает эти красители под названиями
"PAGE blue 83" и "PAGE blue G-90" соответственно.
Кумасси G-250
Обилие ароматических колец в структуре красителей типа
СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в раз-
бавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к
кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные
растворы, содержащие 9-10% уксусной кислоты и 40-45% ме-
танола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-250 в
этой смеси составляет 0,1-0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250
растворяют в 25%-, 50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей
10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное-вода). Возможны
и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель дол-
жен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждаю-
щем белок. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать.
Их наличие не. говорит о плохом выборе растворителя, так как
91
Препараты красителя, изготавливаемые для промышленных це-
лей, редко бывают чистыми.
Продолжительность окрашивания зависит от толщины и по-
ристости геля и может варьировать от 2-3 до 12 ч. Для ускоре-
<< Пред. стр. 14 (из 19) След. >>
Список литературы по разделу